專利名稱：基因工程乙肝預(yù)防、治療疫苗中前s的制作方法
基因工程乙肝預(yù)防、治療疫苗中前S1抗原和前S2抗原含量測定的方法。
乙型肝炎病毒(HBV)是引起人類肝臟疾病的主要病毒不僅可以引起急、慢性病毒肝炎，而且還與肝硬化和肝癌的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。乙型病毒性肝炎是一種世界性的傳染性疾病。
完整的乙型肝炎病毒顆粒，即Dane氏顆粒，直徑為42nm。由外膜和核衣殼組成，后者含有一個環(huán)狀的部分雙鏈DNA分子，DNA多聚酶，DNA結(jié)合蛋白及蛋白激酶等。外膜(S基因區(qū))是由表面抗原(HBsAg)組成的病毒包膜。S基因區(qū)為乙型肝炎病毒DNA一個重要的開放讀碼框架。S基因區(qū)又可分成三段，從上游開始依次為前S1(pre-S1)區(qū)，前S2(pre-S2)區(qū)和S區(qū)。乙肝病毒表面抗原的主要組成部分是S基因編碼的蛋白質(zhì)成份叫小蛋白，前S2蛋白和S蛋白共同組成的蛋白質(zhì)，分子量居中，稱為中蛋白，由前S1、前S2及S基因三部分基因共同編碼組成的蛋白質(zhì)，是S基因中分子量最大的一種，因此稱為大蛋白。
目前在國際上對乙型肝炎病毒的檢測上應(yīng)用的方法很多。如反向血球凝集試驗(RPHA)、放射免疫分析法(RIA)測定HBsAg含量的結(jié)果只能是稀釋倍數(shù)讀不到具體含量。
酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法是目前檢測乙型肝炎病毒抗原靈敏度最高的方法。但在檢測前S1蛋白和前S2蛋白時只是定性試驗。在前S1蛋白和前S2蛋白的具體定量上沒有檢測方法。
本發(fā)明是應(yīng)用定性用的檢測乙型肝炎病毒前S1、前S2的ELISA試劑盒和HBsAg的ELISA試劑盒測定基因工程乙型肝炎疫苗中的前S1抗原和前S2抗原的含量。
基因工程乙肝預(yù)防、治療疫苗中前S1抗原和前S2抗原含量測定的方法A、用已知含量的乙肝表面抗原(HBsAg)做標(biāo)準(zhǔn)對照；B、前S1抗體、前S2抗體和S抗體用免疫學(xué)方法定量；結(jié)果分析測得結(jié)果分別與標(biāo)準(zhǔn)已知量的HBsAg相對比，計算相應(yīng)的數(shù)值，此數(shù)值做為基因工程乙肝疫苗中前S1抗原和前S2抗原的相對含量數(shù)值。這種方法可代替用Lowry法測定無法區(qū)分基因工程乙肝疫苗中前S1蛋白和前S2蛋白含量的不足。
實施例1利用此方法可以測定基因工程乙肝疫苗中不同蛋白成份的鑒別及各種蛋白成份的相對定量分析。用定性的乙型肝炎病毒前S1、前S2和HBsAg的ELISA試劑盒測定基因工程乙型肝炎疫苗中的前S1抗原和前S2抗原含量的方法，是用已知含量的HBsAg作為標(biāo)準(zhǔn)對照。
實施例2取200ul稀釋后的已知量的HBsAg和稀釋后的待檢樣品分別加到酶標(biāo)板上不同的反應(yīng)孔內(nèi)(待檢樣品必須經(jīng)過用Lowry法測定蛋白含量，與標(biāo)準(zhǔn)已知量的HBsAg做倍比稀釋到一定蛋白濃度)，然后將包被的酶標(biāo)板置4℃過夜，次日從4℃取出酶標(biāo)板將包被液棄掉用磷酸鹽緩沖(PBS)加1％吐溫20洗板每孔至少3次，加3％小牛血清白蛋白200ul/孔37℃2小時，棄掉小牛血清白蛋白，用PBS加1％吐溫20洗板每孔至少洗3次，再分別加入相應(yīng)抗前S1、抗前S2、抗S酶標(biāo)抗體37℃1小時，倒掉酶標(biāo)抗體，用PBS加1％吐溫20洗板，每孔至少洗3次，棄掉洗液以后，加入酶底物液A和B混合后生也加入50ul放置37℃15分鐘，加終止液每也20ul，用酶標(biāo)儀OD450nm測定酶標(biāo)板的各個孔樣品。
實施例3根據(jù)此方法的免疫學(xué)原理也可以將酶聯(lián)免疫吸附試驗改變?yōu)榘帱c雜交法。
