專利名稱：一種用于制備生物汽油的工程大腸桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于制備生物汽油的工程大腸桿菌。本發(fā)明還涉及利用上述工程大腸桿菌制備生物汽油的方法。
背景技術(shù)：
隨著石油資源的日益減少和環(huán)境污染的日益加劇，生物液體燃料作為一種清潔的 可再生能源，正受到世界各個(gè)國(guó)家的關(guān)注和重視。目前發(fā)展比較成熟的生物液體燃料包括 生物乙醇和生物柴油(脂肪酸甲酯)，但乙醇的能量密度低，易吸水，不方便儲(chǔ)存和運(yùn)輸， 而生物柴油的黏度較大，容易凝固，會(huì)導(dǎo)致柴油機(jī)過(guò)濾器容易堵塞以及低溫啟動(dòng)性能不佳 (Atsumi etal.，2008 ；李春梅等，2008)。因此，有必要發(fā)展生物丁醇和生物汽油等新一代 生物液體燃料以克服現(xiàn)有生物液體燃料的不足。生物汽油和化石汽油的組成成分相同，均 為C8-C12的烷烴，因此利用生物汽油替代化石汽油不存在任何技術(shù)障礙。所生產(chǎn)的烷烴分 泌到菌體細(xì)胞外，可以直接從培養(yǎng)液中萃取獲得，簡(jiǎn)化了分離工藝，可以有效地降低生產(chǎn)成 本。利用大腸桿菌生產(chǎn)生物汽油的主要技術(shù)路線是將大腸桿菌產(chǎn)生的脂肪酸逐步還 原為烷烴。大腸桿菌具有遺傳背景清楚，生長(zhǎng)速度快，可實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，因此可以 很好的用于代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。烷烴生產(chǎn)中很關(guān)鍵的一步是脂肪酸的生產(chǎn)，而乙酰_CoA到丙 二酰-CoA的轉(zhuǎn)化，是脂肪酸生物合成中的限速酶。在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)乙酰_CoA羧化 酶可以加快其脂肪酸合成的速率，從而使其積累更多的脂肪酸。硫脂酶催化脂酰-ACP為游離脂肪酸，但是大腸桿菌自身的硫脂酶主要作用于 C16和C18的脂酰-ACP，因此它主要積累C16和C18的脂肪酸。而據(jù)報(bào)道，U. californica, C. calophy 1 la，C. hookeriana以及C. palustvis等生長(zhǎng)的種子中積累癸酸和月桂酸等 中短鏈脂肪酸(Voelker et al.，1992，F(xiàn)ilichkin et al.，2005，Dehesh et al.，1996， Katayoon et al.，1996)。因此，在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)U. californica的硫脂酶基因BTE， 或 C. calophylla 的 Cc FatB2，或 C. hookeriana 的 Ch FatB2，或 C. palustvis 的 Cp FatB!等 便可以獲得中短鏈的脂肪酸。游離脂肪酸在大腸桿菌脂酰-CoA合成酶(fadD)的作用下活化為脂酰_CoA，它可 繼續(xù)在脂酰-CoA脫氫酶(fadE)的作用下轉(zhuǎn)化為烯酰-CoA，從而進(jìn)入氧化途徑。脂 酰-CoA是烷烴生物合成途徑的一個(gè)中間物，有必要阻止脂酰-CoA進(jìn)入降解代謝途徑以積 累脂酰-CoA用于短鏈烷烴的合成。脂酰-CoA到烷烴的轉(zhuǎn)化是在脂酰-CoA還原酶和脂肪醛脫羧酶的催化下完成的。 脂酰-CoA還原酶催化脂酰-CoA生成脂肪醛，反應(yīng)需要NADP+的參與，而脂肪醛脫羧酶催 化脂酰醛脫羧生成烷烴，伴隨C0的產(chǎn)生。但大腸桿菌自身并不存在這兩個(gè)酶，需要表達(dá)外 源的脂酰-CoA還原酶基因(acrl)和脂肪醛脫羧酶基因(CER1)才能在大腸桿菌內(nèi)完成脂 酰-CoA到烷烴的轉(zhuǎn)化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于制備生物汽油的工程大腸桿菌。本發(fā)明的又一目的在于提供一種利用上述工程大腸桿菌制備中短鏈烷烴即生物 汽油的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的用于制備生物汽油的工程大腸桿菌，通過(guò)下述方 法得到通過(guò)PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增乙酰-CoA羧化酶基因、硫脂酶基因、脂酰_CoA 還原酶基因和脂肪醛脫羧酶基因，用膠回收試劑盒回收目的片段，然后分別雙酶切目的片 段和原核表達(dá)載體pET-30a(+)或pACY⑶uet-1，載體片斷膠回收后，將載體基因片段按 摩爾比為1-2 4-5的比例混合，加入T4 DNA連接酶后4-7°C連接15-30小時(shí)，連接產(chǎn)物 38-42°C熱擊轉(zhuǎn)化E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布平板培養(yǎng)過(guò)夜，PCR篩選陽(yáng)性克隆；陽(yáng)性 克隆提取質(zhì)粒DNA，酶切和測(cè)序鑒定后，熱擊轉(zhuǎn)化E. coliBL21 (DE3)，最后敲除該工程大腸 桿菌的fadE基因后即得目標(biāo)工程大腸桿菌。