專利名稱：螺原體病原微生物的pcr快速檢測(cè)技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病原微生物的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種螺原體病原微生物的PCR快速檢測(cè)技術(shù)。
背景技術(shù)：
螺原體是20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)的寄生于植物和昆蟲的病原微生物，近年我們?cè)诤有泛托↓埼r體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了此病原微生物，用螺原體16S RNA基因的特異性引物在病蟹和病蝦體內(nèi)擴(kuò)增出271bp條帶，經(jīng)過測(cè)序和在GenBank比對(duì)，確認(rèn)它們均為螺原體類微生物。
目前，常規(guī)的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)過程中，通常采用苯酚法或試劑盒進(jìn)行被檢樣品的DNA提取，這些方法繁瑣、費(fèi)時(shí)，苯酚法需要的樣品量大，DNA損耗多，不適宜微量檢測(cè)及動(dòng)物的活體血液檢測(cè)；試劑盒則成本較高，而且使用范圍較局限，通常一種試劑盒只能針對(duì)一兩種不同來源的樣品進(jìn)行模板提取。此外，現(xiàn)有的病原微生物的PCR檢測(cè)只是能定性，而不能定量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)最新發(fā)現(xiàn)的水產(chǎn)養(yǎng)殖中的重要微生物病原體——螺原體，建立一種簡(jiǎn)易、快速、敏感的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了對(duì)螺原體病原微生物的PCR半定量快速檢測(cè)技術(shù)。
本發(fā)明的技術(shù)方案是
b.用Chelex-100法提取檢測(cè)樣本中的模板DNA；c.用螺原體的16S rDNA特異性引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)；d.擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，出現(xiàn)目標(biāo)電泳條帶即可確定檢測(cè)樣本中有螺原體存在，所說的目標(biāo)電泳條帶是指271bp處。
本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案是，在步驟d后還有步驟e半定量螺原體濃度，具體是將所說的目標(biāo)電泳條帶與不同梯度的稀釋標(biāo)準(zhǔn)樣品的電泳條帶之亮度進(jìn)行比較，得到檢測(cè)樣本的螺原體濃度。
本發(fā)明中所說的檢測(cè)樣本可以是底泥、分離培養(yǎng)的病原菌、寄主組織(包括肌肉、內(nèi)臟組織、血液等)。針對(duì)不同的檢測(cè)樣本，在提取模板DNA前進(jìn)行相應(yīng)的前處理，以達(dá)到洗滌和濃綜縮的目的，能進(jìn)一步提高檢測(cè)效果。
本發(fā)明步驟d中所說的電泳檢測(cè)推薦瓊脂糖電泳或聚丙烯酰胺電泳。
本發(fā)明的有益效果是首先，采用簡(jiǎn)易、敏感的Chelex-100 DNA提取方法，其成本只有常規(guī)提取方法的1/10。其次，該技術(shù)的敏感度極高，可以從活體抽取極其微量的血液進(jìn)行測(cè)定，從而實(shí)現(xiàn)活體檢測(cè)的目的，此外，該技術(shù)還能從蝦蟹棲息的底泥中檢測(cè)出病原體，可檢測(cè)出病原體的最低濃度達(dá)10-8(既每毫升體積中一個(gè)菌)，敏感度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于光鏡和電鏡等技術(shù)。本發(fā)明敏感、便捷、快速，成本低，能在2-4小時(shí)出明確診斷。該發(fā)明不僅可以運(yùn)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中的螺原體病害的快速檢測(cè)，還可以運(yùn)用于任何與螺原體病害相關(guān)的檢疫和檢測(cè)。


圖1是聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)圖；
