本發(fā)明涉及檢測領(lǐng)域，具體地，涉及一種快速定量檢測小分子化合物的試劑盒和方法。

背景技術(shù)：

常用的小分子化合物的檢測方法，包括化學(xué)顯色法、免疫層析檢測法、高效液相色譜檢測法(HPLC)和氣質(zhì)聯(lián)用色譜檢測法(GC/MS)法等。其中，化學(xué)顯色法需要大量檢測樣品，而且靈敏度及精密度均不高；后兩者有較高的靈敏度及精密度，但檢測要求高，難以推廣。

免疫層析檢測法(Immunochromatographic test)是80年代興起的一項快速檢測技術(shù)。經(jīng)過多年的發(fā)展，此項技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床診斷，毒品檢測和食品安全等領(lǐng)域。在免疫層析方法中，將小分子物質(zhì)的完全抗原固定于硝酸纖維膜上的檢測區(qū)(固相抗原)，待檢樣品溶液中的小分子物質(zhì)(游離抗原)與固相抗原競爭結(jié)合膠體金或彩色乳膠微球標記的抗小分子物質(zhì)的單克隆抗體(標記抗體)。如果待檢樣品中含有的小分子物質(zhì)，將抑制標記抗體與固定抗原的結(jié)合，抑制在硝酸纖維素膜的檢測區(qū)形成色帶。測定后檢測區(qū)如果形成色帶，則結(jié)果為陰性，待測樣品不含待測小分子物質(zhì)；反之，不形成色帶，則結(jié)果為陽性，檢測樣品含有待測小分子物質(zhì)。由于膠體金或彩色乳膠微球標記檢測是通過肉眼來判別結(jié)果，目前以膠體金或彩色微球標記的檢測方法只能作為一種定性或半定量的檢測。

熒光定量免疫層析技術(shù)，是免疫熒光技術(shù)(Immunofluorescence technique)和傳統(tǒng)免疫層析技術(shù)相結(jié)合發(fā)展創(chuàng)新的一種定量檢測技術(shù)。該技術(shù)以熒光微球作為標記，通過檢測熒光信號實現(xiàn)了檢測結(jié)果的定量。

但是，由于免疫層析檢測的材料中硝酸纖維膜等均會在激發(fā)光作用下發(fā)出不同程度的熒光，同時檢測樣本如血液、尿樣及唾液等均含有蛋白、核酸、糖類均具有熒光效應(yīng)，因此而導(dǎo)致檢測的背景較高，影響檢測結(jié)果的準確性。為克服上述問題，有研究者開發(fā)了時間分辨熒光免疫層析技術(shù)，以消除樣本中的熒 光物質(zhì)、激發(fā)光和膜本身對檢測的干擾。

然而，雖然時間分辨熒光免疫層析有助于提高檢測的準確性，但是由于種種原因，在定量檢測時仍會出現(xiàn)較大的偏差和波動，導(dǎo)致檢測結(jié)果無法滿足實際需要。尤其是對于小分子化合物(如甲基苯丙胺、嗎啡等毒品)，定量檢測結(jié)果的準確性一方面與遏制毒品的行動密切相關(guān)，也是對于罪犯的量刑的重要參考因素。

因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)快速、定量、且準確(偏差小)的檢測小分子化合物的新方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種快速定量檢測小分子化合物的試劑盒和方法。

在本發(fā)明的第一方面，提供了一種用于檢測小分子化合物的試劑盒，所述試劑盒包括：

(a)測試條，所述測試條包括背襯以及位于背襯上的樣品墊、反應(yīng)膜和吸收墊，其中所述反應(yīng)膜上設(shè)置有檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)；以及

(b)第一容器，以及位于所述第一容器內(nèi)且與所述測試條獨立設(shè)置(或放置)的抗體復(fù)合物，其中所述抗體復(fù)合物包含熒光乳膠微粒以及特異性針對小分子化合物的抗體，所述特異性針對小分子化合物的抗體偶聯(lián)于所述熒光乳膠微粒；

