專利名稱：：初生仔豬腹瀉病的大腸桿菌基因工程疫苗k88-k99-lt及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及初生仔豬腹瀉病大腸桿菌疫苗的研制，屬于畜牧獸醫(yī)
技術(shù)領(lǐng)域：
。由特定血清型產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(Enterotoxigenic五化/zen'c/K'"co/"ETEC)引起的初生仔豬腹瀉(Neonataldiarrhea)是導(dǎo)致初生仔豬死亡的-一種重要傳染病。初生仔豬腹瀉多表現(xiàn)為突然發(fā)病，拉黃色水樣糞便，迅速脫水和電解質(zhì)失衡。發(fā)病豬可在幾小時內(nèi)死亡，有的仔豬沒有出現(xiàn)腹瀉就已經(jīng)死亡。特定血清型的大腸桿菌是引起初生仔豬腹瀉的主要病原，其主要產(chǎn)生F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)和F41四類黏附素，同時可產(chǎn)生耐熱腸素(heat-stableenterotoxin，ST)或/禾口不而寸熱腸毒素(heat-labileenterotoxin，LT)。鑒于K88、K99、987P、F4]四類粘附素在致初生仔豬腹瀉大腸桿菌的高出現(xiàn)率及ST、LT間較高的相關(guān)性，可以認(rèn)定上述六種抗原是致初生仔豬腹瀉ETEC的主要致病因子。在初生仔豬腹瀉防治方面，目前，國內(nèi)常用的預(yù)防初生仔豬腹瀉的大腸桿菌基因工程疫苗是K88-K99二價苗，而流行病學(xué)調(diào)查的結(jié)果顯示K88、K99、987P、F41、ST、LT是目前引起我國初生仔豬腹瀉ETEC的主要毒力因子或保護(hù)性抗原，因此，要有效控制我國由ETEC引起的初生仔豬腹瀉，應(yīng)注重對上述全部6種毒力因子的基因工程疫苗的研制。臨床上，可供選擇的另外一種預(yù)防初生仔豬腹瀉的大腸桿菌疫苗是菌體滅活苗，菌體滅活苗需加多個菌株，即便達(dá)到有限效果，每個菌株均需達(dá)一定濃度，幾個菌株加在一起勢必造成疫苗中細(xì)菌總濃度較高，不可避免地產(chǎn)生副作用，免疫效果有限。因此研制免疫保護(hù)效果好、副作用低的基因工程疫苗為大勢所趨。國內(nèi)外尚無將上述六種保護(hù)性抗原基因中的三種串聯(lián)表達(dá)的基因工程疫苗產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
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發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種可預(yù)防初生仔豬腹瀉的基因工程疫苗K88-K99-LT。本發(fā)明由K88的主要亞單位基因/aeG片段、K99的主要亞單位基因/"wC片段、LT的主要亞單位基因to片段和原核表達(dá)載體pGEX-6P-l串聯(lián)組成。經(jīng)過一系列免疫保護(hù)試驗，證明本發(fā)明對于預(yù)防初生仔豬腹瀉，是--種高效的初生仔豬腹瀉大腸桿菌基因工程疫苗，其安全性和免疫原性可靠。本發(fā)明的第二個目的還在于發(fā)明一種上述基因工程疫苗K88-K99-LT的構(gòu)建方法將擴(kuò)增出的K88的主要亞單位基因片段、K99的主要亞單位基因/，C片段、LT的主要亞單位基因她片段，按K88-K99-LT方式定向串聯(lián)于原核表達(dá)載體pGEX-6P-l。另，用于擴(kuò)增K88的主要亞單位基因/^G片段的引物是PI:GTGGATCCTGGATGACTGGTS謹(jǐn)HIP2:GTAAGCTTGTAATAAGTTATTGCTACG飾孤用于擴(kuò)增K99的主要亞單位基因々"C片段的引物是P3:AAGCTTAATACAGGTACTATTAACTTCAATGP4:GTCGACCATATAAGTGACTAAGAAGGAT用于擴(kuò)增LT的主要亞單位基因他片段的引物是P5:GTCGACGCTCCCCAGACTATTACAGAAC1P6:CTCGAGCTACCGTTAGTCATACTTTTTGCT勘I本發(fā)明依據(jù)已公開的/aeG(K88)、/a"C(K99)、/6(LT)亞單位的基因序列，設(shè)計含特異酶切位點的引物；以致初生仔豬腹瀉大腸桿菌的質(zhì)?；蚧蚪MDNA為模板，采用PCR法擴(kuò)增出上述保護(hù)性抗原基因；將上述基因定向串聯(lián)于表達(dá)性質(zhì)粒pGEX-6P-l，經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主菌BL21后，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot證明目的基因確己表達(dá)；再將表達(dá)上述3種保護(hù)性抗原基因的重組菌BL21(pFFLTB)免疫小鼠，評價其免疫原性及安全性。