一種茶刺蛾核型多角體病毒的定量檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制劑檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種茶刺蛾核型多角體病毒的定量 檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 茶刺蛾核型多角體病毒（Zragoit/ae /ksciaia nuclear polyhedrosis virus， Zr/aNPV)屬桿狀病毒科，核型多角體病毒屬。Zr/aNPV是茶刺蛾的病原性天敵，通過幼蟲取 食后在蟲體內(nèi)迅速增殖，致使其感染發(fā)病而死亡。目前這種病毒已可以通過室內(nèi)大量增殖， 經(jīng)配制形成產(chǎn)品，進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)，近年來，ZrZMPV作為一種高效病毒殺蟲劑在各省茶區(qū) 廣泛推廣使用，對(duì)茶刺蛾進(jìn)行有效的生物防治，產(chǎn)生了良好的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益。因?yàn)?這種病毒產(chǎn)品不同于一般的農(nóng)藥，它是一個(gè)活體，目前只有通過生物測(cè)定的方法進(jìn)行檢測(cè)。 即用病毒產(chǎn)品喂飼茶刺蛾幼蟲，觀察其是否發(fā)病來確定，因?yàn)椴《臼菍Ｒ坏?，茶刺蛾病毒?能感染茶刺蛾幼蟲。這種傳統(tǒng)的生物測(cè)定的方法使得目前在ZrZMPV病毒制劑的生產(chǎn)、使 用過程中存在毒力指標(biāo)檢測(cè)粗放、評(píng)價(jià)周期過長(zhǎng)、制劑質(zhì)量難以有效監(jiān)控等問題。為了快速 有效檢測(cè)出生物殺蟲劑中Zr/aNPV的含量，建立靈敏、特異而又簡(jiǎn)易的病毒檢測(cè)方法至關(guān) 重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種茶刺蛾核型多角體病 毒的定量檢測(cè)方法的技術(shù)方案。
[0004] 所述的一種茶刺蛾核型多角體病毒的定量檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 根據(jù)茶刺蛾核型多角體病毒的Ze/ 11基因設(shè)計(jì)引物Zr/aNPV Ze/ 11 F和引物 Zr/aNPV Ze/ 11 R，所述的引物Zr/aNPV Ze/ 11 F核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示，所述 的引物Zr/aNPV Ze/ 11 R核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示； 2) 從感染茶刺蛾核型多角體病毒的蟲尸中提取茶刺蛾核型多角體病毒基因組DNA，獲 取目的片段，以目的片段為模板，用步驟1)中設(shè)計(jì)的一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到Ze/ 11基 因片段； 3) 將步驟2)擴(kuò)增獲得的Ze/ 11基因片段與載體pGEM-T連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a 中，挑單克隆菌株，搖菌，再采用PCR鑒定單菌落質(zhì)粒DNA，將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒測(cè)序 并測(cè)定質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度，保存于-20°C冰箱中，備用，所述的重組質(zhì)粒核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示； 4) 將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品按梯度稀釋成不同濃度的模板，進(jìn)行熒光定量PCR，以其模板數(shù)的對(duì)數(shù) 值為X軸，CT值為Y軸做回歸曲線，建立檢測(cè)茶刺蛾核型多角體病毒的標(biāo)準(zhǔn)曲線； 5) 提取待測(cè)樣品基因組，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，根據(jù)步驟4)中建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出 待測(cè)樣品的拷貝數(shù)，確定待測(cè)樣品的濃度。
[0005] 所述的一種茶刺蛾核型多角體病毒的定量檢測(cè)方法，其特征在于所述的步驟2)中 PCR擴(kuò)增的程序：先94°C預(yù)變性3min ;然后94°C變性30s，60°C變性45s ;循環(huán)35次，最后 延伸72°C延伸7min。
[0006] 所述的一種茶刺蛾核型多角體病毒的定量檢測(cè)方法，其特征在于所述的步驟4) 中熒光定量 PCR 采用 20ul 體系：質(zhì)粒模板 2PL，SYBR Premix Ex TaqTM (2X) 1〇μL，ROX Reference DyeII 0.4μL，正反引物各0.8μL，加滅菌雙蒸水6ul至2〇μL;反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C 30s;95°C 5s，60°C 34s;共40個(gè)循環(huán)，陰性對(duì)照使用滅菌雙蒸水。
