一種用于治療肝癌的基因工程疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及基因工程疫苗，具體涉及一種用于治療肝癌的基 因工程疫苗及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國原發(fā)性肝癌比例最大的為肝細(xì)胞癌，其次為膽管細(xì)胞癌。腫瘤細(xì)胞具有抗原 性，能引起機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，這是腫瘤免疫治療的理論基礎(chǔ)。近年來，由于分子免疫學(xué)、細(xì) 胞生物學(xué)和生物工程技術(shù)的發(fā)展，使腫瘤疫苗、單克隆抗體、細(xì)胞因子、免疫活性細(xì)胞輸注 及基因轉(zhuǎn)移技術(shù)等的臨床應(yīng)用成為可能，使肝癌的免疫治療研究有了巨大發(fā)展。尤其是肝 癌疫苗備受關(guān)注，已成為肝癌免疫治療的研究熱點(diǎn)之一。運(yùn)用肝癌細(xì)胞、肝癌抗原、樹突狀 細(xì)胞及核酸為基礎(chǔ)構(gòu)建的肝癌疫苗，通過激發(fā)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)肝癌特 異性抗原的免疫應(yīng)答，達(dá)到殺滅表達(dá)肝癌抗原的腫瘤細(xì)胞而產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)的目的。通過 臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肝癌疫苗可以減少肝癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、改善患者生存質(zhì)量以及延長存活時(shí)間， 已成為肝癌綜合治療的重要部分。
[0003] 目前，腫瘤疫苗主要有如下類型。
[0004] 腫瘤細(xì)胞疫苗。傳統(tǒng)的瘤苗是通過自體或同種異體腫瘤細(xì)胞或其粗提物，經(jīng)過物 理、化學(xué)或生物方法處理后，抑制其生長能力，保持并增強(qiáng)其免疫原性。但這種疫苗的免疫 原性弱，難以引起免疫應(yīng)答。后來，將腫瘤細(xì)胞加入佐劑如卡介苗(BCG)、短小棒狀桿菌或弗 氏佐劑等以增強(qiáng)其免疫原性，但效果仍不理想。而且這種疫苗制備耗時(shí)較長，不能滿足快速 免疫的需要。近年來對(duì)全細(xì)胞瘤苗進(jìn)行了改進(jìn)，已嘗試用建株的的腫瘤細(xì)胞系作為其替代 物。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，使用處理過的建株腫瘤細(xì)胞作為全細(xì)胞瘤苗具有以下優(yōu)點(diǎn)：（ a)腫瘤細(xì) 胞表達(dá)多種抗原，避免了分離、鑒定抗原的煩瑣；（b)用作疫苗的腫瘤細(xì)胞表達(dá)的MHC可以與 患者不匹配，可作為同種異體抗原，激發(fā)免疫應(yīng)答；（c)用建株腫瘤細(xì)胞制備疫苗，簡單易 行，大大縮短了患者從確診到接種疫苗的時(shí)間。
[0005] 腫瘤基因工程疫苗。腫瘤基因工程疫苗是一種通過基因重組技術(shù)將目的基因?qū)?受體細(xì)胞而制備的疫苗。隨著免疫基礎(chǔ)理論的發(fā)展，各種疫苗的研制也日新月異。國內(nèi)外學(xué) 者己將不同的目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，提高其免疫原性或活化效應(yīng)細(xì)胞的能力。這種疫苗 主要從以下幾個(gè)方面來實(shí)現(xiàn)其抗瘤效應(yīng)：（a)提高機(jī)體抗瘤能力；（b)增強(qiáng)腫瘤免疫原性； (c)基因產(chǎn)物直接殺傷瘤細(xì)胞。近幾年有關(guān)腫瘤基因工程疫苗研究的熱點(diǎn)主要集中在GM-CSF基因疫苗、多基因聯(lián)合修飾疫苗、基因修飾樹突狀細(xì)胞和構(gòu)建樹突狀細(xì)胞疫苗，以及免 疫修飾基因與自殺基因的聯(lián)合。如將B7-1和IL-4，B7-1和IL-7，IFN-Y、GM-CSF和B7-1，IL-12、B7-1和腫瘤抗原等多細(xì)胞因子基因進(jìn)行聯(lián)合修飾。多種細(xì)胞因子與自殺基因的聯(lián)合轉(zhuǎn) 染能揚(yáng)長避短相互協(xié)同，具有更好的免疫效應(yīng)。