硫脂酶基因?yàn)閬?lái)源于Umbellularia californica的BTE基因，或來(lái)源于Cuphea calophylla的Cc FatB2基因，或來(lái)源于Cuphea hookeriana的Ch &182基因，或來(lái)源于 Cuphea palustvis 的 Cp FatB!基因，或同 BTE，Cc FatB2，Ch FatB2 和 Cp FatB!同源性超過(guò) 70%的DNA序列。脂酰-CoA還原酶基因?yàn)閬?lái)源于Acinetobacter calcoaceticus的acrl基因，或 同acrl基因同源性超過(guò)70%的DNA序列。脂肪醛脫羧酶基因?yàn)閬?lái)源于Arabidopsis thaliana的CER1基因，或同CER1基因 同源性超過(guò)70%的DNA序列。乙酰-CoA羧化酶基因?yàn)閬?lái)源于A. calcoaceticus的accABCD基因，或來(lái)源于 E. coli 白勺 accABCD , ^jftiJIT- Corynebacterium glutamicum 白勺 dtsRl-accBC ^； 同這些基因同源性超過(guò)70 %的DNA序列。脂酰-CoA脫氫酶基因?yàn)榇竽c桿菌的fadE基因。本發(fā)明提供的利用上述工程大腸桿菌制備中短鏈烷烴即生物汽油的方法，是將構(gòu) 建好的工程大腸桿菌以1-2 100-130的比例接種內(nèi)含卡那霉素和氯霉素的M9液體培養(yǎng) 液中，35-37°C，225rpm條件下培養(yǎng)至OD600nm為0. 6-0. 8時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為 0. 1-0. 2mmol化―1，誘導(dǎo)目的蛋白的過(guò)量表達(dá)，然后轉(zhuǎn)入28_30°C，225rpm繼續(xù)培養(yǎng)18-24小 時(shí)；培養(yǎng)后的菌液離心取上清液，用等體積的正己烷萃取，減壓蒸發(fā)除去正己烷后制得生物 汽油。與公知技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1)所生產(chǎn)的生物汽油為C8_C12的烷烴，和化石汽油組分相同。2)烷烴分泌到胞外，并達(dá)到了較高的濃度，便于分離。3)所獲工程大腸桿菌能高效利用半纖維素和纖維素水解得到所有碳水化合物，對(duì) 解決生物質(zhì)經(jīng)濟(jì)中“全糖轉(zhuǎn)化利用”很有價(jià)值。


圖1是在實(shí)施例1中構(gòu)建pA-accAB⑶表達(dá)載體過(guò)程的示意圖2是在實(shí)施例1中構(gòu)建pET-acrl/BTE/CERl表達(dá)載體過(guò)程的示意圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明是通過(guò)在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)乙酰-CoA羧化酶，硫脂酶，脂酰_CoA還原酶 和脂肪醛脫羧酶，并失活大腸桿菌的脂酰-CoA脫氫酶，使大腸桿菌能夠高效地將糖類轉(zhuǎn)化 為C8-C12的中短鏈烷烴。本發(fā)明中具有烷烴生產(chǎn)能力的工程大腸桿菌，通過(guò)以下方法構(gòu)建而成通過(guò)PCR 擴(kuò)增乙酰-CoA羧化酶基因，硫脂酶基因，脂酰-CoA還原酶基因和脂肪醛脫羧酶基因，用 膠回收試劑盒回收目的片段，然后分別雙酶切目的片段和原核表達(dá)載體pET-30a(+)或 pACY⑶uet-1，載體片斷膠回收后，將載體基因片段按摩爾比為1 5的比例混合，加入T4 DNA連接酶后4°C連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物42°C熱擊轉(zhuǎn)化E. coli DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，涂布平板培 養(yǎng)過(guò)夜，PCR篩選陽(yáng)性克隆。陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒DNA，酶切和測(cè)序鑒定后，熱擊轉(zhuǎn)化E.coli BL21 (DE3)，最后敲除該工程大腸桿菌的fadE基因后即得目標(biāo)工程大腸桿菌。構(gòu)建好的工程大腸桿菌以1 100的比例接種內(nèi)含卡那霉素和氯霉素的M9液體 培養(yǎng)液中，37°C，225rpm條件下培養(yǎng)至0D6(1(lmi為0. 6-0. 