其中，所述的檢測區(qū)固定有所述小分子化合物的完全抗原。

在另一優(yōu)選例中，在所述的測試條上，所述樣品墊和反應(yīng)膜是直接相鄰或相接觸的。

在另一優(yōu)選例中，按樣品的液體流動方向，所述的測試條上依次包括樣品墊、反應(yīng)膜、和吸收墊。

在另一優(yōu)選例中，所述測試條由樣品墊、反應(yīng)膜、吸收墊、和背襯構(gòu)成。

在另一優(yōu)選例中，所述的抗體復(fù)合物位于獨立的包裝或容器內(nèi)。

在另一優(yōu)選例中，所述的測試條不設(shè)有結(jié)合區(qū)。

在另一優(yōu)選例中，所述的測試條在未使用時，不含有用于特異性與所述小分子化合物結(jié)合的抗體或所述抗體復(fù)合物。

在另一優(yōu)選例中，所述的第一容器為獨立的且封閉的包裝或試劑杯。

在另一優(yōu)選例中，所述的第一容器中還含有

在另一優(yōu)選例中，所述小分子化合物的分子量為1-1000Da，較佳地為5-800Da，更佳地為10-500Da。

在另一優(yōu)選例中，所述的小分子化合物為甲基苯丙胺。

在另一優(yōu)選例中，所述熒光乳膠微粒為鑭系金屬和/或鑭系金屬螯合物包被的乳膠微粒。

在另一優(yōu)選例中，所述質(zhì)控區(qū)包含第二抗體，所述第二抗體特異性結(jié)合于特異性針對小分子化合物的抗體。

在另一優(yōu)選例中，所述的第二抗體為多抗或抗血清。

在另一優(yōu)選例中，所述的特異性針對小分子化合物的抗體為鼠抗體，而所述的第二抗體為兔抗鼠IgG抗體或羊抗鼠IgG抗體。

在另一優(yōu)選例中，所述的特異性針對小分子化合物的抗體為兔抗體，而所述的第二抗體為羊抗兔IgG抗體。

在另一優(yōu)選例中，所述的小分子化合物的完全抗原為小分子化合物與載體蛋白的偶聯(lián)物。

在另一優(yōu)選例中，所述的載體蛋白包括BSA蛋白。

在本發(fā)明的第二方面，提供了一種檢測小分子化合物的方法，包括步驟：

(1)將待測物樣品與一抗體復(fù)合物進行混合，獲得第一處理混合物，其中所述抗體復(fù)合物包含熒光乳膠微粒以及特異性針對小分子化合物的抗體，并且所述特異性針對小分子化合物的抗體偶聯(lián)于所述熒光乳膠微粒；

(2)將所述的第一處理混合物加至一測試條的樣品墊，其中，所述測試條包括背襯以及位于背襯上的樣品墊、反應(yīng)膜和吸收墊，其中所述反應(yīng)膜上設(shè)置有檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)；所述的檢測區(qū)固定有所述小分子化合物的完全抗原；

(3)采用時間分辨熒光免疫層析方法測量所述測試片的檢測區(qū)的熒光強度及質(zhì)控區(qū)的熒光強度，從而確定小分子化合物是否存在，和/或確定為小分子化合物的含量。

在另一優(yōu)選例中，所述的小分子化合物包括甲基苯丙胺。

在另一優(yōu)選例中，所述的樣品包括水溶液、飲料、全血、血漿、血清、尿液、汗液、淚液或唾液。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(3)中，將測試區(qū)的熒光強度與質(zhì)控區(qū)的熒光強度的比值，和標準曲線進行比較，從而確定小分子化合物的含量。

在另一優(yōu)選例中，所述熒光乳膠微粒為鑭系金屬和/或鑭系金屬螯合物包被的乳膠微粒。

在本發(fā)明的第三方面，提供了一種定量檢測待測物的熒光測量裝置，所述的裝置包括：

(a)本發(fā)明第一方面所述的試劑盒；和

(b)用于檢測熒光強度的檢測器。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1顯示了本發(fā)明的一種實施例中免疫層析試紙條(板)的結(jié)構(gòu)示意圖，

其中，各標識如下：1為樣品墊，3為檢測區(qū)，4為反應(yīng)膜，5為質(zhì)控區(qū)(對照區(qū))，6為吸收墊，7為背襯。

具體實施方式

本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，通過大量篩選和摸索，發(fā)現(xiàn)首次意外地發(fā)現(xiàn)了一種新的快速定量檢測小分子化合物的試劑盒和方法。實驗表明，檢測時先將待測樣品和獨立放置的熒光乳膠微粒-抗體偶聯(lián)物混合，再將該混合物加至測試條，并通過時間分辨熒光免疫層析方法進行檢測，可以顯著提高檢測的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。