[0006] 樹突狀細(xì)胞(DC)疫苗。目前用腫瘤抗原肽、腫瘤細(xì)胞裂解物、腫瘤細(xì)胞RNA體外沖 擊DC或?qū)AA基因轉(zhuǎn)入DC內(nèi)，均被認(rèn)為是頗有前途的瘤苗制備方案。但各種體外沖擊手段均 有半衰期短的缺點(diǎn)，若要誘導(dǎo)出高水平的持久的抗腫瘤免疫反應(yīng)，需反復(fù)多次體內(nèi)回輸致 敏DC。另外一種用腫瘤cDNA或mRNA體外沖擊DC的方法可以解決抗原丟失或抗原變異的問 題，而且又避免了分離大量腫瘤抗原肽的困難。現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)己可以較容易地大量 擴(kuò)增腫瘤mRNA及構(gòu)建腫瘤的cDNA文庫，這為我們提供了龐大的腫瘤抗原庫，也為應(yīng)用cDNA、 mRNA體外沖擊DC細(xì)胞提供了原料。體外用腫瘤cDNA或mRNA沖擊DC細(xì)胞無須確定腫瘤抗原， 而且理論上講沖擊后的DC細(xì)胞可以表達(dá)任何一種可能的腫瘤相關(guān)抗原，因而被一些研究采 用并取得了良好的效果。
[0007] 肽疫苗。抗原提呈過程和免疫識(shí)別的研究，己證實(shí)腫瘤抗原須在APC胞內(nèi)降解為短 肽，最后形成肽-MHC-TCR復(fù)合物才能為T細(xì)胞識(shí)別，并激發(fā)CTL反應(yīng)，這為肽疫苗的研究提供 了理論依據(jù)。所用腫瘤抗原多肽可分為兩類:人工合成多肽和自然源性多肽。合成多肽疫苗 是隨著腫瘤抗原表位的確定發(fā)展起來的。根據(jù)腫瘤抗原表位合成相應(yīng)的多肽，然后與佐劑 一起或單獨(dú)免疫，可以誘導(dǎo)針對(duì)免疫原性表位的抗腫瘤免疫反應(yīng)。合成多肽疫苗的優(yōu)點(diǎn)在 于:誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的特異性較高;可以大量合成;抗原純度高;對(duì)各種組織型應(yīng)用廣泛;僅需 要少量的病人腫瘤組織（用于確定抗原的表達(dá)）；可以激活CD+4T和CD+ST細(xì)胞。合成肽疫苗 的這些優(yōu)點(diǎn)使之成為一種重要的的疫苗策略。
[0008] 核酸疫苗。核酸疫苗是由能引起保護(hù)性免疫反應(yīng)的抗原基因片段及其載體構(gòu)建而 成。包括DNA疫苗和RNA疫苗，目前研究最多的是DNA疫苗。與其他疫苗相比，DNA疫苗具有許 多優(yōu)點(diǎn)：接種基因可以長期表達(dá)，誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)持久高效；制備簡單，容易構(gòu)建，經(jīng)濟(jì)省 時(shí)；與重組蛋白相比，基因疫苗更接近于自然感染狀態(tài);免疫反應(yīng)強(qiáng)烈，特異，廣泛，全面，且 能夠產(chǎn)生交叉免疫保護(hù)；核酸疫苗能同時(shí)激發(fā)機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，能誘導(dǎo)許多 亞單位疫苗所不能誘導(dǎo)的CTL效應(yīng);穩(wěn)定性好，容易保存;可以誘導(dǎo)不成熟免疫系統(tǒng)產(chǎn)生T細(xì) 胞免疫應(yīng)答;無感染復(fù)制危險(xiǎn)，不會(huì)產(chǎn)生回復(fù)突變;可用同一載體制備針對(duì)多種疾病的基因 疫苗，研制多價(jià)疫苗。
[0009] GM-CSF(粒巨細(xì)胞集落刺激因子)是一種主要由巨噬細(xì)胞和活化細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞 因子，其可通過促進(jìn)分化成熟樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞分化、成熟和活化進(jìn)而 促進(jìn)Th、Tc、NK識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原，在腫瘤部位浸潤，引起系統(tǒng)性抗腫瘤反應(yīng)，殺傷腫瘤的同 時(shí)還可促進(jìn)細(xì)胞CD45T細(xì)胞分化成熟及黏附分子B7/BB1的表達(dá)，提高其抗原呈遞能力。另 外還可增加巨噬細(xì)胞主要組織相容性復(fù)合物II (MHCII)的表達(dá)，提高其抗原呈遞能力。GM-CSF基因修飾的腫瘤細(xì)胞被放射線滅活后往體內(nèi)注射，可增加局部炎性反應(yīng)，大量多核細(xì) 胞、巨噬細(xì)胞和DC浸潤，促進(jìn)腫瘤抗原呈遞，能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈的抗腫瘤免疫反應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的在于提供一種新型的肝癌基因工程疫苗，該基因工程疫苗包括GM-CSF基因修飾的人肝癌細(xì)胞和佐劑；其中，GM-CSF基因修飾的人肝癌細(xì)胞可穩(wěn)定表達(dá)GM-CSF，殺傷腫瘤細(xì)胞;佐劑可以顯著增強(qiáng)GM-CSF基因修飾的人肝癌細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷 力，二者具有顯著的協(xié)同作用。
