復(fù)合抗原序列及疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及復(fù)合抗原，其包含具有來源于一種或多種病原體的多種抗原表位的鄰接的氨基酸序列的肽，所述復(fù)合抗原在哺乳動物中誘導(dǎo)針對由所述一種或多種病原體的感染是保護(hù)性的免疫應(yīng)答。此外，本發(fā)明涉及包含復(fù)合抗原的疫苗并涉及用于治療和預(yù)防感染的方法。
【專利說明】復(fù)合抗原序列及疫苗
[0001] 相關(guān)申請的引用 本申請要求2012年1月26日提交的相同標(biāo)題的美國臨時(shí)申請?zhí)?1/591，113的優(yōu)先 權(quán)，其完整地通過引用并入。
[0002] 背景 1發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明涉及由多種表位構(gòu)成的復(fù)合抗原，并涉及用本發(fā)明的復(fù)合抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答的 工具和方法。本發(fā)明還涉及用于開發(fā)新型疫苗的包含來源于多種病原體的復(fù)合抗原序列的 組合物并涉及開發(fā)的疫苗。
[0003] 2背景描述 微生物和病毒病原體是動物中傳染病的主要來源。病原體及其宿主經(jīng)常以無盡的競爭 來適應(yīng)彼此，以存活并繁殖。某些病原體在感染哺乳動物宿主并存活于暴露在宿主免疫應(yīng) 答中已取得極大成功，甚至超過數(shù)年或數(shù)十年的時(shí)期。非常成功的哺乳動物病原體的一個 實(shí)例是流感病毒。
[0004] 流感病毒是主要侵襲人和其他脊椎動物的傳染性呼吸疾病(通常稱為流行性感 冒）的病原體。流感是高度傳染性的并且是自從遠(yuǎn)古時(shí)期就侵襲人類的急性呼吸疾病。將 傳染表征為復(fù)發(fā)性每年性流行病和周期性主要的世界范圍內(nèi)的大流行病。流感病毒感染可 以導(dǎo)致輕度至重度疾病，并甚至可以導(dǎo)致死亡。在美國每年平均有5-20%的人口患有流感， 并且多于200, 000人由于并發(fā)癥而入院治療，且超過36, 000人死亡。由于高度的疾病相關(guān) 的發(fā)病率和死亡率，流感的直接和間接社會經(jīng)濟(jì)影響是巨大的。在上個世紀(jì)發(fā)生了四次大 流行病，一共導(dǎo)致了全世界數(shù)千萬的死亡。
[0005] 流感病毒經(jīng)咳嗽或噴嚏從宿主向宿主傳播?？諝獠ドw沫是個體間主要的傳播載 體。在人中，病毒通常直接在人與人之間傳播，盡管人也可能由于與攜帶病毒的表面間接接 觸而被感染。受感染的成人在疾病的原發(fā)癥狀發(fā)生前少至一天開始對其他人是有傳染性 的。因此，這些人在之后長達(dá)5天或更多天仍有傳染性。不復(fù)雜的流感病通常其特征在于 體質(zhì)和呼吸癥狀的突然發(fā)生，包括發(fā)熱、肌痛、頭痛、不適、干咳、咽喉痛、鼻炎或這些癥狀的 一種或多種的組合。
[0006] 目前，致病性流感病毒的傳播在動物群體中通過接種和/或用一種或多種抗病毒 化合物治療來控制。含有滅活的流感病毒或簡單流感抗原的疫苗目前在世界范圍內(nèi)使用， 并且尤其促進(jìn)用于高風(fēng)險(xiǎn)群體諸如嬰兒、老年人、無足夠的健康護(hù)理的人和無免疫應(yīng)答的 個體。大部分所有用于疫苗使用的病毒在能繁殖的（fertile)母雞卵中繁殖，通過化學(xué)方 法滅活，并純化抗原。疫苗通常是三價(jià)的，含有代表性流感A病毒（H1N1和H3N2)和流感B 毒株。世界衛(wèi)生組織（WHO)定期更新特定毒株，其靶向針對被認(rèn)為會是最流行的并由此最 大化全世界效力的那些的疫苗開發(fā)。在大流行病期間的時(shí)期，更新的流感疫苗準(zhǔn)備上市銷 售前，通常需要8個月或更長。歷史上，病毒大流行病在4-6個月內(nèi)傳播到大部分洲，并且 未來的病毒大流行病可能由于增加的國際旅行而傳播得甚至更快。在第一波任何未來廣泛 傳播的爆發(fā)或大流行病期間由常規(guī)方法制備的有效疫苗將無法獲得或者非常短缺可能是 不可避免的。
[0007] 大流行的流感可能并且的確會在任何時(shí)候出現(xiàn)。盡管下一次流感大流行病的嚴(yán)重 性無法準(zhǔn)確預(yù)測，但建模研究暗示大流行病對美國的影響和世界整體而言將是重大的。在 缺少任何控制手段(接種或藥物）的情況下，已估計(jì)在美國"中等程度"的大流行病會導(dǎo)致： 89, 000-207, 000人死亡；314, 000-734, 000人入院治療；1800萬-4200萬人門診病人就診； 和另外的2000萬-4700萬人患病。根據(jù)疾病控制和預(yù)防中心（the Centers for Disease Control and Prevention (CDC)) (Atlanta, GA, USA) ,15-35% 的美國人口會受到流感大 流行病的影響，并且經(jīng)濟(jì)影響能夠在大約710億美元至1670億美元的范圍內(nèi)。
[0008] 能夠產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答的疫苗已經(jīng)在上半個世紀(jì)中產(chǎn)生。這些包括全病毒疫 苗、裂解病毒疫苗（split-virus vaccine)、和表面抗原疫苗和活減毒病毒疫苗。盡管任何 這些疫苗類型的制劑能夠產(chǎn)生全身性免疫應(yīng)答，但活減毒病毒疫苗具有還能夠刺激呼吸道 中局部粘膜免疫的優(yōu)點(diǎn)。
[0009] 隨著不同流感毒株的持續(xù)出現(xiàn)(或再次出現(xiàn))，持續(xù)開發(fā)出新型流感疫苗。由于流 感病毒間的快速突變率，已非常困難且有時(shí)不可能來以足夠時(shí)間鑒定出現(xiàn)的病毒毒株的抗 原部分以開發(fā)合適的疫苗。因此，新出現(xiàn)的或再次出現(xiàn)的病毒毒株的多肽和多核苷酸(尤其 是抗原基因的序列）是高度需要的。
[0010] 流感通常由兩個屬的流感病毒的感染導(dǎo)致：甲型流行性感冒病毒屬 (Influenzavirus A)和乙型流行性感冒病毒屬（Influenzavirus B)。第三個屬的流感 病毒丙型流行性感冒病毒屬（Influenzavirus C)作為單一種丙型流感病毒（influenza C virus)存在，其僅導(dǎo)致易感的哺乳動物中不嚴(yán)重的普通感冒樣癥狀。甲型流感病毒 (influenza A virus)和乙型流感病毒（influenza B virus)的感染通常在易感的哺乳動 物的上呼吸道的粘膜表面處開始。病毒復(fù)制主要限于上呼吸道，但可以擴(kuò)展到下呼吸道，并 導(dǎo)致可能是致命的支氣管肺炎。
[0011] 特別是甲型流感病毒具有許多不同的血清型。目前，在甲型流感病毒內(nèi)存在HA(參 與病毒與細(xì)胞結(jié)合的血細(xì)胞凝集抗原）的16種已知變異和NA (參與病毒釋放的神經(jīng)氨酸 酶抗原）的9種已知變異，因此產(chǎn)生基于單獨(dú)地這兩種蛋白內(nèi)的變異的甲型流感病毒的144 種可能的"HN"血清型。認(rèn)為在任何給定時(shí)間時(shí)這些組合的僅一小部分在易感人群內(nèi)傳播。 一旦新型流感毒株或血清型出現(xiàn)并散播，歷史模式是它在易感人群內(nèi)變得確定，并隨后流 動或"傳播"許多年，導(dǎo)致流感的季節(jié)性流行病。
[0012] 正粘病毒科（Orthomyxoviridae Family)目前包含流感病毒的三個屬： 甲型流行性感冒病毒屬、乙型流行性感冒病毒屬和丙型流行性感冒病毒屬。這 些屬的每一種包含流感病毒的單一種：屬甲型流行性感冒病毒屬由單一種甲型 流感病毒組成，其包括目前在人中傳播的所有流感病毒毒株，包括例如但不限于 111 ,\?, 111Κ2. 1 ?Κ2, i BKI. IΙ3Ν? 113NH. 畫 ΜI5N2 J 養(yǎng) 5M3, 1 隱 iNK, ! L別 Μ. 重· I IΠΝΙΙ17N4, 和 H10N7 血清 型。示例性的甲型流感病毒毒株包括但不限于.VAkhiG/Wi AMbska/?77. Λ/Alicc? Λ/Ληιι AfHwMmi A/Ilayern/7/y5, A/licijing/352/R9, A/l?eijing/353m A/Ilelhesdii/I/H5" A/Culilbmki/10/78, A/i^hicWCiermany/Nm AKfM\e/mX A/Dcnv^T/l/S?, A/Duncdin/ft/Sl, A/liquinc/Miami/l/ft3% Λ/1;Μ/1/47% ΛΛircal I^kes/().lHW65. A/Ciui/hou/S^H1), Λ/f long Kong/77, Λ/IIong Kiiiig/H/68, Λ/ilong KongMH^V1)?, A/Juhiirmcsburg/33/y4s Λ/Kawasaki/M/M% A/Kicn^/SWl1), A/Kiwa/l/HZ, A/Korca/42iViiH, A/Lcningmd/13/57, Λ/Lai^ AngdcsG/H?. A/Mal/3?2/54a Λ/Mcmphis/H/HS? A/KaiiclMiig/y33/95￥ Λ/Ncm- Jcrsey/K/76, Λ/Ν17?]/6ΗΚ A/MWS/33. Λ/Ι\*?η^2/71^ h/Pwt C；halrners/l/73〇 A/FR/K/34 Λ/Shanghai/11/K7, Λ/Shanghai/t WH9. AAShuiighui/3t/K^, //Singyp〇rc/l/5?e A/Singaporc/CVWi, A/,SoulhraroIma/l/lK!<)lH, A/Swine/197W3L AWwine/kwa/lSOa, Λ/Swmc^^^^ AASytlneW.VJ?, A/Iaiivan/l/KfK A/Iaiwaii/l/HftAL A/rcxaK/35/9L A/icxan/Sft/^K Λ/1 lH,SR/9()/?7, A/VicUwvjjyiy, A/Vieinam/i203/(14, Λ/Washington Ι).?/Η9?/Κ?), A/Weiss/43. A/WS/31 A/WS^/31 A/Wuhan/BW95, A/Wyoniing/I/87,和 A/YamagalLie：l/?y，以及其 衍生物、變體和同源物。