本發(fā)明通過構(gòu)建表達(dá)大腸桿菌免疫保護(hù)性抗原K88、K99、LT基因的重組菌，并對小鼠進(jìn)行腹腔免疫，結(jié)果顯示經(jīng)重組菌免疫后的小鼠血清中，產(chǎn)生了分別針對K88、K99抗原特異性的IgG，相應(yīng)的抗體水平從免疫后7天開始逐步升高，在第二次免疫后21天左右達(dá)到了較高的水平，并且在攻毒后對小鼠提供了較好的保護(hù)，針對K88、K99的標(biāo)準(zhǔn)菌株C83907、C83709的免疫保護(hù)率分別達(dá)83.3%、66.6%。圖l為本發(fā)明的構(gòu)建模式圖。圖2為GST-FaeG-FanC-LTB聯(lián)合表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析結(jié)果圖。圖3為GST-FaeG-FanC-LTB的Western-blot分析結(jié)果圖。圖4為小鼠免疫后血清中針對K88抗原特異性IgG檢測結(jié)果線圖。圖5為小鼠免疫后血清中針對K99抗原特異性IgG檢測結(jié)果線圖。具體實施例方式一、生物材料1、保護(hù)性抗原序列上述3種保護(hù)性抗原的主要亞單位的基因序列來自于國際互聯(lián)網(wǎng)的GenBank中，其中①/aeG(K88)在GenBank中的登錄號為M29375，登錄時間為1993-4-26。②/a"C(K99)在GenBank中的登錄號為M35282，登錄時間為1993-4-26。③他(LT)在GenBank中的登錄號為M17873,登錄時間為1996-4-16。2、表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)質(zhì)粒為pGEX-6P-l，購自AmershamPharmacia公司。3、菌種的來源含保護(hù)性抗原基因的重組質(zhì)粒，是在BL21宿主細(xì)菌中表達(dá)的。BL21宿主菌也是商tn化宿主菌，也購自AmershamPharmacia公司。二、構(gòu)建過程1、保護(hù)性目的片段的獲得依據(jù)國際互聯(lián)網(wǎng)的GenBank中這些亞單位的基因序列設(shè)計出含特異性酶切位點3對引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，如表l。表1重組菌K88-K99-LTB的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>模板DNA的制備按全菌裂解法進(jìn)行。以上述細(xì)菌為模板，通過PCR反應(yīng)獲得需要的3個目的基因片段，/"eG、/朋C、to大小分別為780bp、500bp、320bp，隨后將之連接到pGEM-Teasy載體，分別命名為p/aeG、p/a"C、pM>，通過酶切鑒定及序列測定，測序工作由上海聯(lián)合基因公司完成，證明獲得的是正確的片段。2、重組表達(dá)載體pFFLTB(pGEX-6P-l-/aeG-/^C-/A)的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶SamHI、歷"dlII將/^G從載體p/aeG切下，因載體pGEX-6P-1的酶切位點沖突，故中間引入克隆載體pBlueScript-SK，將載體pBlueScript-SK以相同的酶切體系進(jìn)行酶切純化回收，將兩種酶切回收片段以適當(dāng)?shù)哪柋冗M(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，經(jīng)酶切分析和鑒定，篩選出pBlueScript-SK/aeG陽性重組質(zhì)粒。按照上述方法，用限制性內(nèi)切酶H/miin、&/1對質(zhì)粒p/a"C和pBlueScript-SK-/aeG酶切，分別回收酶切片段，進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，篩選出pBlueScript-SK/aeG/朋C的陽性重組質(zhì)粒。按照上述方法，用限制性內(nèi)切酶I、loI對質(zhì)粒p她和pBlueScript-SK/aeG/^C酶切，分別回收酶切片段，進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，篩選pBlueScript-SK-/aeG-/fl"C-她(pFFLTB)的陽性重組質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶5應(yīng)HnoI將/"eG/朋C-她串聯(lián)片段從陽性重組質(zhì)粒pFFLTB切下，將質(zhì)粒載體pGEX-6P-l以相同的酶切體系進(jìn)行酶切純化回收，將兩種酶切回收片段以適當(dāng)?shù)哪柋冗M(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21，經(jīng)酶切分析和鑒定，篩選出pGEX-6P-l-/"eG-/^C-to的陽性重組質(zhì)粒，含該質(zhì)粒的重組菌命名BL21(pFFLTB)，即基因工程苗K88-K99-LT。