8時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為 0. lmmol L—1，誘導(dǎo)目的蛋白的過(guò)量表達(dá)，然后轉(zhuǎn)入30°C，225rpm繼續(xù)培養(yǎng)18-24小時(shí)。培 養(yǎng)后的菌液12000g離心10分鐘，取上清液，用等體積的正己烷萃取2-3次，減壓蒸發(fā)除去 正己烷后，制得中短鏈烷烴，所得烷烴通過(guò)GC-MS分析其組成及含量。正己烷減壓蒸餾后回 收使用。本發(fā)明提供的方法，是在大腸桿菌中表達(dá)了調(diào)控脂肪酸生物合成以及控制脂肪酸 鏈長(zhǎng)以及還原脂肪酸的一系列關(guān)鍵酶基因。所獲得的工程大腸桿菌可高密度培養(yǎng)，生長(zhǎng)速 度快，可很好的用于生物汽油的生產(chǎn)。以下將以實(shí)施例方式，并以實(shí)施例1為例附圖詳細(xì)描述本發(fā)明實(shí)施例1通過(guò)在大腸桿菌中共同過(guò)量表達(dá)A. calcoaceticus的乙酰-CoA羧化酶基因 (accABCD)，U. californica 的 BTE 基因，A. calcoaceticus 的 acrl 基因和 A. thaliana 的 CER1基因，并敲除大腸桿菌的fadE基因以用于生物合成中短鏈烷烴。1. 1)外源基因的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建1. 1. 1)外源基因的克隆1. 1. 1. 1)A. calcoaceticus乙酰輔酶A羧化酶基因的克隆提取A. calcoaceticus基因組DNA，根據(jù)GenBank序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增下列基 因accA :acetyl-coenzyme A carboxylase carboxyltransferase(alpha subunit) GenelD(NCBI) 2878570 ；accBC ( * accB 禾口 accC ^？ 13 ) :accB :biotin carboxyl carrier protein ofacetyl-CoA, GenelD(NCBI) 2878571 ；accC :acetyl_CoA carboxylase, GenelD(NCBI) 2878572 ；accD :acetyl_CoA carboxylase, beta subunit, GenelD(NCBI) :2878573。再利用膠回收試劑盒回收目的基因片段。
1. 1. 1. 2)硫脂酶基因的克隆提取U. californica的總mRNA，然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)GenBank序列設(shè)計(jì)引物， PCR擴(kuò)增克隆其硫脂酶基因BTE，GI (NCBI) 170555，再利用膠回收試劑盒回收目的基因。1. 1. 1. 3)脂酰_CoA還原酶基因的克隆提取A. calcoaceticus基因組DNA,根據(jù)GenBank序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增脂 酰-CoA還原酶基因acrl，GI (NCBI) 1684885，再利用膠回收試劑盒回收目的基因。1. 1. 1. 4)脂肪醛脫羧酶基因的克隆提取A. thaliana的總mRNA，然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)GenBank序列設(shè)計(jì)引物，PCR 擴(kuò)增脂肪醛脫羧酶基因CER1，GI (NCBI) :145334982，再利用膠回收試劑盒回收目的基因。1. 1. 2)表達(dá)載體的構(gòu)建1. 1. 2. 1) pA-accABCD表達(dá)載體的構(gòu)建(請(qǐng)參閱圖1)1. 1. 2. 1. 1) pA-accA 載體的構(gòu)建將膠回收后的accA基因與pACYCDuet-1載體(Novagen)用BamH I和Sac I進(jìn)行雙 酶切，載體與外源片段按摩爾比1 5的比例，4°C連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5a , PCR篩選陽(yáng)性克隆，從陽(yáng)性克隆中提取重組質(zhì)粒pA-accA后，再通過(guò)限制性酶切和測(cè)序鑒定。1. 1. 2. 1. 2) pA-accABC 載體的構(gòu)建將膠回收后的accBC基因與pA-accA載體用Nde I和Xho I進(jìn)行雙酶切，載體與 外源片段按摩爾比1 5的比例，4°C連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5a，PCR篩選陽(yáng)性 克隆，從陽(yáng)性克隆中提取重組質(zhì)粒pA-accABC后，再通過(guò)限制性酶切和測(cè)序鑒定。1. 1. 2. 1. 