具體而言，本發(fā)明人經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有的層析檢測條的結(jié)構(gòu)對于定量檢測結(jié)果的波動(或偏差)造成較大的影響。一個主要的影響因素是結(jié)合墊部分(或結(jié)合區(qū))。如果將偶聯(lián)抗體的乳膠微粒包被在結(jié)合墊上，進行干燥。檢測時乳膠從結(jié)合墊上釋放就成為影響檢測準確性的關(guān)鍵因素之一。此外，乳膠微粒釋放的程度、釋放的快慢和/或結(jié)合墊的材質(zhì)，都可能是導(dǎo)致定量測定結(jié)果波動性大的因素。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，在對結(jié)合墊進行處理時，結(jié)合墊的處理方式以及乳膠的干燥程度也難以保持一致，且固定或位于所述結(jié)合墊的檢測抗體(如熒光乳膠微粒標記的抗體偶聯(lián)物)的性質(zhì)易發(fā)生變化，導(dǎo)致長期穩(wěn)定性下降，從而導(dǎo)致檢測結(jié)果的波動性大。

此外，發(fā)明人的實驗結(jié)果還表明，在檢測區(qū)(或檢測線)直接設(shè)置甲基苯丙胺等小分子化合物(標準品)時，也會導(dǎo)致檢測結(jié)果的波動性大。

為此，申請人優(yōu)化了檢測試劑的結(jié)構(gòu)，一方面省略了結(jié)合墊，另一方面在質(zhì)控區(qū)(或質(zhì)控線)設(shè)置第二抗體(如針對熒光乳膠微粒標記的抗體偶聯(lián)物的第二抗體)，并在檢測區(qū)(或檢測線)涉及所述小分子化合物的完全抗原，這樣不僅可以顯著提高檢測結(jié)果的準確性，減少偏差，而且所述檢測試劑即使長期存放(≥2年)仍可保持穩(wěn)定，并具有較高的準確性和靈敏度。

術(shù)語

甲基苯丙胺

如本文所用，“甲基苯丙胺”包括甲基苯丙胺及其類似物。

甲基苯丙胺又稱冰毒，因其原料外觀為純白結(jié)晶體，晶瑩剔透，故被吸毒、販毒者稱為“冰”。由于其毒性劇烈，人們便稱之為“冰毒”。甲基苯丙胺在小劑量時有短暫的興奮抗疲勞作用，故其丸劑又有“大力丸”之稱。甲基苯丙胺藥用為片劑，作為毒品用時多為粉末，也有液體與丸劑。

甲基苯丙胺可以興奮中樞神經(jīng)，具有欣快、警覺及抑制食欲之作用，重復(fù)使用會成癮；中毒癥狀包括多話、頭痛、錯亂、高燒、血壓上升、盜汗、瞳孔放大、食欲喪失。大劑量使用引起精神錯亂，思想障礙，類似妄想性精神分裂癥，多疑、幻聽、被害妄想等；長期使用導(dǎo)致器官性腦癥候群。

免疫層析技術(shù)

免疫層析技術(shù)(Immunochromatography)是20世紀80年代末90年代初建立的一種快速檢測技術(shù)。由于免疫層析技術(shù)不須進行結(jié)合標記物與自由標記物的分離，因而操作簡單、快速，非常適合現(xiàn)場檢測之用。

時間分辨熒光免疫分析

時間分辨熒光免疫分析(Time resolved fluoro immunoassay,TRFIA)是20世紀80年代初在傳統(tǒng)熒光免疫分析的基礎(chǔ)上創(chuàng)立的一種新型非放射性標記免疫分析技術(shù)，是目前最靈敏的微量分析技術(shù)。

測試條上檢測區(qū)域的檢測信號的獲取，將測試條上的檢測信號傳遞過來的光信號，通過光學(xué)聚光裝置、分光裝置，和光學(xué)光路整形等，得到615nm±10nm 左右的熒光光斑，將此熒光光斑傳遞到光學(xué)傳感器光電倍增管，獲得測試條上檢測區(qū)域的檢測光信號。通過控制信號讀取時間為10微秒到400微秒，得到一個扣除熒光本底的檢測信號。通過光電信號轉(zhuǎn)換，將光信號轉(zhuǎn)換為電信號傳送給計算控制部件處理，最終完成檢測。

