專利名稱：D-乳酸診斷/測(cè)定試劑盒及d-乳酸的濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有D-乳酸特異性的D-乳酸診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí) 本發(fā)明還涉及測(cè)定D-乳酸濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
L-乳酸是近年來(lái)人們十分關(guān)注并發(fā)展較快的有機(jī)酸。同時(shí)L-乳酸具有 在食品、飼料、醫(yī)藥、塑料、飼料、農(nóng)藥、日用化工、造紙及電子工業(yè)等 多領(lǐng)域應(yīng)用前景。
L-乳酸是大多數(shù)生物體代謝作用的終產(chǎn)物。僅少數(shù)微生物(例乳酸菌屬、 明串珠菌屬)能形成D-乳酸。生產(chǎn)酸奶時(shí)非常注意檢測(cè)乳酸鹽，以評(píng)估微 生物是否產(chǎn)生L-乳酸，D-乳酸或二者兼有。若有D-乳酸存在，則可能是微 生物造成了污染。
乳酸鹽濃度的異常升高與多種疾病如糖尿病、酸毒癥等疾病有密切的關(guān) 系。L(+)-Lactate是人體中乳酸鹽代謝的主要中間產(chǎn)物，并且存在于血液 中。D(-)-Lactate也存在，但含量很低，只有L(+)-Lactate的卜5%。
血乳酸測(cè)試作為一個(gè)監(jiān)護(hù)、監(jiān)測(cè)運(yùn)動(dòng)員訓(xùn)練能力的手段，把血乳酸值作 為衡量運(yùn)動(dòng)員有氧耐力水平、無(wú)氧訓(xùn)練能力、身體疲勞恢復(fù)等方面的一個(gè) 重要數(shù)據(jù)，供安排訓(xùn)練時(shí)參考。
酶法分析是國(guó)際上公認(rèn)的分析方法，已被多個(gè)國(guó)際權(quán)威組織或機(jī)構(gòu)采 納如IFU (國(guó)際果汁生產(chǎn)者協(xié)會(huì)),AIJN (歐盟果蔬汁及飲料生產(chǎn)者聯(lián)盟),及MEBAK, OICC, VDLUFA等組織廣為推崇，并確定為標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用具有D-乳酸特異性的酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，計(jì)量/連續(xù)監(jiān)測(cè)還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸 光度的變化，得以測(cè)定D-乳酸濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí) 現(xiàn)該方法的D-乳酸診斷/測(cè)定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光 分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行D-乳酸濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、 準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明D-乳酸濃度測(cè)定方法原理如下D-乳酸+ 2高鐵細(xì)胞色素cD-乳酸脫氫酶丙酮酸+2亞鐵細(xì)胞色素c 丙酮酸+輔酶八+輔酶丙酮酸脫氫酶二氧化碳+乙酰輔酶八+還原型輔酶 這種方法應(yīng)用具有D-乳酸特異性的D-乳酸脫氫酶(D-Lactate dehydrogenases; EC 1.1.2.4; EC 1.1.2.5)偶聯(lián)丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase ; EC1.2丄51)酶促反應(yīng)速率比色法/終點(diǎn)法。D-乳酸脫氫酶 酶解D-乳酸反應(yīng)產(chǎn)生丙酮酸，再通過偶聯(lián)丙酮酸脫氫酶的作用，最終將輔 酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)， 從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度/速度，通過測(cè)量 340nm處吸光度上升的程度/速度，可以測(cè)算D-乳酸的濃度大小。實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明D-乳酸診斷/測(cè)定試劑
盒較為理想
緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 500 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
輔酶A 5 mmol/L
2高鐵細(xì)胞色素c 10 mmol/L
D-乳酸脫氫酶 12000 U/L
丙酮酸脫氫酶 12000 U/L
本發(fā)明的D-乳酸診斷/測(cè)定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、輔酶A、 2高鐵細(xì)胞色素c、 D-乳酸脫氫酶、 丙酮酸脫氫酶。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體 試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑l
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、輔酶A、 2高鐵細(xì)胞色素c。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、D-乳酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶。 輔酶、輔酶A、 2高鐵細(xì)胞色素c、 D-乳酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶在試 劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水 溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、輔酶A、 2高鐵細(xì)胞色素C。試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸脫氫酶。試劑3緩沖液、穩(wěn)定劑、D-乳酸脫氫酶。輔酶、輔酶A、 2高鐵細(xì)胞色素c、 D-乳酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶在試 劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使 用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定D-乳酸濃度的方法，其輔酶 可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。 實(shí)施例一本實(shí)施例的D-乳酸診斷/測(cè)定試劑為單試劑，包括三(羧甲基)氨基甲垸—鹽酸緩沖液 10Ommol/L穩(wěn)定劑 500 mmol/L輔酶 3 mmol/L輔酶A 5 mmol/L2高鐵細(xì)胞色素c 10 mmol/LD-乳酸脫氫酶 12000 U/L丙酮酸脫氫酶 12000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用
前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37X:，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光
度《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)D-乳酸樣品與試
劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0
分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析
儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度/速度，從而測(cè)算出D-乳酸的
濃度大小。
實(shí)施例二
本實(shí)施例的D-乳酸診斷/測(cè)定試劑為雙試劑，包括
試劑l
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
輔酶
輔酶A
2高鐵細(xì)胞色素c
100 mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 5 mmol/L 10 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
D-乳酸脫氫酶
100mmol/L 500 mmol/L 12000U/L丙酮酸脫氫酶 12000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37-C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)D-乳酸樣品與試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約O分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度/速度，從而測(cè)算出D-乳酸的濃度大小。實(shí)施例三本實(shí)施例的D-乳酸診斷/測(cè)定試劑為三試劑，包括 試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑輔酶A2高鐵細(xì)胞色素c100 mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 5 mmol/L 10 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑丙酮酸脫氫酶100 mmol/L 500 mmol/L 12000U/L試劑3三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
D-乳酸脫氫酶 12000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測(cè)定D-乳酸濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37-C，反應(yīng)時(shí) 間10分鐘，起始吸光度《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm， 被測(cè)D-乳酸樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方 向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析 儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度/速度，從而測(cè)算出D-乳酸的 濃度大小。
申請(qǐng)人經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原型色 原體組合均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類同， 不另一一例舉。
總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過一般生化分析儀 器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種具有D-乳酸特異性的酶比色法及酶聯(lián)法的D-乳酸的濃度測(cè)定方法，其方法原理如下D-乳酸+2高鐵細(xì)胞色素c D-乳酸脫氫酶丙酮酸+ 2亞鐵細(xì)胞色素c丙酮酸+輔酶A+輔酶丙酮酸脫氫酶二氧化碳+ 乙酰輔酶A+還原型輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度/速度，測(cè)算出D-乳酸的濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種D-乳酸診斷/測(cè)定試劑盒，主要成分包括:緩沖液20--500 mmol/L穩(wěn)定劑1-4000 mmol/L輔酶A1－6 mmol/L 2高鐵細(xì)胞色素c 150 mmol/LD-乳酸脫氫酶1000——80000 U/L丙酮酸脫氫酶1000--80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可 以配制成液體試劑，直接使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述D-乳酸診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、輔酶A、 2高鐵細(xì)胞色素c、 D-乳酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述D-乳酸診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、輔酶A、 2高鐵細(xì)胞色素c、 D-乳酸脫氫酶、 丙酮酸脫氫酶組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、輔酶 A、 2高鐵細(xì)胞色素c組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、D-乳酸脫氫 酶、丙酮酸脫氫酶組成。輔酶、輔酶A、 2高鐵細(xì)胞色素c、 D-乳酸脫 氫酶、丙酮酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述D-乳酸診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、輔酶A、 2高鐵細(xì)胞色素c、 D-乳酸脫氫酶、 丙酮酸脫氫酶組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、輔酶 A、 2高鐵細(xì)胞色素c組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸脫氫 酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、D-乳酸脫氫酶組成。輔酶、輔酶 A、 2高鐵細(xì)胞色素c、 D-乳酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶在試劑l、試劑2 或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述D-乳酸診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn) 定劑1^000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙 二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用具有D-乳酸特異性的酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的D-乳酸診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定D-乳酸濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、輔酶A、2高鐵細(xì)胞色素c、D-乳酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度上升的程度/速度，從而測(cè)算出D-乳酸的濃度大小。
文檔編號(hào)C12Q1/00GK101324557SQ20071002322
公開日2008年12月17日 申請(qǐng)日期2007年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月13日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司