圖2是瓊脂糖電泳檢測(cè)圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1檢測(cè)環(huán)境底泥2004年7月，在安徽全椒一螃蟹顫抖病爆發(fā)的池塘里采集底泥樣少許，帶回檢測(cè)。具體操作如下a)前處理取約兩藥匙待測(cè)泥樣溶于50mL水中數(shù)小時(shí)，期間攪拌數(shù)次，使徹底混勻→定量濾紙過濾，除去泥樣殘?jiān)鷮V液置于50mL離心管中，12000rpm，4℃，離心1小時(shí)→小心的去掉上清，將底部液體移至1.5mLEppendorf管中→8000rpm 4℃，離心1小時(shí)→小心移去上層液體，留下層約0.1mL于管中；b)模板提取(1)向管中加入5％Chelex-100 150-200μL，劇烈振蕩10秒；(2)56℃水浴20分鐘，期間混勻數(shù)次；(3)取出劇烈振蕩10秒，99℃水浴8分鐘(嚴(yán)格控制)；(4)取出劇烈振蕩10秒后，13000rpm，4℃，離心5分鐘；(5)轉(zhuǎn)移上清(DNA模板)至另一支干凈的Eppendorf管，-20℃保存，盡快擴(kuò)增。
c)用螺原體的16S rDNA特異性引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，反應(yīng)總體積設(shè)為25μL，PCR混合物成分(每管)去離子水14.85μL；STR 10XBuffer 2.5μL(Mg2+，dNTP，等混合物，購(gòu)于Promega公司)；兩種引物混合物2.5μL(濃度為2μmol/L)，Taq DNA Polymerase(0.75u)0.15μL，模板5μL。循環(huán)設(shè)置參數(shù)為96℃，2分鐘→94℃，1分鐘；65℃，1分鐘；72℃，1.5分鐘(30個(gè)循環(huán))→72℃10分鐘；d)聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)有目標(biāo)條帶(271bp)出現(xiàn)，如圖1所示，其中第1道是從泥樣中檢測(cè)出的目標(biāo)條帶(大小271bp)，第2道是實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)的螺原體中擴(kuò)增出的條帶，M、Marker，從上往下依次為350bp，222bp，179bp。檢測(cè)到泥樣里含有顫抖病的致病菌螺原體；和電鏡負(fù)染的結(jié)果一致。
實(shí)施例2檢測(cè)分離培養(yǎng)的病原菌取1mL實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)的螺原體病原菌培養(yǎng)物，稀釋到螺原體濃度為106個(gè)/mL，13000rpm，4℃，離心30分鐘，去上清；模板提取、PCR反應(yīng)同實(shí)施例1、2％瓊脂糖電泳如圖2第6道所示。圖2中M，Marker，從下往上依次為100bp，200bp，300bp，400bp等，螺原體特異性條帶出現(xiàn)在200bp和300bp之間，為271bp。
按上述方法分別檢測(cè)螺原體濃度為104個(gè)/mL、102個(gè)/mL的樣本，結(jié)果分別如圖2第7道和第8道所示。
實(shí)施例3檢測(cè)寄主血液2004年夏天高溫時(shí)，采集患顫抖病的螃蟹數(shù)只，a)前處理活體抽取其血液約10μL，混于少量PBS(pH＝7.0)中，混勻，移入1.5mL Eppendorf管中。
b)模板提取(1)向裝有樣品的管中加入5％Chelex-100 150-200μL，蛋白酶K(終濃度為100μg/mL)混勻；(2)5 6℃水浴1.5-2小時(shí)，期間混勻數(shù)次；(3)取出劇烈振蕩10秒，99℃水浴8分鐘(嚴(yán)格控制)；(4)取出劇烈振蕩10秒，13000rpm，4℃，離心5分鐘；(5)轉(zhuǎn)移上清(DNA模板)至另一支干凈的Eppendorf管，-20℃保存，盡快擴(kuò)增。
c)PCR反應(yīng)同實(shí)施例1，
d)2％瓊脂糖電泳檢測(cè)有目標(biāo)條帶出現(xiàn)，如圖2第1道所示。
e)半定量螺原體濃度如圖1，1道的亮度在6道和7道之間，結(jié)果顯示螺原體濃度約為105個(gè)/mL。和光鏡和電鏡的觀察結(jié)果一致。
利用現(xiàn)在市場(chǎng)上廣泛使用的華舜提取小量組織、細(xì)胞、血液DNA的試劑盒(W6501)，來檢測(cè)相同螃蟹的血液，如圖2中第2道所示，電泳顯示沒有目標(biāo)條帶出現(xiàn)，說明了這種方法的靈敏性不如本專利的方法，且局限性明顯。
實(shí)施例4檢測(cè)寄主肢肌取一只患病的螃蟹附肢肌肉少許，置于1.5mL Eppendorf管中，用剪刀盡量剪碎，模板提取、PCR反應(yīng)、電泳檢測(cè)與實(shí)施例3相同，檢測(cè)到有目標(biāo)條帶出現(xiàn)，如圖2中第3道所示，半定量其螺原體濃度的結(jié)果顯示病原其濃度大約106個(gè)/mL，表明螺原體已侵入肌肉組織，電鏡切片也顯示肌肉組織中含有較多的螺原體。