與傳統(tǒng)的熒光素標記不同，它所用的示蹤物是具有獨特?zé)晒馓匦缘蔫|系元素及其螯合物，可有效排除樣品自然熒光的干擾，具有靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性好和無放射性污染等特點，靈敏度高達10^-19，較放射免疫分析(RIA)高出3個數(shù)量級。在臨床免疫檢驗和科學(xué)研究中的應(yīng)用越來越廣泛。

時間分辨熒光免疫層析技術(shù)

時間分辨熒光免疫層析技術(shù)是基于免疫層析技術(shù)的時間分辨熒光分析技術(shù)，是在時間分辨熒光免疫分析儀的基礎(chǔ)上，將時間分辨熒光免疫分析和免疫層析技術(shù)相結(jié)合，省去了繁瑣的加樣、洗滌步驟，試劑穩(wěn)定性好，操作簡單，檢測速度快，靈敏度高，可廣泛應(yīng)用于現(xiàn)場定量檢測，也可作為POCT(Point of Care Test，床邊診斷或即時檢測)分析儀。

鑭系元素

目前，己有5種鑭系元素被用于TRFIA，其中常用的有Eu、Tb和Sm，而Eu(銪元素)又是在標記抗原抗體中應(yīng)用最廣的元素。鑭系元素在游離狀態(tài)下，熒光信號很微弱，僅僅是分子間共振能級的能量傳遞，無輻射躍遷回基態(tài)發(fā)射熒光的機率很小，但其螯合物在紫外光源的激發(fā)下能發(fā)射熒光。與傳統(tǒng)的熒光素標記物相比，鑭系元素具有較寬的激發(fā)光譜帶和較窄的發(fā)射光譜帶，熒光持續(xù)時間長，且熒光光譜的Stocks位移較大，利用光譜分辨技術(shù)和時間分辨技術(shù)可有效排除激發(fā)光和非特異性熒光的干擾。

乳膠微粒

如本文所用，術(shù)語“乳膠微粒”、“乳膠微球”可以互換使用；“熒光微球”、“熒光微?！薄ⅰ盁晒馊槟z”、“熒光乳膠微粒”、“熒光乳膠微球”可以互換使用。

在醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域，從最早的乳膠凝集試驗發(fā)展到今天復(fù)雜的多元化檢測。以乳膠微粒作為抗原抗體的標記物，主要是由于乳膠微粒本身的特性，它可以 進行多種形式表面功能化修飾，密度改變和特殊屬性的改變(比如：顏色改變、熒光或磁性等)，使得乳膠成為檢測中的一個重要部分。

乳膠微球的直徑一般為100-300nm，最佳地為150-200nm。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的時間分辨熒光乳膠微粒是具有發(fā)射波長在610-620nm的熒光乳膠微粒，以便于檢測。一種優(yōu)選的乳膠微粒是含鑭系元素的熒光乳膠微粒，較佳地，含有銪螯合物?？捎糜诒景l(fā)明的乳膠微球沒有特別限制，可以選用市售的或用常規(guī)方法制備的乳膠微球。

采用內(nèi)部含銪的乳膠微粒，即結(jié)合銪螯合物的熒光微粒。該結(jié)合銪螯合物的熒光微粒，在紫外光激發(fā)下，發(fā)出610-620nm的紅色熒光，可以用來作為抗體標記。

抗體復(fù)合物

如本文所用“抗體復(fù)合物”、“熒光乳膠微粒-抗體偶聯(lián)物”和“熒光微粒標記抗體”可互換使用。

本發(fā)明中，經(jīng)熒光乳膠微粒標記的抗體為單/多克隆抗體。經(jīng)標記后，抗體被偶聯(lián)于熒光乳膠微粒。當然，也可視為乳膠微粒被偶聯(lián)于抗體。

較佳地，抗體共價偶聯(lián)于熒光乳膠微粒。

更佳地，將抗體偶聯(lián)于熒光乳膠微粒是將抗體通過熒光乳膠微粒表面活化的羧基、羥基或醛基而共價偶聯(lián)于熒光乳膠微粒。

其中，所述熒光乳膠微球的直徑為100-300nm，較佳地為150-200nm。

此外，所述抗體與所述乳膠微粒的重量比例為為1:2～1:50，較佳地為1:5～1:25。

更佳地，所述抗體與所述乳膠微粒的重量比例為1：8～12。

檢測試劑盒

本發(fā)明提供了一種可用于檢測飲用水、飲料、全血、血漿、血清、尿液、汗液、淚液、唾液等樣本中特定小分子化合物的檢測試劑盒。

所述試劑盒包括：

(a)測試條，所述測試條包括背襯以及位于背襯上的樣品墊、反應(yīng)膜和吸收墊，其中所述反應(yīng)膜上設(shè)置有檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)；以及