3) pA-accD 載體的構(gòu)建將膠回收后的accD基因與pACYCDuet-1載體(Novagen)用BamH I和Sac I進(jìn)行雙 酶切，載體與外源片段按摩爾比1 5的比例，4°C連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5a , PCR篩選陽(yáng)性克隆，從陽(yáng)性克隆中提取重組質(zhì)粒pA-accD后，再通過(guò)限制性酶切和測(cè)序鑒定。1. 1. 2. 1. 4) pA-accABCD 表達(dá)載體的構(gòu)建以pA-accD重組質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增含有T7啟動(dòng)子的accD基因即T7_aCCD，用Sal I和Afl II分別雙酶切T7-aCCD和pA-accABC，載體與外源片段按摩爾比1 5的比例， 4°C連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5ci，PCR篩選陽(yáng)性克隆，從陽(yáng)性克隆中提取重組質(zhì)粒 pA-accABCD后，再通過(guò)限制性酶切和測(cè)序鑒定pA-accABCD。1. 1. 2. 2) pET-acrl/BTE/CERl 表達(dá)載體的構(gòu)建(請(qǐng)參閱圖 2)1. 1. 2. 2. l)pET-acrl 表達(dá)載體的構(gòu)建分別將膠回收后的acrl基因與pET_30a(+)載體用BamH I和EcoR I進(jìn)行雙酶 切，載體與外源片段按摩爾比1 5的比例，4°C連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5a , PCR篩選陽(yáng)性克隆，從陽(yáng)性克隆中提取重組質(zhì)粒pET-acrl后，再通過(guò)限制性酶切和測(cè)序鑒 定 pET-acrl。1. 1. 2. 2. 2) pET-BTE 表達(dá)載體的構(gòu)建分別將膠回收后的BTE基因與pET_30a(+)載體用Nde I和Not I進(jìn)行雙酶切， 載體與外源片段按摩爾比1 5的比例，4°C連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5 a , PCR篩選陽(yáng)性克隆，從陽(yáng)性克隆中提取重組質(zhì)粒pET-BTE后，再通過(guò)限制性酶切和測(cè)序鑒定 pET-BTE。1. 1. 2. 2. 3) pET-CERl 表達(dá)載體的構(gòu)建分別將膠回收后的CER1基因與pET_30a(+)載體用Not I和Xho I進(jìn)行雙酶切， 載體與外源片段按摩爾比1 5的比例，4°C連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5 a , PCR 篩選陽(yáng)性克隆，從陽(yáng)性克隆中提取重組質(zhì)粒pET-CERl后，再通過(guò)限制性酶切和測(cè)序鑒定 pET-CERl。1. 1. 2. 2. 4) pET-acrl/BTE 表達(dá)載體的構(gòu)建以pET-BTE為模板，PCR擴(kuò)增含有T7啟動(dòng)子的BTE基因T7-BTE，再分別和載 體pET-acrl用Sal I和Not I進(jìn)行雙酶切，載體與外源片段按摩爾比1 5的比例，4°C 連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5a , PCR篩選陽(yáng)性克隆，從陽(yáng)性克隆中提取重組質(zhì)粒 pET-acrl/BTE后，再通過(guò)限制性酶切和測(cè)序鑒定pET-acrl/BTE。1. 1. 2. 2. 5) pET-acrl/BTE/CERl 表達(dá)載體的構(gòu)建以pET-CERl為模板，PCR擴(kuò)增含有T7啟動(dòng)子的CER1基因T7-CER1，再分別和載 體pET-acrl/BTE用Not I和Xho I進(jìn)行雙酶切，載體與外源片段按摩爾比1 5的比例， 4°C連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5ci，PCR篩選陽(yáng)性克隆，從陽(yáng)性克隆中提取重組質(zhì)粒 pET-acrl/BTE/CERl后，再通過(guò)限制性酶切和測(cè)序鑒定pET-acrl/BTE/CERl。1. 2)pA_accABCD 和 pET-acrl/BTE/CERl 共同轉(zhuǎn)化大腸桿菌pET-acrl/BTE/CERl熱擊轉(zhuǎn)化E. coli BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)PCR篩選獲得 陽(yáng)性克隆，提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒后再通過(guò)酶切和測(cè)序鑒定；然后將pA-accABCD重組質(zhì)粒熱 擊轉(zhuǎn)化含有pET-acrl/BTE/CERl的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)PCR篩選獲得陽(yáng)性克隆，提取 陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒后再通過(guò)酶切和測(cè)序鑒定。