重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建模式見圖1。三、基因工程菌K88-K99-LT表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE、Western-blot鑒定酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒pFFLTB轉(zhuǎn)化宿主菌BL21后，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并經(jīng)SDS-PAGE(詳見圖2)和Western-blot(詳見圖3)證明目的基因確已表達(dá)。重組質(zhì)粒pFFLTB轉(zhuǎn)化菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在約80kD處出現(xiàn)一特異性蛋白條帶，與預(yù)期的融合蛋白大小一致。圖2中1、未經(jīng)誘導(dǎo)的pFFLTB重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌2、pFFLTB重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌經(jīng)0.6mmol/LIPTG誘導(dǎo)后的融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物3、pFFLTB重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌經(jīng)1.0mmol/LIPTG誘導(dǎo)后的融合蛋白表達(dá)4、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)5、pGEX-6P-l質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后GST的表達(dá)產(chǎn)物圖3中1、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)2、樣品為重組菌K88-K99-LT經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的裂解產(chǎn)物，一抗為K88菌毛的抗血清3、樣品為重組菌K88-K99-LT經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的裂解產(chǎn)物，一抗為K99菌毛的多抗血清。四、基因工程菌K88-K99-LT的免疫效果本發(fā)明通過構(gòu)建表達(dá)大腸桿菌免疫保護(hù)性抗原K88、K99、LT基因的重組菌BL21(pFFLTB)，分別制備成油乳劑疫苗對小鼠進(jìn)行腹腔免疫，結(jié)果顯示經(jīng)重組菌免疫后的小鼠血清中，產(chǎn)生了分別針對K88、K99抗原特異性的IgG，相應(yīng)的抗體水平從免疫后7天開始逐步升高，在第二次免疫后21天左右達(dá)到了較高的水平，說明重組菌能夠同時誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的針對2種菌毛保護(hù)性抗原的抗體，并且在攻毒后對小鼠提供了較好的保護(hù)，針對K88、K99的標(biāo)準(zhǔn)菌株C83907、C83709的免疫保護(hù)率分別達(dá)83.3%、66.6%。其對小鼠免疫保護(hù)試驗的分組情況及免疫效果詳見表2，針對K88抗體變化情況見表3和圖4，針對K99抗體變化情況見表4和圖5。表2基因工程苗K88-K99-LT免疫試驗分組情況及免疫保護(hù)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>抗體IgG檢測值平均抗體檢測值土標(biāo)準(zhǔn)差，a、b、c有顯著性差異(P〈0.05);顯著性檢驗是不同疫苗免疫組以及健康對照組小鼠在免疫后相同時刻血清中抗體水平之間的比較。表4小鼠免疫基因工程苗K88-K99-LT后血清中針對K99抗原特異性IgG檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>上述數(shù)據(jù)直觀地說明了本發(fā)明涉及的重組菌能夠同時誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的針對兩種保護(hù)性抗原的抗體，在攻毒后對小鼠提供了較好的保護(hù)。