[0013] 屬乙型流行性感冒病毒屬由單一種乙型流感病毒組成，其中目前僅存在一個已知 的血清型。乙型流感病毒幾乎唯一地是人病原體，但比甲型流感毒株明顯更不常見，且遺傳 多樣性更低。由于該有限的遺傳多樣性，大部分人在早期年齡時(shí)獲得某一程度的乙型流感 病毒的免疫；然而，病毒的突變頻率足夠高以防止大部分人的持久性免疫，但沒有高至足以 允許乙型流感病毒在人群間的大流行性傳染。示例性的乙型流感病毒血清型包括但不限于 ?/Λ11ι·η/·Ι5, Β/Ληη Arbor/1/Η6, B/lkmgkt*/163/90, l!/Bcijing/m4/y3Ji/?rigil, B/G!il73W54, IVIkmg K_g/33W3>(H JWhmg K_g/5/71 B/lxe/4fS, ll/Maryland/i/5y, B/Mass/3/6ft, B/Oman/162lJft/2<l?l, B/Panaimi/45/y〇, 11/R22 llarhara, B/R5, B/R75, li/Russia/W, ?/Shandong/7/y7, B/.Sichuan/3?ywy, ll/iaiw^n/2/62, 紐,IVr?aWI/W, B/Vk_i;?/2/OT,和》/Yamagiila/】6/Wi 以及其衍生物、 變體和同源物。
[0014] 屬丙型流行性感冒病毒屬由表示為丙型流感病毒的單一種組成，其中目前僅存在 一個已知的血清型。已知該血清型感染靈長類動物和豬，并且雖然丙型流感病毒的感染是 罕見的，但所導(dǎo)致的疾病卻可能是嚴(yán)重的。然而，由于其在具有親密接觸的人中的快速傳播 性，丙型流感病毒的流行病在暴露的群體中并非不常見。
[0015] 來自這些毒株每一種的多核苷酸和多肽序列包含在National Center for Biotechnology Information (National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)的公開可獲的數(shù)據(jù)庫中，并且病毒原種可以獲自美國典型培 養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection) (Manassas, VA, USA)，或者另外是 公開可獲的。
[0016] 人流感病毒通常指在人中可傳播的流感病毒血清型。存在僅三種已知的近期在人 中廣泛傳播的甲型流感病毒HN血清型：H1N1、H2N2和H3N2。許多人已獲得了對這些亞型的 至少某些水平的免疫。然而，已知所有流感病毒頻繁地突變和改變。已知流感病毒感染水 禽和豬，并在形成新亞型的繁殖地（breeding ground)的那些宿主間傳播，并且毒株與人群 分開。由于許多血清型（并尤其是新出現(xiàn)的亞型）在人群中具有零或低患病率，因此在人群 中存在很少或不存在針對它們的天然免疫。這樣的群體被稱為對此類血清型是"未接種的 (naive) "。因此，可以預(yù)期流感病毒隨時(shí)間適應(yīng)以產(chǎn)生一種或多種高強(qiáng)毒株，其將傳染并在 未接種的人中災(zāi)難性散播，如在主流刊物中已廣泛報(bào)道的。
[0017] 例如，已報(bào)道高強(qiáng)毒株H5N1亞型(公開地稱為禽流感病毒)已充分突變而變得可從 禽類宿主向人傳播。由于該亞型在過去已被限定于感染禽類群體，因此在人群體中存在極 少或不存在感染的遺留（legacy of infection)來已產(chǎn)生免疫。因此，預(yù)期人群體對H5N1 是高度易感的。
[0018] 迄今為止，H5N1血清型似乎尚未充分突變以在人與人之間有效傳播。盡管如此，由 于流感病毒不斷適應(yīng)，因此存在這一憂慮，即將出現(xiàn)H5N1病毒或另一種強(qiáng)毒流感毒株或血 清型，其將能夠感染人并在人與人之間容易地散播。通常已暗示如果H5N1病毒會獲得在人 與人之間容易地傳播的能力，則世界范圍的疾病爆發(fā)（即，大流行病）可能開始，導(dǎo)致數(shù)百萬 的死亡。
[0019] 每年的流感爆發(fā)作為"抗原漂移"的結(jié)果發(fā)生?？乖朴稍谒拗魅豪镏袀鞑サ牟?毒亞型內(nèi)病毒蛋白的抗原（即，免疫刺激性）部分中的突變引起，其改變了宿主識別并針對 傳染病毒有效防御的能力，甚至當(dāng)病毒在群體中已傳播若干年時(shí)。減少宿主群體中現(xiàn)存的 免疫的抗原漂移通常在所謂的免疫顯性抗原或區(qū)域內(nèi)發(fā)生。免疫顯性抗原是屬于最容易且 最快速地由宿主免疫系統(tǒng)識別的病原體的那些抗原，并且因此，是針對入侵性病原體的絕 大部分免疫應(yīng)答的原因。通常，免疫顯性抗原存在于大部分暴露到環(huán)境的病原體的區(qū)域內(nèi)， 艮P，在病原體的外表面上或在病原體突出的部分上，并因此更容易地接近宿主免疫系統(tǒng)。
[0020] 在流感的情況中，免疫顯性HA和NA蛋白從病毒顆粒的中心殼體突出，并因此它們 趨于與宿主的內(nèi)部環(huán)境最強(qiáng)烈地相互作用，并控制宿主免疫應(yīng)答。在微生物基因組中發(fā)生 保護(hù)微生物免于宿主免疫系統(tǒng)的突變，這些突變最容易地發(fā)現(xiàn)會影響免疫顯性抗原。
[0021] 相反，非免疫顯性抗原是這樣的抗原，其能夠產(chǎn)生宿主免疫應(yīng)答，但僅占全部免疫 應(yīng)答的少量。認(rèn)為發(fā)生這一點(diǎn)是因?yàn)榉敲庖唢@性抗原至少部分地避開宿主免疫系，如同在 位于微生物表面的裂隙或褶皺中或者被微生物的突出部分所環(huán)繞的抗原的情況下。在流感 的情況下，出現(xiàn)在殼體表面附近的非免疫顯性抗原通過從表面上突出的免疫顯性HA和NA 突起（spikes)而避開宿主免疫系統(tǒng)。非抗原顯性抗原區(qū)域在響應(yīng)宿主免疫壓力時(shí)趨于比 免疫顯性抗原顯示出更低的突變。
[0022] 當(dāng)病毒中存在意外或突然的、主要的改變時(shí)，發(fā)生抗原漂移。抗原漂移通常由出現(xiàn) 病毒表面上HA和/或NA蛋白的新組合（S卩，產(chǎn)生新的流感亞型）來導(dǎo)致。新型甲型流感病 毒亞型(對其世界上大部分人群是未接種的)的出現(xiàn)是朝向大流行病的第一步。如果新型流 感亞型還具有在人與人之間容易地傳播的能力，則可以預(yù)期全面爆發(fā)的大流行病，其導(dǎo)致 傳染數(shù)百萬人的全球性流感爆發(fā)。
[0023] CDC和世界上疾病預(yù)防的領(lǐng)導(dǎo)機(jī)關(guān)建議預(yù)防流感的單一最佳方法是通過每年的接 種。然而，常規(guī)接種通常靶向HA和NA抗原，并且在預(yù)防疾病上既非普遍保護(hù)性的也非100% 有效的?？乖谱柚沽鞲幸呙绯蔀槠毡楸Ｗo(hù)性的，或阻止其在許多年保持有效性。常規(guī) 疫苗的無效性還可能是(部分地)由于抗原漂移和由免疫系統(tǒng)最通常識別的HA和NA蛋白的 抗原部分（即，免疫顯性抗原)內(nèi)產(chǎn)生的變異。結(jié)果是，由于流感不斷地改進(jìn)其對目前治療的 抗性，因此許多人可能發(fā)現(xiàn)他們對于流感病毒易感，卻無可用的有效治療方法。這種情況尤 其涉及關(guān)于H5N1病毒，其是高強(qiáng)毒的，但是對其目前卻沒有廣泛可用的商品化疫苗來免疫 易感人群。
[0024] 目前，由于每年出現(xiàn)新毒株，流感疫苗每年重新配制，并通常誘導(dǎo)有限的免疫。此 夕卜，為了實(shí)現(xiàn)保護(hù)性免疫應(yīng)答，一些疫苗用高劑量抗原施用。對于H5N1疫苗尤其是這樣。 此外，如同在自然中發(fā)現(xiàn)表位，流感疫苗(包括H5N1疫苗）通常以相同次序（in the same order)呈現(xiàn)該表位，通常呈現(xiàn)為全病毒蛋白；因此，需要相對大量蛋白來產(chǎn)生有效疫苗。結(jié) 果是，每一施用包括與劑量量相關(guān)的增加的成本，并且存在制造足夠劑量以接種普通公眾 的增加的困難。此外，使用更大的蛋白提高了受體宿主中不期望的免疫應(yīng)答的風(fēng)險(xiǎn)。
[0025] 因此，施用提供針對廣大范圍的不同毒株和/或病原體的變異的感染的保護(hù)的疫 苗和針對多種病原體是有效的疫苗，將是有利的。還將有利的是，施用單一或有限數(shù)目的 接種(所述接種將提供在不同病原體的選擇中的有效保護(hù)）和能夠在具有有限的免疫系統(tǒng) 功能的那些個體中是有效的疫苗。此類疫苗將可用于治療許多個體和群體，并可用于補(bǔ)充 (compliment)常規(guī)疫苗，所有這些均為盡可能多的個體提供針對群體中現(xiàn)有的以及新的和 出現(xiàn)的病原體的廣泛保護(hù)。
[0026] 發(fā)明概述 本發(fā)明提供了新型且有用的組合物，以及用于產(chǎn)生免疫應(yīng)答的工具和方法。具體而言， 本發(fā)明提供了從一種或多種病原體的多個抗原區(qū)開發(fā)的疫苗和方法。
[0027] 本發(fā)明的一個實(shí)施方案涉及包含具有來源于一種或多種病原體的多個抗原表位 的鄰接的氨基酸序列的肽的復(fù)合抗原，其在哺乳動物中誘導(dǎo)針對由該一種或多種病原體的 感染是保護(hù)性的免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，所述多種表位包含一種或多種復(fù)合表位。優(yōu)選地，所述 復(fù)合表位包含多種抗原表位，包含同一表位的一個或多個重復(fù)、不同表位的一個或多個重 復(fù)、復(fù)合表位的一個或多個重復(fù)、或其組合。還優(yōu)選地，所述復(fù)合抗原的至少一個表位的氨 基酸序列天然不存在。復(fù)合抗原可用于治療或優(yōu)選預(yù)防與一種或多種病原體相關(guān)的感染和 疾病，所述病原體包括但不限于病毒、細(xì)菌、寄生物、酵母、真菌、或其組合。優(yōu)選地，所述病 原體是流感病毒，并且所述一種或多種抗原表位是以下的氨基酸序列：Ml、M2、ΗΑ、ΝΑ、PB1、 或PB2蛋白、或其組合。示例性的復(fù)合序列包括但不限于SEQ ID NOs 4、5、8、19、20、52、53、 56 和 54 以及 SEQ ID NO 16、65、66、67、70和73。
[0028] 本發(fā)明的另一個實(shí)施方案涉及包含這樣的氨基酸序列的復(fù)合抗原，所述氨基酸序 列含有在多個保守區(qū)的表位序列之間相同的氨基酸和在多個保守區(qū)的表位序列之間不同 的氨基酸。優(yōu)選地，氨基酸序列具有式AnlBCAn2,其中A代表在多個保守區(qū)的表位序列之間 相同的氨基酸，B和C代表在多個保守區(qū)的表位序列之間不同的氨基酸，其中A、B和C是天 然存在的氨基酸，N1和N2總計(jì)少于25,并且B和C氨基酸的數(shù)目少于3。示例性的復(fù)合序 列包括但不限于SEQ ID N0. 6、7、21、22、54、55、58或59。優(yōu)選地，復(fù)合抗原包含來源于同一 病原體的多個血清型的肽序列的多個保守區(qū)。優(yōu)選地，所述病原體是流感病毒。