由此獲得了含有pA-accABCD和pET-acrl/BTE/ CER1兩個(gè)表達(dá)載體的工程大腸桿菌。1. 3)大腸桿菌fadE基因的敲除采用TargeTron 基因敲除系統(tǒng)(Sigma-Aldrich)對(duì)大腸桿菌的fadE基因進(jìn)行敲 除。1. 4) SDS-PAGE鑒定目標(biāo)蛋白的表達(dá)將活化后的工程大腸桿菌按1 100的接種量接種到10mL LB液體培養(yǎng)液中(內(nèi) 含50 ii g mL—1的卡那霉素和34 ii g mL—1氯霉素)，37°C，225rpm振蕩培養(yǎng)2h，在菌液中加 入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度0. lmmol化―1，然后轉(zhuǎn)入30°C，225rpm繼續(xù)培養(yǎng)3_4h，誘導(dǎo)表達(dá)目的 蛋白。取出誘導(dǎo)后的培養(yǎng)物，12000g離心2min，收集菌體，菌體細(xì)胞用0. 05mol/L的磷酸緩 沖液(pH7. 8)洗滌一次，按1 10的比例再用此緩沖液重懸細(xì)胞，加入等體積2 X SDS-PAGE 上樣緩沖液，煮沸l(wèi)Omin，瞬時(shí)高速離心，10% SDS-PAGE電泳檢測(cè)，即可檢測(cè)到目標(biāo)蛋白的 表達(dá)。1. 5)工程大腸桿菌的培養(yǎng)將活化后工程大腸桿菌按1 100的比例接種到M9液體培養(yǎng)液中(內(nèi)含 50 ug -mr1的卡那霉素和34 ii g -mr1氯霉素)，37°C，225rpm條件下振蕩培養(yǎng)，當(dāng)0D6(1(lnm為 0. 6-0. 8時(shí)，在菌液中加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度0. lmmol化―1，然后轉(zhuǎn)入在30°C，225rpm條 件下，繼續(xù)培養(yǎng)18-24h。
1. 6)烷烴的提取誘導(dǎo)培養(yǎng)后的菌液在12000g條件下，離心lOmin，收集上清液，并用等體積的正己 烷萃取2-3次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去正己烷后即得中短鏈烷烴。正己烷回收利用。1. 7)烷烴組成及含量的測(cè)定得到的烷烴通過(guò)GC-MS測(cè)定其組成及含量。實(shí)施例2通過(guò)在大腸桿菌中共同過(guò)量表達(dá)A. calcoaceticus的乙酰_CoA羧化酶基因 (accABCD), C. calophylla 的 Cc FatB2 基因，A. calcoaceticus 的 acrl 基因禾口 k. thaliana 的CER1基因，并敲除大腸桿菌的fadE基因以用于生物合成中短鏈烷烴。方法過(guò)程同實(shí)施 例1。實(shí)施例3 通過(guò)在大腸桿菌中共同過(guò)量表達(dá)A. calcoaceticus的乙酰_CoA羧化酶基因 (accABCD), C. hookeriana 的 Ch FatB2 基因，A. calcoaceticus 的 acrl 基因禾口 k. thaliana 的CER1基因，并敲除大腸桿菌的fadE基因以用于生物合成中短鏈烷烴。方法過(guò)程同實(shí)施 例1。實(shí)施例4通過(guò)在大腸桿菌中共同過(guò)量表達(dá)A. calcoaceticus的乙酰_CoA羧化酶基因 (accABCD), C. palustvis 的 Cp FatB!基因，A. calcoaceticus 的 acrl 基因禾口 k. thaliana 的CER1基因，并敲除大腸桿菌的fadE基因以用于生物合成中短鏈烷烴。方法過(guò)程同實(shí)施 例1。實(shí)施例5通過(guò)在大腸桿菌中共同過(guò)量表達(dá)E.coli的乙酰-CoA羧化酶基因(accAB⑶)， U. californica 的 BTE 基因，A. calcoaceticus 的 acrl 基因和 A. thaliana 的 CER1 基因，并 敲除大腸桿菌的fadE基因以用于生物合成中短鏈烷烴。方法過(guò)程同實(shí)施例1。實(shí)施例6通過(guò)在大腸桿菌中共同過(guò)量表達(dá)E.coli的乙酰-CoA羧化酶基因(accAB⑶)， C. calophylla 的 Cc FatB2 基因，A. calcoaceticus 的 acrl 基因禾口 k. thaliana 的 CER1 基 因，并敲除大腸桿菌的fadE基因以用于生物合成中短鏈烷烴。方法過(guò)程同實(shí)施例1。