(b)第一容器，以及位于所述第一容器內(nèi)且與所述測試條獨立設(shè)置(或放 置)的抗體復(fù)合物，其中所述抗體復(fù)合物包含熒光乳膠微粒以及特異性針對小分子化合物的抗體，所述特異性針對小分子化合物的抗體偶聯(lián)于所述熒光乳膠微粒；

其中，所述的檢測區(qū)固定有所述小分子化合物的完全抗原；

較佳地，所述特異性針對小分子化合物的抗體采用含銪的熒光乳膠微粒標記。

一種優(yōu)選的測試條是利用側(cè)流原理的免疫層析側(cè)流片或免疫層析試紙條。

在本發(fā)明中，術(shù)語“測流片”、“試紙片”、“試紙條”、“試紙板”、“層析條”、“測試條”具有相同的含義，可以互換使用。

本發(fā)明優(yōu)選的免疫層析側(cè)流片(或測試條)的結(jié)構(gòu)如圖1所示，其中包括：樣品墊1，檢測區(qū)(或檢測線)3，反應(yīng)膜4，對照區(qū)(或質(zhì)控區(qū)、對照線、質(zhì)控線)5，吸收墊6，背襯7。

其中，背襯7的長度與測試條相同。

樣品墊1位于測試條的一端，吸收墊6位于測試條的另一端。

檢測區(qū)3(也稱檢測線)位于樣品墊1和吸收墊6之間，通常檢測區(qū)3設(shè)置在反應(yīng)膜4上，通過所述反應(yīng)膜連接樣品墊1和吸水墊6。優(yōu)選地，所述反應(yīng)膜4上還設(shè)置有質(zhì)控區(qū)5(也稱質(zhì)控線)，質(zhì)控區(qū)5位于檢測區(qū)3和吸收墊6之間。

其中，所述檢測區(qū)固定有小分子化合物的完全抗原，所述質(zhì)控區(qū)固定有羊抗鼠IgG，通過對兩個區(qū)域的熒光信號分別加以分析，獲得檢測物的定量指標。

測試條的制造方法，優(yōu)選地，分別將樣品墊1、反應(yīng)膜4、吸收墊6通過粘合劑粘貼于背襯7上，即得所述測試條。

在本發(fā)明中，所述測試條的各組成元件(或組件)可選用本領(lǐng)域已有的材料制成。

背襯7可以用任何穩(wěn)定的、無孔的材料制成，其強度應(yīng)足以支承材料和粘于其上的各組成元件。因為許多測定用水作為擴散介質(zhì)，因此背襯7較佳地是基本上不透水的。在一個優(yōu)選例中，背襯7是用聚合物膜制成的，更佳地是用聚氯乙烯膜制成的(如PVC膠板)。

樣品墊1可用任何吸收性材料制成。可使用的材料例子包括：纖維素、硝酸纖維素、乙酸纖維素、玻璃纖維、尼龍、聚電解質(zhì)離子交換膜、丙烯共聚物/尼龍、和聚醚砜。

反應(yīng)膜4可以用任何材料制成，只要該材料有足夠孔隙度從而允許在表面和內(nèi)部發(fā)生流體的毛細管作用。反應(yīng)膜4應(yīng)有足夠的孔隙度，從而允許涂有抗體或抗原的顆粒移動。反應(yīng)膜4還可被含待檢測分析物的樣品中所用的液體潤濕(例如，對于水性液體具有親水性，對于有機溶劑具有疏水性)。通過例如在美國專利No.4,340,482或No.4,618,533中所述的方法(這些方法描述了將疏水表面轉(zhuǎn)變成親水表面)，可以改變其疏水性從而使其具有親水性以便用于水性液體?？捎糜谥圃旆磻?yīng)膜4的材料例子包括但不限于：聚脂膜、纖維素、硝酸纖維素、乙酸纖維素、玻璃纖維、尼龍、聚電解質(zhì)離子交換膜、丙烯共聚物/尼龍、和聚醚砜(polyethersulfone)。在一個優(yōu)選例中，反應(yīng)膜4是用硝酸纖維素膜制成的。