[0029] 本發(fā)明的另一個實(shí)施方案涉及與本發(fā)明的復(fù)合抗原特異性反應(yīng)的抗體。
[0030] 本發(fā)明的另一個實(shí)施方案涉及編碼本發(fā)明的復(fù)合抗原的多核苷酸。
[0031] 本發(fā)明的另一個實(shí)施方案涉及在哺乳動物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，其包括向所述 哺乳動物施用本發(fā)明的復(fù)合抗原。優(yōu)選地，產(chǎn)生的免疫應(yīng)答對于一種或多種病原體的多種 不同毒株、血清型或種類是保護(hù)性的。
[0032] 本發(fā)明的另一個實(shí)施方案涉及包含本發(fā)明的復(fù)合抗原的疫苗。優(yōu)選地，復(fù)合抗原 具有式AnlBCAn2,其中A代表在多個保守區(qū)的表位序列之間相同的氨基酸，B和C代表在多 個保守區(qū)的表位序列之間不同的氨基酸，其中A、B和C是天然存在的氨基酸，N1和N2總計(jì) 少于25,并且B和C氨基酸的數(shù)目少于3。
[0033] 本發(fā)明的其他實(shí)施方案和優(yōu)點(diǎn)部分地在其后的說明書中描述，并且部分地，可以 從該說明書中是顯而易見的，或者可以從本發(fā)明的實(shí)踐中知道。
[0034] 附圖描述 圖1 H3N2流感病毒（Wuhan)的肽(或P?。?、6、9、10和11的ELISA抗血清效價(jià)的概 述。
[0035] 圖2用H3N2流感病毒（Wuhan 1:40)的不同肽免疫小鼠的抗血清平均0D。
[0036] 圖3用P印6免疫后抗血清（1:100)對病毒和肽的平均0D。
[0037] 圖4用P印9免疫的小鼠對以不同稀釋度的H1N1 (Caledonia)病毒的抗血清效 價(jià)。
[0038] 圖 5 Pep 9 對 Wuhan 包被（A)和（C)和 Caledonia 包被（B)和（D)的新鮮的（A) 和（C)和固定的⑶和⑶的結(jié)合的比較。
[0039] 圖6來自用在Wuhan和Caledonia的固定的相比于新鮮的包被上俘獲的P印9免 疫的小鼠的抗血清效價(jià)。
[0040] 圖7用P印11免疫的小鼠對以不同稀釋度的H5N1的抗血清效價(jià)。
[0041] 圖8每一序列的另外的序列信息和相關(guān)信息（圖8-1至8-6)。
[0042] 發(fā)明描述 接種和疫苗通常是避免感染和防止使衰弱且危險(xiǎn)的病原體的傳播的最佳機(jī)制。關(guān)于病 毒感染和許多細(xì)菌感染，接種通常是唯一有效的選項(xiàng)，這是由于治療選項(xiàng)很少且可用的那 些僅提供有限的功效。常規(guī)接種需要推理的理解或病原體的現(xiàn)有抗原區(qū)的一般鑒定。病原 體自身繁殖，并且從熱殺死的或另外方式減毒的微生物開發(fā)合適的疫苗?；蛘?，鑒定在施用 后會產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答的抗原或抗原集合。關(guān)于預(yù)防由某些細(xì)菌和病毒的感染，對疫苗 的需求尤其緊迫。許多細(xì)菌和尤其某些病毒不斷地突變，經(jīng)常使針對之前的或起始的細(xì)菌 或病毒開發(fā)的疫苗針對出現(xiàn)的新毒株無效。結(jié)果是，針對感染的疫苗每年重新配制，并常常 以相當(dāng)高的劑量施用。制造成本高，并且施用疫苗對患者產(chǎn)生非常多并發(fā)癥及相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)。 [0043] 已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)可以從本發(fā)明的復(fù)合抗原中產(chǎn)生有效疫苗。復(fù)合抗原是含有 或者來源于病原體的多種抗原區(qū)的抗原。本發(fā)明的復(fù)合抗原可以含有一個表位，其代表兩 種或多種表位的保守區(qū)的組合(例如，如本文概述的復(fù)合表位)，或來源于一種或多種來源 (例如，病毒顆粒、寄生物、細(xì)菌、真菌、細(xì)胞）的多個免疫應(yīng)答區(qū)。這些免疫區(qū)是氨基酸序列 或表位，其代表在病原體的那些抗原區(qū)或其他抗原(其與感染或疾病相關(guān)，或重要的是與刺 激免疫系統(tǒng)以提供針對病原體的保護(hù)相關(guān)）處發(fā)現(xiàn)的序列。
[0044] 本發(fā)明的一個實(shí)施方案涉及復(fù)合抗原。本發(fā)明的復(fù)合抗原包含自然界中不存在的 非天然存在氨基酸序列并且是另外人工構(gòu)建的。復(fù)合抗原的每一序列包含多個病原體的免 疫應(yīng)答區(qū)或表位，將其人工排列，優(yōu)選沿單一氨基酸序列。所述多個可以含有來自一個或 多個病原體的多個相同表位(盡管不以天然發(fā)生次序)，或多個許多種不同表位。表位可以 與病原體的已知免疫區(qū)相同，或者與之前并不存在并因而是人工構(gòu)建的完全新的構(gòu)建體相 同。優(yōu)選地，本發(fā)明的復(fù)合抗原包括殺傷T細(xì)胞（T?；駽TL)應(yīng)答、輔助T細(xì)胞（T H)應(yīng)答和 在接種的哺乳動物中的特異性抗體產(chǎn)生。
[0045] "復(fù)合"抗原是工程化的、人工創(chuàng)造的抗原，其從兩個或多個組成表位構(gòu)成，從而使 所得的復(fù)合抗原具有不同于或者附加有各個組分表位的物理和/或化學(xué)特性。優(yōu)選的復(fù)合 抗原，當(dāng)暴露于哺乳動物的免疫系統(tǒng)時(shí)，能夠同時(shí)產(chǎn)生對復(fù)合物的每一種組成表位的免疫 應(yīng)答，并優(yōu)選地至大于各個組分表位的程度(例如，如從對鑒定的病原體的細(xì)胞或體液應(yīng)答 中可測量的)。此外，復(fù)合抗原當(dāng)用作疫苗和針對每一種組成表位時(shí)，提供在患者中產(chǎn)生保 護(hù)性免疫應(yīng)答的附加功能。優(yōu)選地，所述復(fù)合物具有提供不僅針對組分來源于其的病原體 而且還有相關(guān)病原體的保護(hù)的額外功能。這些相關(guān)的致病生物可以是同一種的生物的毒株 或血清型，或同一屬的生物的不同種，或僅由相同表位而相關(guān)的完全不同的生物。
[0046] 本發(fā)明的另一個實(shí)施方案涉及分離的表位。分離的表位是獲自或源自當(dāng)施用于哺 乳動物時(shí)引起強(qiáng)力的（robust)免疫應(yīng)答的病原體的蛋白或肽的區(qū)域。優(yōu)選地，強(qiáng)力應(yīng)答為 哺乳動物提供針對從暴露于病原體發(fā)生的疾病的免疫保護(hù)。分離的表位的優(yōu)選實(shí)例是復(fù)合 表位，其是從兩種或多種不同的但另外是相關(guān)的病原體的兩個或多個高度保守的(盡管不 相同）氨基酸序列的組合人工產(chǎn)生的表位。所述病原體可以是相同類型，但不同毒株、血清 型、或物種或其他相關(guān)。復(fù)合表位包含在相關(guān)表位之間相同的保守區(qū)，并且還包含不同的可 變區(qū)。代表兩個保守的但不同序列的組合的復(fù)合表位的序列可以如下所示 ： 表位1的序列…ΛΛΛΛΛ丨?ΛΛΛΛΛ... 表位2的序列…ΛΛΛΛΛΓΛΛΛΛΛ... 復(fù)合表位…ΛΛΛΛΛΒΓΛΛΛΛΛ… 其中，"Α"代表兩個高度保守表位之間相同的氨基酸，"Β"和"C"代表兩個表位之間分 別不同的氨基酸，"Α"、"Β"和"C"的每一個可以是任何氨基酸和任何數(shù)目的氨基酸。優(yōu)選 地，保守區(qū)在可變氨基酸的每一側(cè)包含約20個或更少的氨基酸，優(yōu)選約15個或更少，優(yōu)選 約10個或更少，優(yōu)選約8個或更少，優(yōu)選約6個或更少，并且更優(yōu)選約4個或更少。優(yōu)選地， 在兩個相似但不相同的保守區(qū)之間的氨基酸是5個或更少，優(yōu)選4個或更少，優(yōu)選3個或更 少，優(yōu)選2個或更少，并且更優(yōu)選僅1個。
[0047] "復(fù)合表位"類似于復(fù)合抗原，是工程化的、人工創(chuàng)造的單一表位，其從兩個或多個 組成表位構(gòu)成，從而使所得的復(fù)合表位具有不同于或者附加有組分表位的物理和/或化學(xué) 特性。優(yōu)選的復(fù)合表位，當(dāng)暴露于哺乳動物的免疫系統(tǒng)時(shí)，能夠同時(shí)產(chǎn)生對復(fù)合物的每一種 組成表位的免疫應(yīng)答，并優(yōu)選地至比通過各個組分表位單獨(dú)實(shí)現(xiàn)的更大的程度。此外，復(fù) 合表位當(dāng)用作疫苗和針對每一種組成表位時(shí)，提供在患者中產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答的附加功 能。優(yōu)選地，所述復(fù)合物具有提供不僅針對組分來源于其的病原體而且還有相關(guān)病原體的 保護(hù)的額外功能。這些相關(guān)的致病生物可以是同一種的生物的毒株或血清型，或同一屬的 生物的不同種，或僅由相同表位而相關(guān)的完全不同的生物。
[0048] 本發(fā)明的復(fù)合表位是完全人工分子，其不另外存在于自然界中，并且對其免疫系 統(tǒng)從未另外暴露過。優(yōu)選地，組合為復(fù)合表位的這些保守的免疫區(qū)代表在相關(guān)病原體之間 高度保守的蛋白和/或多肽的免疫應(yīng)答區(qū)。盡管疫苗可以開發(fā)自單一復(fù)合表位，但在許多 情況下，最有效的疫苗可以開發(fā)自多個、不同的復(fù)合表位。