實(shí)施例7通過(guò)在大腸桿菌中共同過(guò)量表達(dá)A. calcoaceticus的乙酰-CoA羧化酶基因 (accABCD), C. hookeriana 的 Ch FatB2 基因，A. calcoaceticus 的 acrl 基因禾口 k. thaliana 的CER1基因，并敲除大腸桿菌的fadE基因以用于生物合成中短鏈烷烴。方法過(guò)程同實(shí)施 例1。實(shí)施例8通過(guò)在大腸桿菌中共同過(guò)量表達(dá)A. calcoaceticus的乙酰_CoA羧化酶基因 (accABCD), C. palustvis 的 Cp FatB!基因，A. calcoaceticus 的 acrl 基因禾口 k. thaliana 的CER1基因，并敲除大腸桿菌的fadE基因以用于生物合成中短鏈烷烴。方法過(guò)程同實(shí)施 例1。實(shí)施例9
通過(guò)在大腸桿菌中共同過(guò)量表達(dá)C. glutamicum的乙酰-CoA羧化酶基因 (dtsRl-accBC),U. californica 的 BTE 基因，A. calcoaceticus 的 acrl 基因禾口 A. thaliana 的CER1基因，并敲除大腸桿菌的fadE基因以用于生物合成中短鏈烷烴。9. 1)外源基因的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建9. 1. 1)外源基因的克隆9. 1. 1. 1)C. glutamicum乙酰輔酶A羧化酶基因的克隆提取C. glutamicum基因組DNA，根據(jù)GenBank序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增下列基因dtsRl :acetyl-coenzyme A carboxylase carboxyltransferase(alphasubunit) ，GenelD(NCBI) 3345446 ；accBC :biotin carboxylase 禾口 biotin carboxyl carrier protein, GenelD(NCBI) :3343021。再利用膠回收試劑盒回收目的基因片段。9. 1. 1. 2)硫脂酶基因的克隆提取U. californica的總mRNA，然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)GenBank序列設(shè)計(jì)引物， PCR擴(kuò)增克隆其硫脂酶基因BTE，GI (NCBI) 170555，再利用膠回收試劑盒回收目的基因。9. 1. 1. 3)脂酰-CoA還原酶基因的克隆提取A. calcoaceticus基因組DNA,根據(jù)GenBank序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增脂 酰-CoA還原酶基因acrl，GI (NCBI) 1684885，再利用膠回收試劑盒回收目的基因。9. 1. 1. 4)脂肪醛脫羧酶基因的克隆提取A. thaliana的總mRNA，然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)GenBank序列設(shè)計(jì)引物，PCR 擴(kuò)增脂肪醛脫羧酶基因CER1，GI (NCBI) :145334982，再利用膠回收試劑盒回收目的基因。9. 1. 2)表達(dá)載體的構(gòu)建9. 1. 2. l)pA-dtsRl/accBC 表達(dá)載體的構(gòu)建9. 1. 2. 1. l)pA-dtsRl 載體的構(gòu)建將膠回收后的dtsRl基因用Pag I和BamH I進(jìn)行雙酶切，載體 pACYCDuet-1 (Novagen)用Nco I和BamH I進(jìn)行雙酶切，載體與外源片段按摩爾比1 5的 比例，4°C連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5a , PCR篩選陽(yáng)性克隆，從陽(yáng)性克隆中提取重 組質(zhì)粒pA-dtsRl后，再通過(guò)限制性酶切和測(cè)序鑒定。9. 1. 2. 1. 2)pA-dtsRl/accBC 載體的構(gòu)建分別將膠回收后的accBC基因與pA-dtsRl載體用Mun I和Pac I進(jìn)行雙酶切，載 體與外源片段按摩爾比1 5的比例，4°C連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5a，PCR篩 選陽(yáng)性克隆，從陽(yáng)性克隆中提取重組質(zhì)粒pA-dtsRl/accBC后，再通過(guò)限制性酶切和測(cè)序鑒定。9. 1. 2. 2)pET-acrl/BTE/CERl 表達(dá)載體的構(gòu)建(請(qǐng)參閱圖 2)9. 1. 2. 2. l)pET-acrl 表達(dá)載體的構(gòu)建分別將膠回收后的acrl基因與pET_30a(+)載體用BamH I和EcoR I進(jìn)行雙酶 切，載體與外源片段按摩爾比1 5的比例，4°C連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5a , PCR篩選陽(yáng)性克隆，從陽(yáng)性克隆中提取重組質(zhì)粒pET-acrl后，再通過(guò)限制性酶切和測(cè)序鑒 定 pET-acrl。