取標(biāo)準(zhǔn)的已知HBsAg抗原按倍比稀釋后點在硝酸纖維素膜上，待自然干燥；取待測的樣品含前S1抗原、前S2抗原也按倍比稀釋的方法稀釋后分別點在另外的膜上，待樣品自然干燥以后，浸泡于3％小牛血清白蛋白中37℃2小時，棄掉浸泡液體，用PBS加1％吐溫20洗液洗膜3次，加相對應(yīng)的抗體(點已知含量的HBsAg膜加抗HBsAg抗體，待檢樣品的膜分別加所要檢的目的蛋白相應(yīng)抗體)浸泡37℃1小時，棄掉含抗體的浸泡液，用PBS加1％吐溫20洗液洗膜3次，加抗相應(yīng)抗體酶標(biāo)抗體浸泡37℃1小時，棄掉浸泡液用PBS加1％吐溫20液洗膜3次，加相應(yīng)的酶底物顯色，根據(jù)班點來計算待測蛋白含量。
實施例4此方法也可以用于以后開發(fā)的丙型肝炎病毒(HCV)疫苗的不同組分的鑒別和定量分析?？梢允紫忍崛”透窝撞《镜鞍椎母鱾€組分，如丙型肝炎病毒的核殼體蛋白HCV的NS2區(qū)的疏水蛋白，HCV的NS3區(qū)蛋白，NS5區(qū)的蛋白。免疫動物得到相應(yīng)的抗體以后做成酶標(biāo)試劑。用以HCV的各種組分和鑒別及定量分析。
權(quán)利要求
1.基因工程乙肝預(yù)防、治療疫苗中前S1抗原和前S2抗原含量測定的方法A、用已知含量的乙肝表面抗原(HBsAg)做標(biāo)準(zhǔn)對照；B、前S1抗體、前S2抗體和S抗體用免疫學(xué)方法定量；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的前S1抗原和前S2抗原含量測定的方法，用定性的乙型肝炎病毒前S1、前S2和HBsAg的ELISA試劑盒測定基因工程乙型肝炎疫苗中的前S1抗原和前S2抗原含量的方法，是用已知含量的HBsAg作為標(biāo)準(zhǔn)對照。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的前S1抗原和前S2抗原含量測定的方法，取200ul稀釋后的已知量的HBsAg和稀釋后的待檢樣品分別加到酶標(biāo)板上不同的反應(yīng)孔內(nèi)(待檢樣品必須經(jīng)過用Lowry法測定蛋白含量，與標(biāo)準(zhǔn)已知量的HBsAg做倍比稀釋到一定蛋白濃度)，然后將包被的酶標(biāo)板置4℃過夜，次日從4℃取出酶標(biāo)板將包被液棄掉用磷酸鹽緩沖(PBS)加1％吐溫20洗板每孔至少3次，加3％小牛血清白蛋白200ul/孔37℃2小時，棄掉小牛血清白蛋白，用PBS加1％吐溫20洗板每孔至少洗3次，再分別加入相應(yīng)抗前S1、抗前S2、抗S酶標(biāo)抗體37℃1小時，倒掉酶標(biāo)抗體，用PBS加1％吐溫20洗板，每孔至少洗3次，棄掉洗液以后，加入酶底物液A和B混合后生也加入50ul放置37℃15分鐘，加終止液每也20ul，用酶標(biāo)儀OD450nm測定酶標(biāo)板的各個孔樣品。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的前S1抗原和前S2抗原含量測定的方法，取標(biāo)準(zhǔn)的已知HBsAg抗原按倍比稀釋后點在硝酸纖維素膜上，待自然干燥，取待測的樣品含前S1抗原、前S2抗原也按倍比稀釋的方法稀釋后分別點在另外的膜上，待樣品自然干燥以后，浸泡于3％小牛血清白蛋白中37℃2小時，棄掉浸泡液體，用PBS加1％吐溫20洗液洗膜5次，加相對應(yīng)的抗體(點已知含量的HBsAg膜加抗HBsAg抗體，待檢樣品的膜分別加所要檢的目的蛋白相應(yīng)抗體)浸泡37℃1小時，棄掉含抗體的浸泡液，用PBS加1％吐溫20洗液洗膜3次，加抗相應(yīng)抗體酶標(biāo)抗體浸泡37℃1小時，棄掉浸泡液用PBS加1％吐溫20液洗膜3次，加相應(yīng)的酶底物顯色，根據(jù)班點來計算待測蛋白含量。
全文摘要
本發(fā)明創(chuàng)造的目的是提供一種基因工程乙肝預(yù)防、治療疫苗中前S
文檔編號G01N33/576GK1310341SQ01103989
公開日2001年8月29日 申請日期2001年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月20日
發(fā)明者劉柱, 王成余 申請人:遼寧天成生物制藥研究所