[0049] 因此，本發(fā)明的復(fù)合抗原可以包含一個或多個復(fù)合表位和/或一個或多個已知表 位以提供有效的疫苗。盡管復(fù)合抗原可以包含單一復(fù)合表位，但復(fù)合抗原不會包含僅單一 已知表位。優(yōu)選地，用復(fù)合抗原、或復(fù)合抗原的組接種實(shí)現(xiàn)的免疫應(yīng)答提供了針對由所述復(fù) 合抗原的序列來源于其中的原始毒株導(dǎo)致的感染的保護(hù)，并且還提供了針對其他毒株、血 清型和/或物種(其共享一個或多個復(fù)合抗原中表示的通用保守區(qū)）的免疫保護(hù)。因此，用 復(fù)合抗原接種實(shí)現(xiàn)的所得的免疫應(yīng)答比常規(guī)單一抗原接種可實(shí)現(xiàn)的針對多種毒株、血清型 和物種或另外相關(guān)的病原體具有更廣泛保護(hù)性的，而無論在病原體進(jìn)化中是否可能發(fā)生抗 原漂移。優(yōu)選地，從本發(fā)明的復(fù)合抗原開發(fā)的疫苗避免了重復(fù)的或每年的接種的任何需要、 相關(guān)的并發(fā)癥和制造費(fèi)用、以及對患者升高的風(fēng)險(xiǎn)。這些疫苗可用于治療個體和群體，由此 預(yù)防感染、死亡和大流行病，并可用于補(bǔ)充（compliment)常規(guī)疫苗。
[0050] 如本文所討論，復(fù)合抗原優(yōu)選包含具有來源于一個或多個復(fù)合表位、一個或多個 復(fù)合表位加一個或多個已知表位、或多個已知表位(其可以是相同的或不同的）的序列的氨 基酸的單鏈。表位序列可以連續(xù)重復(fù)和沿復(fù)合序列不間斷的或在其他序列中散布開的(所 述序列可以是作為間隔序列或編碼肽的序列(共同間隔序列）的一個或幾個氨基酸)，并且 可以是非免疫原性的或免疫原性的，并且能夠在哺乳動物中誘導(dǎo)細(xì)胞（T細(xì)胞)或體液（B細(xì) 胞)免疫應(yīng)答。來自不相關(guān)微生物的肽序列可以組合入單一復(fù)合抗原。例如，所選的免疫應(yīng) 答肽的病毒序列可以由選自其他的微生物的保守序列或表位分散開，所述微生物諸如例如 細(xì)菌，諸如肺炎鏈球菌(S 銅綠假單胞菌0°. aarigifliosa)或金黃色葡萄 球菌(5： 優(yōu)選表位可以從其選擇的優(yōu)選的病毒蛋白包括但不限于流感病毒蛋白 卩8卩4、？8口0、碰、嫩、]\126、流感嗜血桿菌（}1.；[11；1^11161123)蛋白0和凝固酶。
[0051] 復(fù)合抗原的表位可以是任何序列和大小，但優(yōu)選由天然氨基酸構(gòu)成，并且長度多 于5個但小于35個氨基酸，優(yōu)選少于30個，優(yōu)選長度5-25個氨基酸，優(yōu)選長度8-20個氨基 酸，并且更優(yōu)選長度5-15個氨基酸。復(fù)合抗原優(yōu)選包含任何數(shù)目的復(fù)合的和/或其他表位。 針對特定病原體、病原體家族、或病原體組的復(fù)合抗原的表位的最有效數(shù)目可以由本領(lǐng)域 技術(shù)人員從本申請的公開內(nèi)容并使用常規(guī)測試程序來確定。復(fù)合抗原可以有效地具有一個 表位，優(yōu)選2個或更多個，3個或更多個，4個或更多個，5個或更多個或更多。任選地，復(fù)合抗 原可以包括表位之間一個或多個間隔序列，其可以是來源于相同或來源于一種或多種不同 病原體的抗原區(qū)的序列，或者用作免疫引發(fā)劑或另外提供對免疫系統(tǒng)的加強(qiáng)的序列。該加 強(qiáng)可以從氨基酸序列產(chǎn)生，所述氨基酸序列已知直接或作為佐劑刺激免疫系統(tǒng)。在一個優(yōu) 選的實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生針對流感病毒的免疫應(yīng)答的復(fù)合抗原包含HA和/或NA蛋白的 表位，和/或來源于流感病毒的不同血清型的相似保守區(qū)的新表位。還優(yōu)選的是這樣的復(fù) 合抗原，其包含結(jié)核分枝桿菌iMercw/iosis)和破傷風(fēng)梭菌 的蛋白的表位，和/或來源于這些細(xì)菌的不同血清型的相似保守區(qū)的新表位。
[0052] 本發(fā)明的另一個實(shí)施方案涉及一個或多個表位的鄰接的序列，其可以包含在天然 不存在且必須人工構(gòu)建的序列中來自于一種或多種病原體的的復(fù)合的和/或已知的表位。 優(yōu)選地，本發(fā)明的鄰接的序列包含一個或多個復(fù)合表位，其是對于多種病原體是相同的表 位的保守區(qū)的序列加在兩個保守區(qū)之間不同的那些氨基酸的組合。例如，在兩種病原體含 有區(qū)別僅在于單個氨基酸的相似保守區(qū)的情況下，復(fù)合序列將包括保守區(qū)氨基酸和如本文 討論的兩個區(qū)域之間不同的每一個氨基酸。
[0053] 還優(yōu)選的是本發(fā)明的復(fù)合抗原包含多個重復(fù)的表位，并且任選地，用每一表位之 間或環(huán)繞其的接頭區(qū)綴合的表位，和相同的或不同的多個表位。優(yōu)選的接頭包括相同或不 同病原體的抗原區(qū)的氨基酸序列，或有助于生成免疫應(yīng)答的氨基酸序列。優(yōu)選的實(shí)例包括 但不限于細(xì)菌諸如但不限于結(jié)核?。╰uberculosis)和病毒諸如但不限于流感的多種抗原 區(qū)的任一種。還優(yōu)選的是復(fù)合抗原包含產(chǎn)生T細(xì)胞應(yīng)答、B細(xì)胞應(yīng)答或兩種并結(jié)合對病原 體的特異性應(yīng)答的表位。
[0054] 本發(fā)明的另一個實(shí)施方案涉及用本發(fā)明的復(fù)合抗原免疫動物。獲自經(jīng)免疫的動物 的抗血清對復(fù)合抗原來源于其的病原體是有反應(yīng)性的。因此本發(fā)明的另一個實(shí)施方案是 獲自經(jīng)免疫的動物的抗血清，其可以進(jìn)一步純化用于測試或治療性用于向另一哺乳動物施 用，并由此提供針對來自一種或多種病原體的感染的保護(hù)。還優(yōu)選的是獲得的抗血清提供 廣泛的保護(hù)，不僅僅針對復(fù)合抗原來源的病原體，而且還針對可以是不同毒株、血清型或甚 至物種的另外的病原體。
[0055] 本發(fā)明的另一個實(shí)施方案是由復(fù)合抗原構(gòu)成的疫苗或從本發(fā)明的復(fù)合抗原開發(fā) 的抗血清。優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗對于病原體由于抗原漂移的抗原性變化更不敏感，其降低 或消除每年或重復(fù)接種以維持患者群體針對從新病毒分離株感染的潛在爆發(fā)的保護(hù)的需 要。此外，本發(fā)明的疫苗通常并有利地提供在其制造和施用（部分由于重復(fù)施用的本質(zhì)上降 低的需求）上增加的安全性考慮，相對長的貯存期(部分由于將由于毒株特異性漂移和漂變 (strain-specific shift and drift)而重新配制的需要降到最低)，以高特異性將免疫應(yīng)答 革巴向特定微生物表位的能力，和制備對于多種病原體(其每一種可以是同一病原體不同的 但是已知的毒株或物種)有效的單一疫苗的能力。本發(fā)明包括抗原和抗體組合物，制備此類 組合物的方法，和它們用于防止、治療、處理和/或預(yù)防感染的方法。本文公開的組合物以 及使用它們的方法，發(fā)現(xiàn)在使用免疫原性組合物和優(yōu)于本領(lǐng)域中目前可用的常規(guī)治療的方 法的病毒、細(xì)菌、寄生物和/或真菌致病和感染的治療和預(yù)防中的特定用途。
[0056] 本發(fā)明的另一個實(shí)施方案涉及在選定的哺乳動物群體中預(yù)防或控制感染，諸如例 如病毒、寄生物、真菌或細(xì)菌感染的爆發(fā)，優(yōu)選但不限于流感病毒和/或結(jié)核病細(xì)菌感染的 方法。該方法包括至少這樣的步驟：向群體的易感或處于風(fēng)險(xiǎn)中的成員提供免疫有效量的 一種或多種公開的免疫原性或疫苗組合物，以足以預(yù)防、降低、減少、減輕、控制或延遲此類 感染在一般群體中的爆發(fā)的次數(shù)。
[0057] 本發(fā)明的另一個實(shí)施方案涉及在有其需要的哺乳動物中產(chǎn)生針對感染(例如由流 感病毒)的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法。此類方法通常包括這樣的步驟：向有其需要的哺乳動物 提供免疫有效量的一種或多種本文公開的免疫原性組合物，在足以產(chǎn)生針對傳染性生物的 一種或多種物種、毒株、或血清型的此類保護(hù)性免疫應(yīng)答的條件下并以足以產(chǎn)生其的次數(shù)。 此外，本發(fā)明還提供向哺乳動物中至少第一細(xì)胞、組織、器官或器官系統(tǒng)施用預(yù)防性抗病毒 或抗微生物組合物的方法，其通常涉及向此類哺乳動物提供預(yù)防上有效量的至少一種如本 文公開的第一免疫原性組合物。
[0058] 本發(fā)明的另一個實(shí)施方案涉及免疫原性組合物，其包含具有一個或多個重復(fù)的肽 序列、或此類肽序列(其在相同或不同病原體中的多種蛋白之間是保守的）的片段、變體或 衍生物的本發(fā)明的復(fù)合抗原。復(fù)合序列來源于其的保守區(qū)可以在相同病原體或不同病原體 的亞類中是保守的。優(yōu)選的病原體包括但不限于細(xì)菌、病毒、寄生物、真菌和病毒。
[0059] 本發(fā)明的復(fù)合抗原還可以獲自或衍生自細(xì)菌序列，諸如例如以下的蛋白和/ 或多肽的多個或組合的表位，例如但不限于：鏈球菌屬（Sire/? iococcws )、假單胞菌屬 )、分枝桿菌屬ieritt?)諸如結(jié)核分枝桿菌(i￡ tuberculosis')、 志賀氏菌屬彎曲桿菌屬沙門氏菌屬流感 嗜血桿菌)、肺炎嗜衣原體（)、白喉 棒桿菌（Cbr_7/?6^ac i eritt? diphtheriae、、礙傷久後麗{Clostridium tetani、、物炎支 原體)、金黃色葡萄球菌(5?<3/成r/ococciAs aareiAs)、粘膜炎莫 拉菌(#〇/'<316^<3<^3?^/'/^<3// >5)、嗜肺軍團(tuán)菌(1(91§7'0/76^<3/7/7(9腫0/7力27 <3)、百日咳桿菌 (iferofe ?eBa /?6?r ?)、大腸桿菌(i^cAericAia co/i )諸如大腸桿菌 015 7，和上述任 何的保守區(qū)的多種或組合的表位（印itomes)。序列可以獲自或來源自的示例性寄生物包 括但不限于痕原蟲屬諸如惡性痕原蟲/a/cipa/--)和錐蟲屬 ()。示例性真菌包括但不限于煙曲霉d/7<9r^77/w5· --·5 )或黃曲霉 (As/76?r^77A/5· /7ara5〇。示例性病毒包括但不限于沙粒病毒、布亞病毒、冠形病毒、纖絲病 毒、嗜肝DNA病毒、皰疫病毒、正黏病毒、細(xì)小病毒、小核糖核酸病毒（picornaviruses)、乳 頭瘤病毒、呼腸孤病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、桿狀病毒和披膜病毒。優(yōu)選地，病毒表位獲自或來源自 流感病毒(例如副黏病毒）的序列。