本發(fā)明克隆并表達(dá)致初生仔豬腹瀉大腸桿菌免疫保護(hù)性抗原K88、K99、LT基因，從而研制出相應(yīng)的基因工程疫苗重組菌K88-K99-LT。經(jīng)過一系列免疫保護(hù)試驗，證明研制的預(yù)防初生仔豬腹瀉的大腸桿菌基因工程疫苗的高效性。<110>揚(yáng)州大學(xué)<120>初生仔豬腹瀉病的大腸桿菌基因工程疫苗K88-K99-LT及其構(gòu)建方法<160>6<210>1<211〉20<212〉DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)K88的主要亞單位基因faeG片段設(shè)計<400>1gtggatcctggatgactggt<210〉2<211>27<212>DNA<213〉人工序列<220><223>根據(jù)K88的主要亞單位基因faeG片段設(shè)計<400>2gtaagcttgtaataagttattgctacg<210>3<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)K99的主要亞單位基因fanC片段設(shè)計<400>3aagcttaatacaggtactattaacttcaatg<210>4<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>'<223>根據(jù)K99的主要亞單位基因fanC片段設(shè)計<400>4gtcgaccatataagtgactaagaaggat<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)LT的主要亞單位基因ltb片段設(shè)計<400>5gtcgscgctccccagactattacagaac<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)LT的主要亞單位基因ltb片段設(shè)計<400>6ctcgagctaccgttagtcatactttttgct權(quán)利要求1、初生仔豬腹瀉病的大腸桿菌基因工程疫苗K88-K99-LT，其特征在于由K88的主要亞單位基因/aeG片段、K99的主要亞單位基因/朋C片段、LT的主要亞單位基因to片段和原核表達(dá)載體pGEX-6P-l串聯(lián)組成。2、一種如權(quán)利要求1所述初生仔豬腹瀉病的大腸桿菌基因工程疫苗K88-K99-LT的構(gòu)建方法，其特征在于將擴(kuò)增出的K88的主要亞單位基因/"eG片段、K99的主要亞單位基因/朋C片段、LT的主要亞單位基因to片段，按/aeG/朋C-to方式定向串聯(lián)于原核表達(dá)載體pGEX-6P-l。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述初生仔豬腹瀉病的大腸桿菌基因工程疫苗K88-K99-LT的構(gòu)建方法，其特征在于用于擴(kuò)增K88的主要亞單位基因/aeG片段的引物是Pl:GTGGATCCTGGATGACTGGT5amHIP2:GTAAGCTTGTAATAAGTTATTGCTACG。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述初生仔豬腹瀉病的大腸桿菌基因工程疫苗K88-K99-LT的構(gòu)建方法，其特征在于用于擴(kuò)增K99的主要亞單位基因/aC片段的引物是P3:AAGCTTAATACAGGTACTATTAACTTCAATG倫孤P4:GTCGACCATATAAGTGACTAAGAAGGAT。5、根據(jù)權(quán)利要求2所述初生仔豬腹瀉病的大腸桿菌基因工程疫苗K88-K99-LT的構(gòu)建方法，其特征在于用于擴(kuò)增LT的主要亞單位基因to片段的引物是P5:GTCGACGCTCCCCAGACTATTACAGAACIP6:CTCGAGCTACCGTTAGTCATACTTTTTGCT。全文摘要初生仔豬腹瀉病的大腸桿菌基因工程疫苗K88-K99-LT及其構(gòu)建方法，屬于畜牧獸醫(yī)
技術(shù)領(lǐng)域：
。將擴(kuò)增出的K88的主要亞單位基因faeG片段、K99的主要亞單位基因fanC片段、LT的主要亞單位基因ltb片段，按faeG-fanC-ltb方式定向串聯(lián)于原核表達(dá)載體pGEX-6P-1，經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主菌BL21后，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot證明目的基因確已表達(dá)，該疫苗可有效預(yù)防初生仔豬腹瀉，安全性和免疫原性可靠。文檔編號A61P31/00GK101121937SQ20071002398公開日2008年2月13日申請日期2007年7月2日優(yōu)先權(quán)日2007年7月2日發(fā)明者劉秀梵,馬林艷,崧高申請人:揚(yáng)州大學(xué)