9. 1. 2. 2. 2)pET-BTE 表達(dá)載體的構(gòu)建分別將膠回收后的BTE基因與pET_30a(+)載體用Nde I和Not I進(jìn)行雙酶切， 載體與外源片段按摩爾比1 5的比例，4°C連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5 a , PCR 篩選陽(yáng)性克隆，從陽(yáng)性克隆中提取重組質(zhì)粒pET-BTE后，再通過(guò)限制性酶切和測(cè)序鑒定 pET-BTE。9. 1. 2. 2. 3) pET-CERl 表達(dá)載體的構(gòu)建分別將膠回收后的CER1基因與pET_30a(+)載體用Not I和Xho I進(jìn)行雙酶切， 載體與外源片段按摩爾比1 5的比例，4°C連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5 a , PCR 篩選陽(yáng)性克隆，從陽(yáng)性克隆中提取重組質(zhì)粒pET-CERl后，再通過(guò)限制性酶切和測(cè)序鑒定 pET-CERl。9. 1. 2. 2. 4) pET-acrl/BTE 表達(dá)載體的構(gòu)建 以pET-BTE為模板，PCR擴(kuò)增含有T7啟動(dòng)子的BTE基因T7-BTE，再分別和載 體pET-acrl用Sal I和Not I進(jìn)行雙酶切，載體與外源片段按摩爾比1 5的比例，4°C 連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5a , PCR篩選陽(yáng)性克隆，從陽(yáng)性克隆中提取重組質(zhì)粒 pET-acrl/BTE后，再通過(guò)限制性酶切和測(cè)序鑒定pET-acrl/BTE。9. 1. 2. 2. 5)pET-acrl/BTE/CERl 表達(dá)載體的構(gòu)建以pET-CERl為模板，PCR擴(kuò)增含有T7啟動(dòng)子的CER1基因T7-CER1，再分別和載 體pET-acrl/BTE用Not I和Xho I進(jìn)行雙酶切，載體與外源片段按摩爾比1 5的比例， 4°C連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5ci，PCR篩選陽(yáng)性克隆，從陽(yáng)性克隆中提取重組質(zhì)粒 pET-acrl/BTE/CERl后，再通過(guò)限制性酶切和測(cè)序鑒定pET_acrl/BTE/CERl。9. 2)pA-dtsRl/accBC 和 pET-acrl/BTE/CERl 共同轉(zhuǎn)化大腸桿菌pET-acrl/BTE/CERl熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)PCR篩選獲 得陽(yáng)性克隆，提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒后再通過(guò)酶切和測(cè)序鑒定；然后將pA-dtsRl/accBC重組 質(zhì)粒熱擊轉(zhuǎn)化含有pET-acrl/BTE/CERl的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)PCR篩選獲得陽(yáng)性克 隆，提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒后再通過(guò)酶切和測(cè)序鑒定。由此獲得了含有pA-dtsRl/accBC和 pET-acrl/BTE/CERl兩個(gè)表達(dá)載體的工程大腸桿菌。9. 3)大腸桿菌fadE基因的敲除采用TargeTron 基因敲除系統(tǒng)(Sigma-Aldrich)對(duì)大腸桿菌的fadE基因進(jìn)行敲 除。9. 4)SDS_PAGE鑒定目標(biāo)蛋白的表達(dá)將活化后的工程大腸桿菌按1 100的接種量接種到10mL LB液體培養(yǎng)液中(內(nèi) 含50 ii g mL—1的卡那霉素和34 ii g mL—1氯霉素)，37°C，225rpm振蕩培養(yǎng)2h，在菌液中加 入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度0. lmmol化―1，然后轉(zhuǎn)入30°C，225rpm繼續(xù)培養(yǎng)3_4h，誘導(dǎo)表達(dá)目的 蛋白。取出誘導(dǎo)后的培養(yǎng)物，12000g離心2min，收集菌體，菌體細(xì)胞用0. 05mol/L的磷酸緩 沖液(pH7. 