[0007] 所述的一種茶刺蛾核型多角體病毒的定量檢測(cè)方法，其特征在于所述的步驟4)中 梯度為 1.0 X 1〇7、1.0 X 1〇6、1.0 X 1〇5、1.0 X 1〇4、1.0 X IO3和 1.0 X 10 2拷貝 /μL。
[0008] 上述的一種茶刺蛾核型多角體病毒的定量檢測(cè)方法，設(shè)計(jì)合理，突破了傳統(tǒng)的生 物測(cè)定技術(shù)，解決了茶刺蛾核型多角體病毒的準(zhǔn)確定性問題。與傳統(tǒng)生物測(cè)定方法相比，本 發(fā)明毒力指標(biāo)檢測(cè)更為精細(xì)，毒力評(píng)價(jià)周期大大縮短，可廣泛用于病毒制劑質(zhì)量的評(píng)定，規(guī) 范茶刺蛾核型多角體病毒的生產(chǎn)應(yīng)用。
【附圖說明】
[0009] 圖1為Ze/ 11基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖； 圖 1 中：M-DL 2000 Marker ; 2- Ze/ 11 基因 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物； 圖2為重組質(zhì)粒pGEMTeasy- Ze/ IlPCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖； 圖 2 中：M-DL 2000 Marker ; 2-重組質(zhì)粒 pGEMTeasy- Ze/ IlPCR 擴(kuò)增產(chǎn)物； 圖3為Zr/aNPV Ze/ 11基因擴(kuò)增的熔解曲線圖； 圖4為Zr/aNPV PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線圖； 圖5為Zr/aNPV Ze/ 11基因不同稀釋梯度的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0010] 以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0011] 實(shí)施例1: ZrZMPV病毒樣品的獲得及其基因組DNA的提取 以茶刺蛾核型多角體病毒感染茶刺蛾幼蟲，收集蟲尸，以PBS溶液作緩沖液反復(fù)勻漿， 緩沖液體積與蟲尸體積比為10:1，1000 Og離心l〇min，重復(fù)3次，上清液即為病毒粗提液； 病毒粗提液經(jīng)35000g離心2小時(shí)，沉淀即為經(jīng)純化的病毒粒子；用I XPBS反復(fù)洗滌純化的 病毒粒子，至乳白色為止；用 TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver. 5.0 試劑盒進(jìn)行茶刺蛾核型多角體病毒基因組的提取。步驟如下：1)病毒的裂解①取200 μ 1的 病毒原液。②加入 200 μ1 的Buffer VGB、20yl 的Proteinase K 和 LOyl^tlCarrier RNA，充分混勻于56°C水浴溫浴10分鐘。③離心，取上清；向上清中加入200 μ 1無水乙醇， 充分吸打混勾。2)將Spin Column安置于Collection Tube上，溶液移至Spin Column中， 12.000 rpm離心2分鐘，棄濾液。3)將500 μ1的Buffer RWA加入至Spin Column中， 12.000 rpm離心1分鐘，棄濾液。4)將700 μ1的Buffer RWB加入至Spin Column中， 12.000 rpm離心1分鐘，棄濾液。注）請(qǐng)確認(rèn)Buffer RWB中已經(jīng)加入了指定體積的100% 乙醇。請(qǐng)沿Spin Column管壁四周加入Buffer RWB，這樣有助于完全沖洗沾附于管壁上 的鹽份。5)重復(fù)操作步驟4)。6)將Spin Column安置于Collection Tube上，12, 000 rpm 離心 2 分鐘。7)將 Spin Column 安置于新的 1.5ml RNase free collection tube 上， 在Spin Column膜的中央處加入30~50 μ 1的RNase free dH20,室溫靜置5分鐘。8) 12，000 rpm離心2分鐘洗脫DNA/RNA。如需獲得更大收量，可將離下液重新加入到Spin Column膜的中央或再加入30~50 μ 1的RNase free dH20,室溫靜置5分鐘后，12, 000 rpm 離心2分鐘洗脫DNA。4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0012] 實(shí)施例2:目的片段PCR擴(kuò)增 根據(jù)Zr/aNPV基因組序列（FJ362523)的Ze/ 11基因，采用DNAStar軟件，設(shè)計(jì)了一 對(duì)特異性引物/r/aNPV Ze/ IlF和引物Zr/aNPV Ze/ 11R，由上海生工生物技術(shù)有限公司 合成，引物序列分別為：5' - ACAATGAGAGTGGACCTTACGA-3'（如 SEQ ID NO :1 所示）和 5' - ACGCGCTAAAACACGATATGA -3'（如 SEQ ID NO :2 所示)，擴(kuò)增 Ze/ 11，PCR 反應(yīng)采用 25μL 體 系（模板2μL，10Xbuffer2·5μL，dNTP2μL，正反引物各(λ5μL，Tag酶(λ25μL，加滅菌雙蒸