[0060] 在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，復(fù)合抗原包含來源于流感病毒亞型(例如具有改變 的HA或NA組成的流感病毒，諸如H1N1、H5N1、H3N2和H2N2)的保守區(qū)。NA或HA上保守區(qū) 的表位還可以賦予交叉亞型免疫。作為實(shí)例，NA(N1)上的保守表位可以賦予對H5N1和H1N1 增強(qiáng)的免疫。關(guān)于在亞類中甲型流感亞型和/或毒株中的相似或同系的化合物，優(yōu)選存在 至少約80 %、更優(yōu)選至少約90 %、更優(yōu)選至少約95 %相同，更優(yōu)選至少約96 %相同，更優(yōu)選 至少約97 %相同，更優(yōu)選至少約98 %相同，更優(yōu)選至少約99 %相同，和甚至更優(yōu)選100 %相 同(非變體)。優(yōu)選地，在復(fù)合抗原內(nèi)的至少一個肽序列對于至少兩個病毒顆粒，優(yōu)選流感顆 粒的同源蛋白（例如蛋白亞基)也是保守的。流感病毒的蛋白包括例如在病毒結(jié)構(gòu)中表達(dá)的 蛋白，諸如HA、NA、蛋白聚合酶（PB1、PB2、PA)、基質(zhì)蛋白（M1、M2)和核蛋白（"NP"）。優(yōu)選 地，保守的肽序列在Ml、M2、HA、NA的至少兩個或多個，或一種或多種聚合酶蛋白上是保守 的。
[0061] 在優(yōu)選的實(shí)例中，H5N1流感病毒的Ml和M2蛋白中所選序列對應(yīng)于在其他H5N1顆 粒中發(fā)現(xiàn)的Ml和M2蛋白，并且對應(yīng)于在H3N2流感病毒的Ml和M2蛋白中的相同序列。此 夕卜，盡管HA和NA蛋白具有高可變區(qū)，來自HA和NA的保守序列在許多流感毒株和許多亞型 中被發(fā)現(xiàn)(例如，HA和NA序列在H5N1和H1N1中是保守的)。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中， 復(fù)合序列來源于單一流感病毒亞型和更優(yōu)選至少兩種流感病毒亞型(例如甲型流感病毒的 亞型）中的變體或毒株(表達(dá)基本上相同的HA和NA蛋白的病毒分離株，但其中HA和NA蛋 白氨基酸序列顯示一些微小漂變）內(nèi)呈現(xiàn)的保守序列。
[0062] 在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供復(fù)合肽或多肽，其包括至少一種表位抗原，所述 表位抗原包含一個或多個重復(fù)出現(xiàn)的表位序列（其每一個在在流感病毒毒株或血清型的群 體中保守的多種同源蛋白間是保守的)，和藥學(xué)上可接受的載體。在示例性的復(fù)合抗原中， 至少一種表位序列重復(fù)至少一次，優(yōu)選至少兩次，更優(yōu)選至少三次。在其他實(shí)施方案中，所 述至少一種表位序列重復(fù)四次或更多次。優(yōu)選地，復(fù)合序列與至少兩種傳播的病毒分離株 的同源蛋白亞基中的序列相同。在每一個實(shí)施方案中，組合物可以包括藥學(xué)上可接受的載 體。
[0063] 在另外優(yōu)選的實(shí)施方案中，復(fù)合肽序列包括來源于流感病毒的基因組（即RNA)區(qū) 段7的序列，而在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，序列包括至少部分的Ml和M2蛋白。在其他優(yōu)選的 實(shí)施方案中，復(fù)合序列包括表達(dá)自編碼HA或NA蛋白的基因組區(qū)段的序列。此類序列受亞 型漂變的影響更小，且對感染有更廣泛的保護(hù)性。
[0064] 在另外的實(shí)施方案中，復(fù)合抗原包括一種或多種T細(xì)胞刺激性表位，諸如白喉類 毒素、破傷風(fēng)類毒素、多糖、脂蛋白、或其的衍生物或任何組合(包括其的片段或變體)。通 常，復(fù)合抗原的至少一個重復(fù)序列包含于作為T細(xì)胞刺激性表位的相同分子內(nèi)。在基于蛋 白的T細(xì)胞刺激性表位的情況下，復(fù)合抗原的至少一個重復(fù)序列可以包含在作為T細(xì)胞刺 激性表位的相同多肽內(nèi)，可以與其綴合，或可以以其他方式相連。優(yōu)選地，將至少一個重復(fù) 的序列整合入本發(fā)明的復(fù)合抗原中的一種或多種T細(xì)胞刺激性表位內(nèi)或其側(cè)。
[0065] 在另外的實(shí)施方案中，復(fù)合抗原(具有或不具有相連的T細(xì)胞刺激性表位）可以包 括一種或多種多糖或其部分。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，復(fù)合抗原的至少一個序列與一種或多 種多糖綴合。在其他的實(shí)施方案中，一種或多種多糖與復(fù)合抗原的其他部分綴合。本發(fā)明 的某些實(shí)施方案選自多肽疫苗、蛋白-多糖綴合疫苗、或其組合。
[0066] 本發(fā)明的復(fù)合抗原可以通過體外化學(xué)合成、固相蛋白合成、和體外(無細(xì)胞）蛋白 翻譯來合成，或者重組工程化并表達(dá)在細(xì)菌細(xì)胞、真菌、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞、病毒顆 粒、酵母等中。
[0067] 優(yōu)選的復(fù)合抗原包括至少一種以下元件：至少一條重復(fù)的復(fù)合序列；至少一個T 細(xì)胞表位；至少一種多糖；至少一種多核苷酸；至少一種結(jié)構(gòu)組分；或其組合。至少一種結(jié) 構(gòu)組分可以包括以下的一種或多種：至少一個結(jié)構(gòu)區(qū)段；至少一個糖結(jié)合部分；至少一個 核苷酸結(jié)合部分；至少一個蛋白結(jié)合部分；至少一個酶部分；或其組合。本發(fā)明包括制備免 疫原性組合物，優(yōu)選藥物組合物，更優(yōu)選疫苗的方法，其中本發(fā)明的靶抗原伴隨藥學(xué)上可接 受的稀釋劑、賦形劑、或載體，并可以與大部分任何佐劑使用。
[0068] 在本發(fā)明的上下文內(nèi)，相對少量的保守或中性取代(例如1或2個）可以在本文公 開的復(fù)合抗原的序列或表位序列內(nèi)進(jìn)行，而不會明顯改變對所述肽的免疫應(yīng)答。在一些情 況下，在具體肽中的一個或多個氨基酸的取代可以實(shí)際上用于增強(qiáng)或另外改進(jìn)肽在哺乳動 物中引發(fā)免疫或T細(xì)胞應(yīng)答的能力，所述哺乳動物已被提供有包含修飾的肽、或編碼所述 肽的多核苷酸的組合物。合適的取代通?？梢允褂糜?jì)算機(jī)程序來鑒定，并且此類取代的作 用可以基于用抗血清和/或T細(xì)胞的經(jīng)修飾的肽的反應(yīng)性來確定。因此，在某些優(yōu)選的實(shí) 施方案中，用于公開的診斷和治療方法的肽可以包含其中一個或多個氨基酸殘基由一個或 多個替換氨基酸所取代的一級氨基酸序列，從而使經(jīng)修飾的肽與抗原特異性抗血清和/或 T細(xì)胞系或克隆反應(yīng)的能力不明顯低于未經(jīng)修飾的肽的。
[0069] 如上所述，優(yōu)選的肽變體是含有一個或多個保守取代的那些。"保守取代"是這樣 的取代，其中將氨基酸取代為另一個具有相似特性的氨基酸，從而使肽化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人 員將預(yù)期所述肽的二級結(jié)構(gòu)和親水性質(zhì)沒有明顯改變。氨基酸取代通?？梢曰跉埢臉O 性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親性質(zhì)中的相似性來進(jìn)行。例如，帶負(fù)電荷氨基 酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；并且有不帶電極性頭基 具有相似親水性值的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺 和谷氨酰胺；和絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。代表保守改變的氨基酸取代的實(shí)例包 括：（1) 一個或多個Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gin、Asn、Ser、或Thr殘基用來自相同組的一 個或多個殘基替換；（2) -個或多個Cys、Ser、Tyr或Thr殘基用來自相同組的一個或多個 殘基替換；（3) -個或多個Val、Ile、Leu、Met、Ala或Phe殘基用來自相同組的一個或多個 殘基替換；（4) 一個或多個Lys、Arg、或His殘基用來自相同組的一個或多個殘基替換；和 (5) -個或多個Phe、Tyr、Trp或His殘基用來自相同組的一個或多個殘基替換。變體可以 還或者可替代地包含非保守改變，例如，通過用來自組（2)、組（3)、組（4)或組（5)的氨基酸 殘基取代來自組（1)的氨基酸殘基之一。變體可以還(或可替代地)例如通過缺失或添加氨 基酸(其對于肽的免疫原性、二級結(jié)構(gòu)和親水性質(zhì)具有最小影響）來修飾。
[0070] 表位可以在復(fù)合序列中相對于彼此以任何順序排列。兩個或多個表位序列之間的 間隔氨基酸數(shù)目可以是任何實(shí)際范圍，包括例如在相鄰表位之間從1個或2個氨基酸至3、 4、5、6、7、8、9或甚至10個或更多個氨基酸。
[0071] 本發(fā)明的另一個實(shí)施方案涉及多核苷酸，其包括編碼本發(fā)明的復(fù)合序列的DNA、 RNA和PNA。這些多核苷酸可以是單鏈的(編碼或反義）或雙鏈的，并可以是DNA (基因組、 cDNA或合成的）或RNA分子。另外的編碼或非編碼序列可以（但不必須）存在于本發(fā)明的 多核苷酸內(nèi)，并且多核苷酸可以（但不必須）與其他分子和/或支持材料連接。如本領(lǐng)域普 通技術(shù)人員將理解的，作為遺傳密碼簡并性的結(jié)果，存在許多編碼給定的一級氨基酸序列 的核苷酸序列。這些多核苷酸中的一些與任何天然基因的核苷酸序列具有最小同源性。盡 管如此，由于密碼子選擇中的差異而不同的多核苷酸由本發(fā)明具體考慮。編碼免疫原性肽 的多核苷酸通?？捎糜隗w外或體內(nèi)產(chǎn)生肽。任何多核苷酸可以進(jìn)一步修飾以增加體內(nèi)穩(wěn)定 性?？赡艿男揎棸ǖ幌抻谠?'和/或3'端添加側(cè)翼序列；在骨架中使用硫代磷酸酯 或2' 甲基而非磷酸二酯酶鍵；和/或包括非傳統(tǒng)堿基諸如肌苷、Q核苷（queosine)和 懷丁苷，以及乙酰基-甲基、硫代-或其他修飾形式的腺嘌呤、胞苷、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿 苷。
