專利名稱：糖的熒光探針的合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種糖的熒光探針的合成方法。
近年來(lái)，大量研究表明，糖具有許多重要的生物學(xué)功能，尤其在以生物大分子相互作用為基礎(chǔ)的細(xì)胞識(shí)別和信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，許多疾病的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞表面及胞外基質(zhì)中糖鏈的異常密切相關(guān)，因此，對(duì)糖的結(jié)構(gòu)與功能的研究越來(lái)越受到重視。糖的熒光探針作為一種研究工具，對(duì)探討糖的作用機(jī)理及代謝命運(yùn)意義重大，而且在不久的將來(lái)，極可能成為某些疾病的診斷工具。然而，已有的糖熒光探針大多缺乏選擇性，從而影響和破壞了糖的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，不能很好的保持糖的生物活性。
本發(fā)明的目的是提供一種糖的熒光探針的合成方法，它能彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足。
一種糖的熒光探針的合成方法，其特征是在氰基硼氫化鈉的存在下，使糖與酪胺發(fā)生還原氨化反應(yīng)，該反應(yīng)產(chǎn)生的仲氨基與異硫氰酸熒光素進(jìn)一步反應(yīng)，合成出糖的熒光探針。
本方法與已有方法相比可以避免熒光探針合成過(guò)程對(duì)糖的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞，能合成出更好地保持糖原有的生物活性的熒光探針。該熒光探針，可用于相應(yīng)糖的生理、生化、藥理、藥物代謝等多方面的基礎(chǔ)研究，也能被進(jìn)一步用于相關(guān)疾病的診斷。
下面通過(guò)實(shí)施利說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例一、將100mg分子量為40000道爾頓的葡聚糖溶于10ml pH為8的0.2mol/L的磷酸鉀緩沖液，然后依次加入50mg酪胺(Tyr)、40mg氰基硼氫化鈉，于37℃發(fā)生還原氨化反應(yīng)，產(chǎn)生仲氨基，反應(yīng)96小時(shí)，間或振蕩。反應(yīng)完畢，將反應(yīng)液離心分離，上清液用SephadexTMG-25柱分離，用水洗脫，利用核酸蛋白檢測(cè)儀在280nm處檢測(cè)紫外吸收，收集第一峰處的洗脫液，用0.5mol/L的NaHCO3水溶液調(diào)pH至8.5。然后加入異硫氰酸熒光素(FITC)10mg，室溫下避光反應(yīng)過(guò)夜，向反應(yīng)混合物加無(wú)水乙醇至乙醇終濃度為80％，有大量亮黃綠色沉淀析出，離心棄去上清液。向沉淀加水復(fù)溶，用乙醇再沉淀，反復(fù)三次，條件同上，得葡聚糖-Tyr-FITC探針，并進(jìn)一步用SephadexTMG-25柱純化，收集相應(yīng)的水洗脫組分，凍干保存。
實(shí)施例二、將100mg分子量為5000道爾頓的硫酸葡聚糖溶于15mlpH為8的0.2mol/L的磷酸鉀緩沖液，然后依次加入200mg酪胺、75mg氰基硼氫化鈉，于30℃下反應(yīng)96小時(shí)，間或振蕩。反應(yīng)完畢，將反應(yīng)液離心分離，上清液用SephadexTMG-25柱分離，用水洗脫，利用核酸蛋白檢測(cè)儀在280nm處檢測(cè)紫外吸收，收集第一峰處的洗脫液，用0.5mol/L的NaHCO3水溶液調(diào)pH至8.5。然后加入FITC 15mg，室溫下避光反應(yīng)過(guò)夜，向反應(yīng)混合物加無(wú)水乙醇至乙醇終濃度為80％，有大量亮黃綠色沉淀析出，離心棄去上清液。向沉淀加水復(fù)溶，用乙醇再沉淀，反復(fù)三次，條件同上，得硫酸葡聚糖-Tyr-FITC探針，并進(jìn)一步以SephadexTMG-25柱純化，收集相應(yīng)水洗脫組分，凍干保存。