吸收墊6可以用任何能吸收作為樣品和緩沖液的液體的材料制成。吸收墊6的吸收能力應(yīng)足夠大，以便吸收添加至測試條的液體。適用于吸收墊6的材料的例子包括纖維素和吸水濾紙。

為了便于理解本發(fā)明，給出本發(fā)明試劑盒的檢測原理。應(yīng)理解，本發(fā)明的保護范圍并不受該原理的影響或限制。

本發(fā)明采用競爭法免疫層析的原理，將小分子物質(zhì)的完全抗原固定于硝酸纖維膜上的檢測區(qū)(固相抗原)。預(yù)混合待測樣本和獨立放置的熒光乳膠微粒-抗體偶聯(lián)物，將該混合物加至測試條的樣品墊，如果樣本中不含有特定的小分子化合物，所述熒光乳膠微粒-抗體偶聯(lián)物將沿反應(yīng)膜(如硝酸纖維膜)向前流動，到達檢測線位置時，熒光微粒標記抗體被固定在反應(yīng)膜上的小分子與載體蛋白偶聯(lián)物捕獲，通過365nm紫外光的激發(fā)，在檢測區(qū)T線位置形成紅色的615nm熒光條帶。如果待檢樣品中含有一定濃度的小分子物質(zhì)，將會抑制熒光微粒標記抗體與固定抗原的結(jié)合，在硝酸纖維素膜的檢測區(qū)的熒光條帶將會減弱。熒光條帶的強弱與待檢樣品中含有的小分子物質(zhì)的濃度呈一定的線性關(guān)系，通過光電倍增管采集熒光信號進行計數(shù)，從而計算出待檢樣品中含有的小分子物質(zhì)的濃度。本發(fā)明在反應(yīng)膜(如硝酸纖維膜)的質(zhì)控區(qū)設(shè)置羊抗鼠IgG多抗，無論待檢樣品中是否含有待測小分子化合物，熒光微粒標記抗體總能與質(zhì)控區(qū)的羊抗鼠IgG多抗結(jié)合形成一條熒光質(zhì)控帶，該熒光條帶是判定層析過程是否正常和檢測板是否失效的標準，同時也作為定量分析中控制批間差的計算指標。

檢測裝置

本發(fā)明的檢測裝置可以包括：測試條、檢測器、光源、光導(dǎo)纖維和計算機。還可以包括一份檢測方法的使用說明。其中測試條的工作原理如上所述，任何可用于檢測熒光強度的時間分辨熒光分析方法均可用于本發(fā)明的檢測裝置。

本發(fā)明的主要優(yōu)點包括：

(a)本發(fā)明的試劑盒穩(wěn)定性好，靈敏度和準確性高。

(b)本發(fā)明的試劑盒特異性好。

(c)本發(fā)明的試劑盒可以用于多種樣品的檢測。

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。

材料

抗甲基苯丙胺單克隆抗體和甲基苯丙胺完全抗原以及羊抗鼠IgG多克隆抗體購自上海八通生物科技有限公司；含銪的乳膠微粒(Carboxylate-Modified Dyed Microparticles，F(xiàn)luoro-MAX,PART NO:93470520010150)粒徑為0.199nm，購自于ThermoFisher Scientific公司。EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺)、NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)和小牛血清白蛋白(BSA)均為Sigma公司產(chǎn)品；硝酸纖維素膜為Millipore公司產(chǎn)品，孔徑為8μm；玻璃纖維膜為Millipore公司產(chǎn)品；甲基苯丙胺對照品為中檢所國家麻醉品實驗室提供；時間分辨熒光定量檢測儀由上海伊思柏生物科技有限公司提供。

實施例1

熒光乳膠微粒-抗體偶聯(lián)物的制備

取1％熒光乳膠微球250μL加1000μL 0.05M 2-(N-嗎啉)乙磺酸(MES)(ph6.0)混勻。15000rpm離心20分鐘，棄上清液，用1000μL 0.05M MES重懸，超聲(50W，工作時間1秒，間隔時間1秒)后15000rpm離心20分鐘。 棄上清液，用0.05M MES稀釋至500μL，超聲。加入38.5μL的NHS(10mg/ml)和5μL EDC(15mg/ml)混勻后反應(yīng)15分鐘。加入0.15mg的甲基苯丙胺單克隆抗體混勻。搖床上避光室溫下反應(yīng)2小時。加入25μL 0.1M乙醇胺反應(yīng)30分鐘以封閉微球表面未結(jié)合羧基。13000rpm離心10分鐘后棄上清，用500μL酪蛋白封閉液反應(yīng)1小時。15000rpm離心10分鐘，收集標記的熒光乳膠微球用酪蛋白封閉液稀釋至250μL，超聲后2-8℃保存。