[0072] 本發(fā)明的另一個實(shí)施方案包括針對流感接種個體的方法，其包括向需要流感接種 的患者施用治療上或預(yù)防上有效量的流感疫苗，所述流感疫苗包括包含一種或多種重復(fù)出 現(xiàn)的復(fù)合的或其他序列（其每一種在多種流感病毒顆粒中的多種同源蛋白間是保守的）的 復(fù)合抗原，和藥學(xué)上可接受的載體，以在患者中提供可檢測的針對流感的免疫應(yīng)答。
[0073] 本發(fā)明的另一個實(shí)施方案涉及編碼本發(fā)明的復(fù)合抗原的核苷酸或DNA疫苗。本發(fā) 明的DNA疫苗包含復(fù)合抗原的基因序列，加上提供在細(xì)胞中復(fù)合抗原的表達(dá)的其他必需序 列。通過用遺傳工程化的DNA注射哺乳動物，復(fù)合抗原在細(xì)胞中或優(yōu)選在細(xì)胞上產(chǎn)生，其 由哺乳動物的免疫系統(tǒng)識別并由此產(chǎn)生針對復(fù)合抗原和因此對病原體的體液或細(xì)胞應(yīng)答。 DNA疫苗具有相對于常規(guī)疫苗的許多優(yōu)點(diǎn)，包括在哺乳動物中誘導(dǎo)更普遍的和完全的免疫 應(yīng)答的能力。因此，DNA疫苗可以用于針對由病毒、細(xì)菌、和寄生物來源的許多不同的致病 生物以及某些腫瘤引起的疾病來保護(hù)哺乳動物。
[0074] DNA疫苗通常包含所含有的細(xì)菌DNA，其編碼包含在載體或質(zhì)粒中的復(fù)合抗原，所 述載體或質(zhì)粒已被遺傳修飾以將復(fù)合抗原序列轉(zhuǎn)錄并翻譯為來源于病原體的具體蛋白序 列。通過實(shí)例，疫苗DNA注射入身體的細(xì)胞中，其中細(xì)胞機(jī)（cellular machinery)轉(zhuǎn)錄并 翻譯DNA為復(fù)合抗原。非天然的并且不能由哺乳動物免疫系統(tǒng)所識別的復(fù)合抗原由細(xì)胞處 理并且處理后的蛋白（優(yōu)選表位）展示在細(xì)胞表面。識別這些復(fù)合抗原為外源物后，哺乳動 物的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生保護(hù)哺乳動物免受感染的合適的免疫應(yīng)答。此外，本發(fā)明的DNA疫苗優(yōu) 選對目標(biāo)哺乳動物細(xì)胞(諸如但不限于小鼠或人細(xì)胞）中的表達(dá)進(jìn)行密碼子優(yōu)化。在優(yōu)選 的實(shí)施方案中，密碼子優(yōu)化涉及對于具體細(xì)胞類型選擇期望的密碼子選擇偏好(在編碼DNA 中同義密碼子出現(xiàn)的頻率）從而期望的肽序列被表達(dá)。
[0075] 本發(fā)明的另一個實(shí)施方案涉及在藥學(xué)上可接受的組合物中的治療性和預(yù)防性藥 齊U，其用于向細(xì)胞或動物單獨(dú)地或與一種或多種預(yù)防和/或治療的其他藥征（modalities) 組合施用。本發(fā)明的治療性和預(yù)防性藥劑包括復(fù)合抗原、復(fù)合表位、含有復(fù)合抗原和表位的 組合物、復(fù)合序列、本發(fā)明的DNA疫苗、本發(fā)明的抗體、和/或?qū)Ρ景l(fā)明的復(fù)合抗原引發(fā)或 暴露的T細(xì)胞。藥學(xué)上可接受的賦形劑和載體溶液的配制對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是熟知 的，如同對于在多種治療方案中使用本文描述的具體組合物的合適的給藥和治療方案的開 發(fā)。
[0076] 免疫原性組合物的量和施用此類免疫原性組合物所需的時(shí)機(jī)將在具有本教導(dǎo)的 益處的普通技術(shù)人員的范圍內(nèi)。治療上有效的、藥學(xué)上有效的、和/或預(yù)防上有效的量的公 開的免疫原性組合物的施用可以通過單次施用（諸如例如遞送藥劑的足量的單次注射）來 實(shí)現(xiàn)，以向接受此類程序的患者提供期望的益處。或者，在某些情況下，可以期望在相對短 的、或甚至相對延長的時(shí)期上提供多次、或連續(xù)的免疫原性組合物的施用，如同通過醫(yī)療從 業(yè)者監(jiān)視此類組合物向所選的個體施用可以確定。
[0077] 本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗優(yōu)選以與劑量制劑相容的方式，并以如將是預(yù)防 上或治療上有效的并優(yōu)選是免疫原性的這樣的量來施用。待施用的量依賴于待治療的個 體，包括例如患者免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力，和期望的保護(hù)的程度。合適的劑量范圍可 以在每次接種幾百微克（Kg)活性成分的數(shù)量級上，并優(yōu)選范圍為約0.1 Kg_2000 Pg (甚 至更高量，諸如例如也考慮在約1 mg至約10 mg的范圍），諸如在0.5 Pg-1000 Pg的范圍， 優(yōu)選在約1 Kg至約500 Pg的范圍，并尤其在約10 Pg至約100 Pg的范圍。初始施用和加 強(qiáng)注射的合適方案還是可變的，但一般為初始施用，隨后為任選的但優(yōu)選后續(xù)接種或其他 周期性施用。
[0078] 在某些實(shí)施方案中，劑量將由約1 Pg至約1 mg總蛋白或目標(biāo)抗原的范圍組成。在 一個示例性實(shí)施方案中，疫苗劑量范圍為約0.1 Kg至約10 mg。然而，基于遞送的肽的量， 技術(shù)人員可以優(yōu)選調(diào)整劑量。在任一種情況下，這些范圍僅僅是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以 根據(jù)常規(guī)給藥技術(shù)從其偏離的指導(dǎo)方針。精確劑量可以通過評估在合適宿主中產(chǎn)生的綴合 物的免疫原性來確定，從而使免疫上有效的劑量被遞送。免疫上有效的劑量是這樣的劑量， 其刺激患者的免疫系統(tǒng)以建立針對免疫原性組合物或疫苗的免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，獲得由微 生物感染引起的針對疾病的足以提供長期保護(hù)的免疫記憶的水平。本發(fā)明的免疫原性組合 物或疫苗優(yōu)選與佐劑配制。"長期"優(yōu)選表示超過至少約6個月的時(shí)期，超過至少約1年，超 過至少約2-5年，或甚至少約2年至約10年或更長。
[0079] 本發(fā)明的另一個實(shí)施方案涉及對如本文描述的復(fù)合抗原及其保守變體特異性的 抗體。對這些多肽特異性的抗體例如用于診斷和治療目的，其例如與目標(biāo)多肽的活性、分布 和表達(dá)相關(guān)。本發(fā)明的抗體可以是類IgG、IgM、IgA、IgD或IgE，并且包括但不限于多克隆 抗體、單克隆抗體、多鏈或單鏈抗體，包括單鏈Fv (sFv或scFv)抗體(其中可變重鏈和可變 輕鏈連接到一起(直接或經(jīng)肽接頭）以形成連續(xù)多肽)，和人源化或嵌合抗體。
[0080] 本發(fā)明的復(fù)合肽的特異性抗體可以通過本領(lǐng)域熟知的方法產(chǎn)生。此類抗體可以包 括但不限于多克隆、單克隆、嵌合、人源化、單鏈、Fab片段和通過Fab表達(dá)文庫產(chǎn)生的片段。 產(chǎn)生多克隆和單克隆抗體的大量方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，并可以適合于產(chǎn)生對 本發(fā)明的和/或由本發(fā)明的多核苷酸序列編碼的多肽特異性的抗體（參見例如，Coligan Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; Paul (編輯）（1991) ; (1998) Fundamental Immunology Fourth Edition, Lippincott-Raven, Lippincott Williams & Wilkins; Harlow 和 Lane (1989) Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, USA; Stites 等（編輯）Basic and Clinical Immunology (第 4 版） Lange Medical Publications, Los Altos, CA, USA 及其中引用的參考文獻(xiàn)；Goding， Monoclonal Antibodies:Principles and Practice (第 2 版）Academic Press, New York, NY, USA; 1986;和 Kohler 和 Milstein (1975)。
[0081] 以下實(shí)施例說明了本發(fā)明的實(shí)施方案，但不應(yīng)該視為限制本發(fā)明的范圍。 實(shí)施例
[0082] 序列 以下是示例性序列的列表。這些序列包括復(fù)合序列以及可以組合以形成本發(fā)明的復(fù)合 序列的目標(biāo)序列。 Sl^lDNOl VQllimH.mSI 序則 HI H5 smmmri KmuHhmi MVi j SI:X^H1 NO 3 董y Μ?.Pirp 5.1 %m Hi NO4 (·ΗΛΡ(ΙΙΛ 表位：Fep I) Sl-；Qli)NC)5 CIMLiAPfilA 衣J\sp2i SI；QIl)N〇6 CJNI J:IAI> pEQ It> SO% 4^15^]?^pep3| SHQ1PNOT <?ΝΙ-?:,\1，<SEQ _|) N《)s 4和5的|￡合I'f:列》 Hl.QlDNOK IlYHWmSA 表位；iVp ⑴， HI-;Q ID NC)*J mThVI.：T隨 S1*.Q II) NO m liE.hVirmRN SliQiUNOII l._TliVHTW_H ShQIDN?32 IWHC?Y?iSI VQI!Plil：rCH.|NI fll N5* SI；〇Il)N?13 hVl'TI餐Nh SH) ID NO 34 H.UiDHTPmNHWW ITIWKITmY醬ΚΛΝ?^ΚΠ--ΓΠ: SI^IDNCH? 《?ΜΜΛΚΚ·;ΗΛΜΙΥΙΙΓ^?ΙΙ\?Ι:Γ8《?9ΥΙΚΛΝΝΚΙ?αΤ_·:Ι1Υ IMUmRNinWRNl;: %ΗφΙ)Ν《》·? ClNIJ:lAKlNlJ-iAPQYII<A^SICl*lCri r]*,CL\IJ;lAP (SEQ IIJNOC* , SI'Q !l.) MO II) rsx)i%u._ S!vQ ID 購復(fù)合序列 > SI*.Q --) NO 17 ilYI:H：HC'Yim*\SC；YKCiSI ν^ΙΙΡ!