實(shí)施例三、將400mg經(jīng)酸降解的褐藻酸鈉(分子量為10000道爾頓)溶于15ml pH為8的0.2mol/L的磷酸鉀緩沖液，然后依次加入400mg酪胺、150mg氰基硼氫化鈉，于37℃下反應(yīng)96小時(shí)，間或振蕩。反應(yīng)完畢，將反應(yīng)液離心，上清液用SephadexTMG-25柱分離，用水洗脫液，利用核酸蛋白檢測(cè)儀在280nm處檢測(cè)紫外吸收，收集第一峰處的洗脫夜，用0.5mol/L的NaHCO3水溶液調(diào)pH至8.5。然后加入FITC 25mg，室溫下避光反應(yīng)過(guò)夜，向反應(yīng)混合物加無(wú)水乙醇至乙醇終濃度為80％，有大量亮黃綠色沉淀析出，離心棄去上清液。向沉淀加水復(fù)溶，用乙醇再沉淀，反復(fù)三次，條件同上，得褐藻酸鈉-Tyr-FITC探針，并進(jìn)一步以SephadexTMG-25柱純化，收集相應(yīng)的水洗脫組分，凍干保存。
實(shí)施例四、將10mg麥芽七糖溶于3ml pH為8的0.2mol/L的磷酸鉀緩沖溶液，然后依次加入30mg酪胺、35mg氰基硼氫化鈉，于40℃下反應(yīng)96小時(shí)，間或振蕩。反應(yīng)完畢，將反應(yīng)液離心分離，上清液用SephadexTMG-10柱分離，用水洗脫，利用核酸蛋白檢測(cè)儀在280nm處檢測(cè)紫外吸收，收集第一峰處的洗脫液，用0.5mol/L的NaHCO3水溶液調(diào)pH至8.5。然后加入FITC 20mg，室溫下避光反應(yīng)過(guò)夜，向反應(yīng)混合物加無(wú)水乙醇至乙醇終濃度為95％，有大量亮黃綠色沉淀析出，離心棄去上清液。向沉淀加水復(fù)溶，用乙醇再沉淀，反復(fù)三次，條件同上，得麥芽七糖-Tyr-FITC探針，并進(jìn)一步以SephadexTMG-10柱純化，收集相應(yīng)的水洗脫組分，凍干保存。
本發(fā)明的還原氨化反應(yīng)可在30-40℃下進(jìn)行。
經(jīng)分析，本發(fā)明合成的糖熒光探針，其標(biāo)記率大于70％，產(chǎn)物中不含游離的FITC，凍干品室溫下保存穩(wěn)定，其水溶液于37℃放置96小時(shí)熒光衰減不明顯。體內(nèi)代謝實(shí)驗(yàn)表明，熒光基團(tuán)與多糖及寡糖之間形成的化學(xué)鍵穩(wěn)定，在體內(nèi)代謝過(guò)程中不發(fā)生斷裂。
權(quán)利要求
1.一種糖的熒光探針的合成方法，其特征是在氰基硼氫化鈉的存在下，使糖與酪胺發(fā)生還原氨化反應(yīng)，該反應(yīng)產(chǎn)生的仲氨基與異硫氰酸熒光素進(jìn)一步反應(yīng)，合成出糖的熒光探針。
2.如權(quán)利要求1所述的合成方法，其特征是所述的還原氨化反應(yīng)在磷酸鉀緩沖液中30-40℃下進(jìn)行。
全文摘要
一種糖的熒光探針的合成方法，其特征是在氰基硼氫化鈉的存在下，使糖與酪胺發(fā)生還原氨化反應(yīng)，該反應(yīng)產(chǎn)生的仲氨基與異硫氰酸熒光素進(jìn)一步反應(yīng)，合成出糖的熒光探針。本方法與已有方法相比可以避免熒光探針合成過(guò)程對(duì)糖的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞，能合成出更好地保持糖原有的生物活性的熒光探針。該熒光探針，可用于相應(yīng)糖的生理、生化、藥理、藥物代謝等多方面的基礎(chǔ)研究，也能被進(jìn)一步用于相關(guān)疾病的診斷。
文檔編號(hào)G01N33/68GK1402006SQ01135138
公開(kāi)日2003年3月12日 申請(qǐng)日期2001年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月22日
發(fā)明者耿美玉, 李福川, 李靜, 辛現(xiàn)良, 管華詩(shī) 申請(qǐng)人:青島海洋大學(xué)