實施例2

冷凍干燥的熒光乳膠微粒-抗體偶聯(lián)物的制備

將標記上抗體的熒光乳膠微粒溶液與冷凍干燥處理液(Borax0.1M、BSA1％、S172％、蔗糖5％、海藻糖5％)混合，將混合溶液加入96孔板中25μL/孔，放入-80℃冰箱冷凍30分鐘。將冷凍后的96孔板放入預(yù)先開啟并已經(jīng)降溫至-35℃的真空冷凍干燥機中，分段升溫并進行真空干燥，2小時30分鐘后取出，用真空包裝機將冷凍干燥后的乳膠微粒進行真空包裝，包裝后放置于2-8℃保存。

實施例3

樣品墊的封閉處理

樣品墊采用玻璃纖維，為減少檢測中的非特異性結(jié)合和增加穩(wěn)定性，用表面活性劑和聚合物對樣品墊進行封閉處理。具體地，用含有0.2％Tween 20和0.5％PVA的pH 8.0，0.1M Tris緩沖液水溶液浸泡吸水濾紙，37℃烘16小時。

實施例4

免疫層析測試條的制備

在硝酸纖維素膜上用點膜機分別劃檢測線和質(zhì)控線，檢測線為甲基苯丙胺-BSA(完全抗原)(0.8mg/mL)，質(zhì)控線(C線)為純化后的羊抗鼠IgG多抗(1.0mg/mL)，37℃干燥后18-24小時。依次將硝酸纖維薄膜和樣品墊粘貼于PVC支持材料上。用切條機切成4mm的試劑條，置于塑料盒內(nèi)，加樣孔對準檢測條樣品墊位置，壓緊后組裝成檢測試劑盒，加入干燥劑密封保存。

進行檢測時，樣品中的甲基苯丙胺與固定在硝酸纖維膜上的甲基苯丙胺-BSA競爭結(jié)合熒光乳膠微粒-抗體偶聯(lián)物，檢測區(qū)(T)的熒光強弱與樣品中的甲 基苯丙胺含量相關(guān)，通過時間分辨定量檢測儀閱讀觀察窗檢測區(qū)(T)位置的熒光條帶的熒光值，通過不同濃度的標準品可以得出熒光值和甲基苯丙胺濃度的相關(guān)曲線和計算公式，由此可以準確地對樣品中的甲基苯丙胺進行定量。

實施例5

標準曲線的制備

從密封袋中取出冷凍干燥的熒光微粒抗體偶聯(lián)物，用移液槍加100μL不同濃度的甲基苯丙胺標準品于孔內(nèi)，用移液槍將溶液吹打混勻，取50μL滴入加樣孔內(nèi)，10分鐘后加入100μL沖洗液，再等待5分鐘，將試劑板插入檢測儀中讀取熒光值。根據(jù)不同濃度的甲基苯丙胺標準品和熒光值，通過四參數(shù)法制備標準曲線。

結(jié)果顯示，通過四參數(shù)擬合的回歸方程為：Y＝(A-D)/[1+(X/C)^B]+D，且R²＜0.99。

實施例6

樣品檢測方法

方法同實施例5所述方法，將100μL待測樣品與熒光微?？贵w偶聯(lián)物混合后進行檢測，獲得熒光值，通過標準曲線的計算公式，計算樣本中甲基苯丙胺的含量。

實施例7

特異性分析

特異性測試,對提供的多種常見毒品、毒物和藥物，在一定的濃度范圍內(nèi)進行交叉實驗。

a)選擇的毒品、毒物和藥物標準品對照物如下表所示：

注：K為千

b)以無毒品的凍融尿作為陰性對照，檢測各交叉干擾物(標準品)對陰性樣品的干擾，即在陰性樣品檢測時有陽性反應(yīng)，表現(xiàn)為儀器讀數(shù)反應(yīng)為T線讀數(shù)下降(相對于陰性對照儀器讀數(shù))。