；?；Ι'ΟΙ_Ι?ν?：Ι:? ^CTQYIKAN SKMCiirii, si. id mo IK mιl·^ιψmnssιm-!^A(u^?%?τm:pγys--w Kl-Q H) NO 1!J IW< 劃I，（I 丨Λ 表位》 81? 11：) NO 211 IWiiVIlIIPlHA :-- ) K1;；Q 10 NO 21 iWt?\·? 1?P (St:Q TO -\€>s. 1 f 和M_ K 合序列） ShQ ID M)22 1\￥0農(nóng)￥|劃|*(!#:〇11》分知,1警和2?的4[合序列：| KI-；Q 11) NO 23 KSCmiHrYW-lMCM SUQ 11) NO24 Ι』.ΤΗν?·.ΤΜΙ<!\?5ΓΙ;η.:ν?·:ΤΗΜΝΙ·.\ν(;(Μ2ι>'4Η1} SI*：Q II) NO 25 I i-IliVliTI*[RNtiW < M2c MR ) Sl:,Q II? NO 26 Ι1；Ι?ν?:；ΤΙ·ΙΚΜΛΓ?(Μ2? > SHQ m NO 27 I.lliVim^RNlimCe Hf/： 3 ,SI>；Q 11) NC)2S I.TKVHl'PIRMl-.WiMSe ￠1? J KUQ IHN02y LTHVKrWKNBW; < Ml .表位） .SI;Q ill NO Ml MSIj.THVHT"\12t' 雀位} .Sl-0 ID NO 31 MSIiTl::Vl::l1?(M2c 表位} >>!·；0 ID NO 32 ,\?l,t,THVBTW!M2e 表位 I Sl-Q ID NO W MSLi ;mWTI聰 < M2c 表位} .S1:Q ID NO 34 .VISIJ ---ΥΙιΓΡΙΚΝ (M2e ? H!-：Q 11) NO 35 MSliThVFmRMUMSt:表位) II) NC)3li MSI,1 +ΤΚν?:：Γ1_1ΚΝ1.:ΙΡ?<Μ·: <:M2c 灰位 J ,S!-；0 ID NO 37 MSI,i ,T1 iVIΓΓΙ?ΚΝl^W (M2c M ft > KI'CJ H) N03K MSIjm:.VI::mRNmW(n.M2c :表位） ,SI-；Q 11) NO.W MSI J.II-lVHl'PlIiNliWfK'RCNDSKI) (M2c iW.) SHQ II) NO 40 Sli,TI-￥lil'(M2e ΜΛ i SHQ 10 NO 41 義位.1 KI*：Q H) NO42 Si ni^VIill^RNl^W iM2c ，Mff. i Si：Q ID NO 43 8?,Τ!Λ?'?Ρ·ΜΓΛ>'?."Μ1 表位 s SV.Q I!) NO 44 SI J ：n-：Vl-：11*iRMl?.WC ilTIKNI*； (M2t- M￥i > SI;；Q II) NO45 ΧΙ.Π?Λ--ΡΙΜΜΓ^?ΠΤΙΚΝΙ'ΤΡΙΚΧΗ?ΜΙ :義位） ID NO 4ft 級,ΙΤΗν?-ΤΡΙΚΝΗ'Λ?ΓΙ-ΜΚΝΗΤΡΙΙ?ΝΠΤΡΙΙ?ΜΗΜ：^ #位》 S1:Q II) NO 47 SI J .11 >：V 1 ；1 T*1RNi :W{ il J .11 -； VI ：1 IKAMSK1 -K1Π1 ·. i M2c ) K1：Q ID NOM ΓΙ·ν}·1--ΜΝΙ·：?Μ2?： MU I .S|-；Q H) NOW ll'lRNH hi*:q mn05n vimmm: SUQ 10 NO51 ντΚΒ?ν?Τ)ΙΙ^?ΝΚΠ?\?1 麗（KVTRI#Y\fS(l)PWY!K ANSKHCJITl·. ShQ II) NO52 WiillllilMHA Μ^\?\ S1;；Q ID M)53 WGVIIIlPillA Pep 4) m：Q 1I)M>54 WCWIIIIIP (SEQ 1? NOs 52|?53--Μ合序列；Pep 6) KI*Q II) NO 55 WWVlim，iSEQ ΙΙ? 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'dim (；CV\CtiCXX\4A(\MXt^KMXXlKX；tXXt\ACH；CMXiCT'|)Ctf#；1tTllir :#l?5a-iJcSRQ 10 排J核Ι?酸淨(jìng)列I SI-X^ID MO 70 SlilAYC ?IVKI'VHl jlVCL^i)f^?^lJlΛI(xiàn))W<lV^IIlIPfIYl·；l·.ΓSC·γSRP--Ij lVl；YI,QVfSI?M(f RI)iKV0I?MHJΛNSi^lΛ?JJM：li.KΛyPDi-：SlJWl)!^^1^11?WYiK>W-?i--HVVMFV￠?C}0SH iYSinVYQPAtXiKAC ii^Q'I'YKWJi'rH ；rsliiJ^}Wi.QANKilVKFrCiSAVVCif--SMAASSAl：l l1AIYIII^I'YYACiAMS<HJj)PSQAM<；I J17J<iLAM(il)A(；fJYKASf，MW<jFKlir>PAWilK NI)PIJ.NVCiKiJANNlKVWVY(XiNiiKPSI)IliCJNNI iPAKf:IJiCif;VRl，SNIKI:QI)AYNAi tiCi CIIKGVFW 刊，MiTIIMVHYWiAQIAAMKPW.QKAUATIWIX 鉍基酸序_，其?#_?Ρχ, Pepl1._TBS5a) SIiQ II) NO 71 T1TC1CKK ?C^WlTATCiTCXiC ；ΛΛ'Π'< ：< X *C Π'Λ?'? -- ΓΙ----?'(JITC'C iC 'ACC *,< iTCiTC'(--?'? X' a KFTMKmiiltiACCiAC iCGC A ATCI^A Itc ATTG Cfr€CTl^CGCGG GTIallCA CCACCCCCAllwrG^--τι?石 XK ircciciUi Title rtiCi TCitiAGTAfC ;Λ( ·Λ1'( 'AM ；( j·! ·( x *ΛΛ1" 1?'(' ΛΛΛ? nr.c m a rtt ic x ：a,\cv( x h % % x nx < ?χ η?μ va sc '：n ~t im \ κ κ ：rrc ict nx n % m/acj C ?ACr.AC ?ΙΤΜ ](·( Η K ?Χ Μ Κ?Λ?'Λ--'ΛΛ? 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'Μ \ lit -- ?Γ 《:+a ;r《;γγγγλο<;( --χ ?< '? ?'Λατηχ?ΤΛΛΓ.τη· 下劃線序列： 起始密碼子和終止密碼子 Afl II限制性位點(diǎn)（ΝΕΒ緩沖液4) 注意：在終止和Afl II RE之間多個T間隔序列 Apa I限制性位點(diǎn)（NEB緩沖液4) 注意：在起始和Apa I RE之間的間隔序列是Kozak最小翻譯起始位點(diǎn)。 耜體序列： 粗體和下劃線的HA 1序列（SEQ ID NO 72) 粗體的HA2序列（SEQ ID NO 73 粗體和下劃線的ΝΑΙ序列（SEQ ID NO 74) ,SI>：Qil) NO 72 CiCliiAATCTAltcAITC?(?'(Χ：Τ SI-；QIl)N073 ?t'CiCiCiC.CiCilTalK'AirACrCXi SliQir) MO 74 (,Λ11'Λ1，(?,·\(?(?ΛΛ'Γ(?ΠΓ(Τ(ΠΤΛΓ S1-：QII)M)?5 Hi ;j-ΛYC 5HI Λ· KTVS I i?VC JA1 )l·： CMycobaelcTium lubfrculosis) Η3·ν的表位HSPx的熱#克? 序賴陳+：JW_62.2} li：> SO 76 Ι?Χ--Ι^Λ?Τ?ΧκΧΓΙ^?ΧΚΓΙ--Χ--ΧΧ?Ι--?Μ^Λ?ΤΚΓΙΧΠ'?ΧΚ--Κ1 Γ?Μη'Λ(Κ.ΓΓ?!ΓΤ(ΙΜ·Κ4-- <:對瘦 Γ?Ι8Ρλ的核條酸序列； Sl：Q II) \066} HhQmSOn (?ΝΙ-ΗΛΡ\￥0νΠII明ΙΥΠΗΓΗΓΥ ( F劃線|,列分別Λ ψ璺流感_ 衣位ΙΙΛ {復(fù)#序列}#>?Λ; Pep 11) ShQmsaiK C;<y ;ΛΛΤΓΤΛ?Ιι:Λ----(ΤΓΓΓ?！?i《i.C KX ΓΠ^ΕΓΑΓΓΛΓα X; ΙΛ--Λ--ΙΑ(Κ】ΛΛτσπττ?νι--ΑΓ (Pep I i ^ S1:Q II) NO Ml SHQII>Nr()79 ltX：KL^A11'CXRtrrAC：<KniXtllt'CrilXt?C'A(tlcrixriCXHlX；iCX1J(?'rAtiCJlXKlXl/\( , OM X SGt ;ΛΛΤΓΤΛ?ο\ΤΚ;( ?ΓΟ?( K\mmim\mVAiTAVlTl ;ΓΛ?ΤΛΤ(;Α(;?ΛΛΤ(;Τ ?ΙΤΙΧ?Τ?Μ?Χ X X'( Κ *C X ΤΛΚΚ TiVtiVaim\OAl^A(TmVAi KmKXXlUTAXXmrVt ATGVdKTXmAAVATVAMK mTAAllTi^XAMmKnXKmKTAAi^ViliTlllViX^'m 1^MX--H--：<iΛCt?<K：X?t?￠：C?CtiCtK^^--C?Λ(tLM--?^M------t：C?^ΛC：Λ'rC iΛΛC：ΛC： cxxtic^ijiittLACFiXiii'rAciiAct'AcrrcxKJCitiixfiiiKTrcicrrcvvi^itttiCJixMjirrcjcj (Χ\4(ΓΙ'?^\Λ<；(?1，?*ΤΛ<?，(ΙΧ?Λ--，{；<?ΓΛ?Χ ,Λ(Η：{1ΧΚΧ?'--Χ；--(,ΛΛ<--Κ"?Χ--ΓΙ--Χ?( ,Λ CLMll'AC^AtiTtWKiACLACtlTCXTilAi'C^CiCtlAI Ι--?Ι?ΧΤΛΚΚΙ--Ι?Κ irtVAUilVVA M ：Ml(K：A(\nVAAiliXX\^%XlilAAi C；(KiC；CICltJACXKlXMH；CJA1，il^llV\CXlXX^\<Ji，Atri!X ，trlIl^(lit，(KJ<JACJt，tiA'rcrr Vi ΚΚΚΤ?να?ΧΙ?ΙΑ?Τ?Χ--τνΑΙΚ iCl^Al'tiCKrilXI'ACIITCiATilKKXTCiC ；rC；ATCi(； imhwm ?"? iiit xiiiVTAVAAi a ivi Tre \h\VAH :tc jc ;c;cia'aiAA(stiACJ(iAc *c x xn mi TCKiCfAfi(XifiAAC^；ACsCif：( iCmilXiAACi iTCtiCiCiAA(K：TCi/Vra KTAACAACMTni r<iT(?X^CJ^iT￠rΓΛ￠?tK：CK：?^?Λ(：C--C：Λ/\CU：ttrIti￠?L\?<? 1<?：.(rTCKK^Λ<^AΛ<X?lM^ CXiCiCI=AACJ'i1，C*Cwril；Ati(iil{ll'CirrCXIiCiAC'(*ACiC'AAC：/ViX vAACril'Cl'A/\CiA(，CJCX， ΤΛΓΛΛΓ?