利用華舜試劑盒(W6501)從相同螃蟹的肢肌中檢測(cè)出的螺原體條帶，如圖2中第4道所示，檢測(cè)濃度和Chelex-100符合。
實(shí)施例5陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)檢測(cè)樣本為健康螃蟹個(gè)體的組織、血液，大腸桿菌，人血液分離的白細(xì)胞，檢測(cè)方法與實(shí)施例3基本相同，結(jié)果均沒有出現(xiàn)目標(biāo)條帶，如圖1中的第5泳道所示。
權(quán)利要求
1.一種螺原體病原微生物的PCR快速檢測(cè)技術(shù)，包括如下步驟b.用Chelex-100法提取檢測(cè)樣本中的模板DNA；c.用螺原體的16S rDNA特異性引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；d.擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，出現(xiàn)目標(biāo)電泳條帶即可確定檢測(cè)樣本中有螺原體存在，所說的目標(biāo)電泳條帶是指271bp處。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所說的螺原體病原微生物的PCR快速檢測(cè)技術(shù)，其特征在于，在步驟d后還有步驟e半定量螺原體濃度，即將步驟e中所說的目標(biāo)電泳條帶與不同梯度的稀釋標(biāo)準(zhǔn)樣品的電泳條帶之亮度進(jìn)行比較，得到檢測(cè)樣本的螺原體濃度。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所說的螺原體病原微生物的PCR快速檢測(cè)技術(shù)，其特征在于，其中所說的檢測(cè)樣本是底泥、分離培養(yǎng)的病原菌、或寄主組織。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一所說的螺原體病原微生物的PCR快速檢測(cè)技術(shù)，其特征在于，在步驟b之前，還有步驟a對(duì)檢測(cè)樣本進(jìn)行洗滌或濃縮的前處理。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所說的螺原體病原微生物的PCR快速檢測(cè)技術(shù)，其特征在于，所說的步驟a是取待測(cè)泥樣溶解均勻后用定量濾紙過濾，將濾液離心，去掉上清，將底部液體移至1.5mL Eppendorf管中離心，移去上層液體，留下層約0.1mL于管中；或活體抽取螃蟹血液10μL，混于少量pH為7.0的PBS中，混勻，移入1.5mL Eppendorf管中；或取螃蟹附肢肌肉少許，用剪刀盡量剪碎，置于1.5mL Eppendorf管中。
全文摘要
本發(fā)明涉及病原微生物的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種螺原體病原微生物的PCR快速檢測(cè)技術(shù)。本發(fā)明方法的步驟是a、用Chelex－100法提取檢測(cè)樣本中的模板DNA；b、用螺原體的16SrDNA特異性引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；c、擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，出現(xiàn)目標(biāo)電泳條帶出現(xiàn)即可確定檢測(cè)樣本中有螺原體存在，所說的目標(biāo)電泳條帶是指271bp處。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明敏感、便捷、快速，成本低，能在2－4小時(shí)出明確診斷，還可進(jìn)一步半定量檢測(cè)。本發(fā)明不僅可以運(yùn)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中的螺原體病害的快速檢測(cè)，還可以運(yùn)用于任何與螺原體病害相關(guān)的檢疫和檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N27/447GK1733936SQ20051004100
公開日2006年2月15日 申請(qǐng)日期2005年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月13日
發(fā)明者王文, 丁正峰, 顧偉 申請(qǐng)人:南京師范大學(xué)