c)通過實驗確定無交叉反應(yīng)的各標準品濃度，獲得可用于評估的可能發(fā)生交叉反應(yīng)的濃度。

d)獲得用于評估的發(fā)生交叉反應(yīng)的濃度大于檢測限濃度100倍以上，則可認定為滿足特異性測試要求。

結(jié)果如下表所示：本發(fā)明試劑盒僅與甲基苯丙胺類樣品發(fā)生反應(yīng)，與其他物質(zhì)沒有交叉反應(yīng)，具有很強的特異性。

實施例8

穩(wěn)定性分析

將檢測試劑盒密封后置于烘箱45℃溫度下破壞性試驗一個月。方法同實施例5所述方法，分別用破壞性處理的試劑盒與未烘烤過的試劑盒，對含不同濃度甲基苯丙胺的樣本及陰性樣本進行測試。

結(jié)果表明，45℃破壞性處理一個月的試劑盒與未烘烤過的試劑盒檢測結(jié)果一致(偏差≤±2％)。表明該檢測試劑盒具有良好的穩(wěn)定性。

實施例9

靈敏度分析

方法同實施例5中的方法，分別檢測濃度為3.125ng/mL、6.25ng/mL、12.5ng/mL的甲基苯丙胺樣品，每個檢測濃度重復(fù)檢測5次。計算檢測結(jié)果的標準差(SD值)、平均值(AVG值)和變異系數(shù)(CV值)，其中，CV值應(yīng)在10％以內(nèi)，則可認為滿足靈敏度測試要求。

結(jié)果如下表所示：本發(fā)明的甲基苯丙胺測試條的靈敏度約為3ng/ml。檢測的CV<10％。

實施例10

準確性分析

方法同實施例5中的方法，同本發(fā)明試劑盒對10例實際案例樣本進行檢測，檢測數(shù)據(jù)與GC-MS的結(jié)果進行比較，符合率均大于95％。結(jié)果表明，本發(fā)明的檢測試劑盒具有很高的準確性。

實施例11

檢測速度測試

將準備好的測試條(卡)插入檢測儀器，開始測試并計時，測試完成得到測試讀數(shù)，停止計時，得到計時時間，計時時間在10分鐘內(nèi)則可認定為滿足測試要求。

實驗結(jié)果：檢測時間均小于5分鐘，檢測速度符合現(xiàn)場檢測和快速檢測的要求。

對比例C1

測試條C1的制備和性能測試

1.制備

測試條C1的結(jié)構(gòu)與本發(fā)明測試條類似，其區(qū)別在于，測試條C1包括一結(jié)合墊，所述結(jié)合墊位于樣品墊1和吸收墊6之間，在樣品墊1的近端和吸收墊6的遠端，臨近樣品墊1。并且，所述結(jié)合墊上包含抗體復(fù)合物，所述抗體復(fù)合物包含熒光乳膠微粒以及小分子化合物抗體，所述小分子化合物抗體偶聯(lián)于所述熒光乳膠微粒。

2.準確性

采用該測試條C1，對于實施例10中的實際案例樣本進行檢測，檢測數(shù)據(jù)與GC-MS的結(jié)果進行比較，符合率僅為70％。這表明，檢測條C1的準確性不高，不適合準確性要求高的定量檢測應(yīng)用。

3.穩(wěn)定性

方法同實施例8，對該測試條C1進行穩(wěn)定性測試。

結(jié)果表明，45℃破壞性處理一個月的試劑盒與未烘烤過的試劑盒檢測結(jié)果發(fā)生了一定程度的偏差(偏差度≥10％)，此外，45℃破壞性處理二個月后，偏差度進一步上升到≥20％。這表明，測試條C1的長期穩(wěn)定性較差。

4.靈敏度

方法同實施例9，對該測試條C1進行靈敏度測試。

結(jié)果表明，該測試條C1的靈敏度為約10ng/ml，雖然可以滿足一般需要，但是靈敏度遠低于本發(fā)明測試條。

對比例C2

測試條C1的制備和性能測試

在對比例C2中，測試條C2的結(jié)構(gòu)與本發(fā)明測試條類似，其區(qū)別在于，檢測區(qū)設(shè)有甲基苯丙胺小分子化合物，而不設(shè)置甲基苯丙胺完全抗原。

方法同實施例9，對該測試條C2進行靈敏度測試。

結(jié)果表明，該測試條C2的靈敏度為大于30ng/ml，靈敏度遠低于本發(fā)明測試條。

在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。