[0011] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：
[0012] -種肝癌基因工程疫苗，包括GM-CSF基因修飾的人肝癌細(xì)胞和佐劑；
[0013] 所述GM-CSF基因修飾的人肝癌細(xì)胞通過如下步驟制備：
[0014] 步驟Sl，用含GM-CSF基因的重組仙臺(tái)病毒上清液感染人肝癌細(xì)胞，得到GM-CSF基 因修飾的人肝癌細(xì)胞；
[0015] 步驟S2,對(duì)步驟Sl得到的GM-CSF基因修飾的人肝癌細(xì)胞滅活并進(jìn)行熱休克處理；
[0016] 所述佐劑通過如下步驟制備：
[0017] 步驟Sl，取對(duì)數(shù)生長期的人肝癌細(xì)胞接種于含體積百分比10%FBS的RPMI 1640細(xì) 胞培養(yǎng)液中，加入15~25ymol/mL的如下結(jié)構(gòu)式的化合物（I)培養(yǎng)36~48h得細(xì)胞培養(yǎng)液，
w ，
[0019] 步驟S2,將細(xì)胞培養(yǎng)液離心棄上清液，沉淀懸浮于生理鹽水中，再放入液氮中冷凍 5~10分鐘，再將冷凍物取出，放入37°C溫水融化，如此反復(fù)凍融3~5次，即可得所述佐劑。
[0020] 進(jìn)一步地，所述佐劑通過如下步驟制備：步驟Sl，取對(duì)數(shù)生長期的人肝癌細(xì)胞5X IO 7個(gè)接種于Iml含體積百分比10%FBS的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液中，加入20ymol/mL的所述 化合物（I)培養(yǎng)42h得細(xì)胞培養(yǎng)液;步驟S2，將細(xì)胞培養(yǎng)液離心棄上清液，沉淀懸浮于Iml生 理鹽水中，再放入液氮中冷凍5~10分鐘，再將冷凍物取出，放入37°C溫水融化，如此反復(fù)凍 融3~5次，即可得所述佐劑。
[0021] 進(jìn)一步地，所述人肝癌細(xì)胞為HepG2人肝癌細(xì)胞系。
[0022] 進(jìn)一步地，所述滅活方法為采用6t3Co照射滅活。
[0023]進(jìn)一步地，所述熱休克處理方法為：將人肝癌細(xì)胞置于42°C~65°C條件下溫浴 0.5h~2h。
[0024]所述的肝癌基因工程疫苗在制備預(yù)防或治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。
[0025]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
[0026]本發(fā)明提供的基因工程疫苗包括GM-CSF基因修飾的人肝癌細(xì)胞和佐劑;其中，GM-CSF基因修飾的人肝癌細(xì)胞可穩(wěn)定表達(dá)GM-CSF，殺傷腫瘤細(xì)胞;佐劑可以顯著增強(qiáng)GM-CSF基 因修飾的人肝癌細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷力，二者具有顯著的協(xié)同作用，能夠協(xié)同預(yù)防和治 療肝癌，特別是反復(fù)多次接種能夠進(jìn)一步提高預(yù)防或治療腫瘤的效果。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì) 本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。未詳 細(xì)描述的試驗(yàn)方法均為本領(lǐng)域常規(guī)試驗(yàn)操作，未特別強(qiáng)調(diào)的儀器和試劑均為本領(lǐng)域常規(guī)儀 器和試劑。
[0028] 實(shí)施例1 =GM-CSF基因修飾的人肝癌細(xì)胞的制備
[0029] 第一步:含信號(hào)肽的粒巨細(xì)胞集落刺激因子cDNA的制備
[0030] I、粒巨細(xì)胞集落刺激因子mRNA的制備：
[0031] (1)人外周血淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞，共約IX IO6細(xì)胞，經(jīng)誘導(dǎo)刺激30 小時(shí)，使細(xì)胞因子基因表達(dá)，以備