ΧΧΙΚ rrriCirnCjn^AC'AArC --ΚΧ/ιΙΧΓη?ΙΙΜ?Ι'?ΧΧΙ--?Λ?'ΛΙΙΙΧ--ΓΓΛ?ΧΧ'Λ ?\Α?](--ΚΚ14?1'Ι\Μ--；?Μ?{--?'Κ'Χ--\4?Χ--'ΛΛ(?](?\41'?1ΛΛ{--,( ,(·<?Λ(,(1--?,ΛΜ1--?<? 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SEQ ID NO 101 HYJIECSCYDWSGYSUSFVOIlFELTGUIYEECSCYQYiKANSKFICjlTE SEQ ID NO 102 VI^BPYVSCDPKSCINRCl^rVf；lJRGl{VllEFYVSC13I)QYllvANSKf!GlTE SliQ ID NO 103 DWSGYSGSFVQHPELTGL SEQ ID NO 104 Iltll-APFSKDNSiRLSACKJOlWVTREFYVSeDP SHQ II) NO H)5 KSCllS:RCfYVt：llR(iR SEQJDNC) 306 GMLFIAPRYAFA SEQ ID NO 10? CAiiAONLFlAPRYAFA SEQ ID NO 1(? GHLVVFRyAFA SEQ ID MO 109 CAGAGNL￥V1?RYAI:A SEQ ID MCI 110 GNLIAPRYAFA SEQ ID HO III CAGAGMJAPRYAFA St〇 ID MO 112 CJNLWP SEQ ID NO 113 CACIAGNLVVP SEQ ID NO 114 FVIRHPFISCSHLH： SEQ ID NO 115 CAGAfVIREPFISCStn JiC
[0083] 圖1顯示如通過用P印6、P印9、P印10或P印11接種的小鼠的ELISA測定的效 價(jià)。如可見的，用P印9、Pep 10或Pep 11接種提供了對天然抗原的通常強(qiáng)應(yīng)答和小鼠中 的最1?效價(jià)。
[0084] 圖2顯示用來源于流感的Wuhan毒株（H3N2)的肽免疫的小鼠的血清的平均0D值。 結(jié)果表明相比于未接種的小鼠（Balb/c庫）和用Pep 3接種的小鼠 ，Pep 10和Pep 11提 供明顯的免疫應(yīng)答。
[0085] 圖3顯示用P印6免疫后的抗血清（以1:100效價(jià)）的平均0D值。如可見的，P印 6抗血清與H1N1和H3N2兩種病毒強(qiáng)烈反應(yīng)。
[0086] 圖4顯示當(dāng)與以不同稀釋度的流感毒株Caledonia病毒（H1N1)反應(yīng)時(shí)用P印9 免疫的小鼠的抗血清效價(jià)。如所見，Pep 9與整個病毒強(qiáng)烈反應(yīng)。
[0087] 圖5顯示四幅圖（A-D)，其每一幅描繪P印9血清對四種底物之一的吸光度：(A) 新鮮的flfuhan病毒；(B)固定的Wuhan病毒；(C)新鮮的Caledonia病毒；和（D)固定的 Caledonia病毒。如所示，Pep 9血清與測試的所有底物強(qiáng)烈反應(yīng)。
[0088] 圖6顯示當(dāng)俘獲有新鮮的或固定的Wuhan的底物或Caledonia病毒底物時(shí)用P印 9免疫的小鼠的效價(jià)。再次，Pep 9抗血清與每一種強(qiáng)烈反應(yīng)，并且對測試的抗血清的許多 種觀察到的結(jié)合的量在新鮮的和固定的之間是相似的。
[0089] 圖7顯示當(dāng)用H5N1底物的多種稀釋度俘獲時(shí)用P印11免疫的小鼠的抗血清效 價(jià)。如可見的，用測試的兩種血清均觀察到結(jié)合。
[0090] 構(gòu)建了復(fù)合抗原，其含有來自甲型流感病毒(幾個亞型包括人H1、H3和高致病性 (high-path) H5)的血凝素和神經(jīng)氨酸酶的之前確定的保守表面蛋白表位。還包括來自結(jié)核 分枝桿菌的HspX和85a的蛋白區(qū)段。這些表達(dá)的蛋白雜合構(gòu)建體包括以下：NH2+――Hsp X-HA1-HA2-NA1 -85a-----C00- 其中，HspX是來自結(jié)核分支桿菌HspX蛋白的20個氨基酸；HA1是7個氨基酸的高度保 守的甲型流感血凝素蛋白的雜合區(qū)；HA2是7個氨基酸的高度保守的甲型流感血凝素蛋白 的雜合區(qū)；NA1是8個氨基酸的高度保守的甲型流感神經(jīng)氨酸酶蛋白的雜合區(qū)；并且85a是 來自結(jié)核分枝桿菌的85 kD 85a蛋白的294個氨基酸。成熟的對應(yīng)蛋白序列是SEQ ID N0 70的336個氨基酸序列。
[0091] 使用pVAXl (Invitrogen Inc, Cat#V260-20)通過重組方法構(gòu)建復(fù)合抗原疫苗。 簡述之，合成對應(yīng)于SEQ ID 70的單鏈（ss)DNA聚合物。ssDNA序列還包括：1)用于直接插 入到pVAXl克隆載體的5' Apal限制性內(nèi)切核酸酶識別位點(diǎn)和3' Afl II限制性位點(diǎn)，2)在 5'端的ATT最小Kozak翻譯起始序列，3)ATG起始密碼子，和4)3' TAG終止（termination) (終止（stop))密碼子。核苷酸序列以其整體將由SEQ ID NO 71的1038個核苷酸組成。
[0092] 將該單鏈核苷酸序列用作模板來通過聚合酶鏈反應(yīng)生成雙鏈擴(kuò)增子。按照PCR擴(kuò) 增，將擴(kuò)增子進(jìn)行限制性內(nèi)切核酸酶消化，連接至pVAXl并使用標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化和篩選方法用卡 那霉素選擇轉(zhuǎn)化入大腸桿菌細(xì)菌中。含有重組插入片段的質(zhì)粒在過夜培養(yǎng)物中生長，并使 用已知的質(zhì)粒提取方法純化。將重組pVAXl質(zhì)粒的濃縮物進(jìn)行DNA測序并用于小鼠中的下 游轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。
[0093] 圖8-1至8-6列出了極大量序列，其包括多種目標(biāo)基因序列的保守的或另外靶向 的區(qū)域，和本發(fā)明的復(fù)合序列。
[0094] 本發(fā)明的其他實(shí)施方案和用途對于本領(lǐng)域技術(shù)人員從考慮說明書和實(shí)施本文公 開的本發(fā)明中將是顯而易見的。本文引用的所用參考，包括所有出版物、美國和外國專利 和專利申請，均明確地且完整地通過引用并入。術(shù)語包括(無論何處使用）旨在包括術(shù)語 由......組成和基本上由......組成。此外，術(shù)語包括（comprising)、包括（including)和包含 (containing)不旨在是限制性的。旨在將本說明書和實(shí)施例僅考慮為示例性的，具有由隨 后的權(quán)利要求表明的本發(fā)明的真正范圍和精神。
【權(quán)利要求】
1. 復(fù)合抗原，其包含具有來源于一種或多種病原體的多種抗原表位的鄰接的氨基酸序 列的肽，所述復(fù)合抗原在哺乳動物中誘導(dǎo)針對由所述一種或多種病原體的感染是保護(hù)性的 免疫應(yīng)答。
2. 權(quán)利要求1的復(fù)合抗原，其中所述多種表位包括一個或多個復(fù)合表位。
3. 權(quán)利要求1的復(fù)合抗原，其中所述氨基酸序列的氨基酸是天然氨基酸。
4. 權(quán)利要求1的復(fù)合抗原，其中所述多種抗原表位包含同一表位的一個或多個重復(fù)、 不同表位的一個或多個重復(fù)、一個或多個復(fù)合表位、或其組合。
5. 權(quán)利要求1的復(fù)合抗原，其中至少一個表位的氨基酸序列天然不存在。
6. 權(quán)利要求1的復(fù)合抗原，其中所述一種或多種病原體是病毒、細(xì)菌、寄生物、酵母、真 菌、或其組合。
7. 權(quán)利要求1的復(fù)合抗原，其中所述一種或多種病原體是流感病毒，并且一種或多種 抗原表位是以下的氨基酸序列通1』2、撤、嫩、？81、或？82蛋白、或其組合。
8. 權(quán)利要求7的復(fù)合抗原，其中所述表位包含SEQ ID NOs 4、5、8、19、20、52、53、56或 54。
9. 權(quán)利要求8的復(fù)合抗原，其包含SEQ ID NO 16、65、66、67、70或77。
10. 復(fù)合抗原，其包含這樣的氨基酸序列，所述氨基酸序列含有在多個保守區(qū)的表位序 列之間相同的氨基酸和在多個保守區(qū)的表位序列之間不同的氨基酸。
11. 權(quán)利要求10的復(fù)合抗原，其中所述氨基酸序列具有式AnlBCAn2,其中A代表在多 個保守區(qū)的表位序列之間相同的氨基酸，B和C代表在多個保守區(qū)的表位序列之間不同的 氨基酸，其中A、B和C是天然存在的氨基酸，N1和N2總計(jì)少于25,并且B和C氨基酸的數(shù) 目少于3。
12. 權(quán)利要求11的復(fù)合抗原，其包含SEQ ID NO. 6、7、21、22、54、55、58或59。
13. 權(quán)利要求11的復(fù)合抗原，其中所述多個保守區(qū)來源于同一病原體的多個血清型。
14. 權(quán)利要求13的復(fù)合抗原，其中所述同一病原體是流感病毒。
15. 抗體，其對于權(quán)利要求1的復(fù)合抗原是特異性有活性的。
16. 重組多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1的復(fù)合抗原。
17. 在哺乳動物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，其包括向所述哺乳動物施用權(quán)利要求1的復(fù) 合抗原。
18. 權(quán)利要求17的方法，其中產(chǎn)生的免疫應(yīng)答針對一種或多種病原體的多種不同毒 株、血清型或物種是保護(hù)性的。
19. 疫苗，其包含權(quán)利要求1或11的復(fù)合抗原。 20. DNA疫苗，其編碼權(quán)利要求1的復(fù)合抗原。
【文檔編號】A61K39/145GK104203272SQ201380006720
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2013年1月25日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月26日
【發(fā)明者】G.W.費(fèi)希爾, L.T.道姆 申請人:長角牛疫苗和診斷有限責(zé)任公司