8)洗滌一次，按1 10的比例再用此緩沖液重懸細(xì)胞，加入等體積2 X SDS-PAGE 上樣緩沖液，煮沸l(wèi)Omin，瞬時(shí)高速離心，10% SDS-PAGE電泳檢測(cè)，即可檢測(cè)到目標(biāo)蛋白的 表達(dá)。9. 5)工程大腸桿菌的培養(yǎng)將工程大腸桿菌按1 100的比例接種到M9液體培養(yǎng)液中(內(nèi)含50 y g mL—1的卡那霉素和34 ii g mL—1氯霉素)，37°C，225rpm條件下振蕩培養(yǎng)，當(dāng)0D6(1(lnm為0. 6-0. 8時(shí)， 在菌液中加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度0. lmmol L—1，然后轉(zhuǎn)入在30°C，225rpm條件下，繼續(xù) 培養(yǎng) 18-24h。9. 6)烷烴的提取誘導(dǎo)培養(yǎng)后的菌液在12000g條件下，離心lOmin，收集上清液，并用等體積的正己 烷萃取2-3次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去正己烷后即得中短鏈烷烴。正己烷回收利用。9. 7)烷烴組成及含量的測(cè)定得到的烷烴通過(guò)GC-MS測(cè)定其組成及含量。實(shí)施例10通過(guò)在大腸桿菌中共同過(guò)量表達(dá)C. glutamicum的乙酰-CoA羧化酶基因 (dtsRl-accBC)，C. calophylla 的 Cc FatB2 基因，A. calcoaceticus 的 acrl 基因禾口 A. thaliana的CER1基因，并敲除大腸桿菌的fadE基因以用于生物合成中短鏈烷烴。方法 過(guò)程實(shí)施例9。實(shí)施例11通過(guò)在大腸桿菌中共同過(guò)量表達(dá)C. glutamicum的乙酰-CoA羧化酶基因 (dtsRl-accBC), C. hookeriana 的 Ch FatB2 基因，A. calcoaceticus 的 acrl 基因禾口 A. thaliana的CER1基因，并敲除大腸桿菌的fadE基因以用于生物合成中短鏈烷烴。方法 過(guò)程同實(shí)施例9。實(shí)施例12通過(guò)在大腸桿菌中共同過(guò)量表達(dá)C. glutamicum的乙酰-CoA羧化酶基因 (dtsRl-accBC), C. palustvis 的 Cp FatBi 基因，A. calcoaceticus 的 acrl 基因禾口 A. thaliana的CER1基因，并敲除大腸桿菌的fadE基因以用于生物合成中短鏈烷烴。方法 過(guò)程同實(shí)施例9。
權(quán)利要求
一種用于制備生物汽油的工程大腸桿菌，通過(guò)下述方法得到通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增乙酰 CoA羧化酶基因、硫脂酶基因、脂酰 CoA還原酶基因和脂肪醛脫羧酶基因，用膠回收試劑盒回收目的片段，然后分別雙酶切目的片段和原核表達(dá)載體pET 30a(+)或pACYCDuet 1，載體片斷膠回收后，將載體∶基因片段按摩爾比為1 2∶4 5的比例混合，加入T4DNA連接酶后4 7℃連接15 30小時(shí)，連接產(chǎn)物38 42℃熱擊轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布平板培養(yǎng)過(guò)夜，PCR篩選陽(yáng)性克?。魂?yáng)性克隆提取質(zhì)粒DNA，酶切和測(cè)序鑒定后，熱擊轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，最后敲除該工程大腸桿菌的fadE基因后即得目標(biāo)工程大腸桿菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程大腸桿菌，其中，該工程大腸桿菌經(jīng)異丙基硫 代-β -D-半乳糖苷誘導(dǎo)后過(guò)量表達(dá)硫脂酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程大腸桿菌，其中，該工程大腸桿菌經(jīng)異丙基硫 代-β -D-半乳糖苷誘導(dǎo)后過(guò)量表達(dá)脂酰-CoA還原酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程大腸桿菌，其中，該工程大腸桿菌經(jīng)異丙基硫 代- β -D-半乳糖苷誘導(dǎo)后過(guò)量表達(dá)脂肪醛脫羧酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程大腸桿菌，其中，該工程大腸桿菌經(jīng)異丙基硫 代- β -D-半乳糖苷誘導(dǎo)后過(guò)量表達(dá)乙酰-CoA羧化酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程大腸桿菌，其中，工程大腸桿菌通過(guò)搖瓶或發(fā)酵罐進(jìn)行 培養(yǎng)。
7.一種利用權(quán)利要求1所述工程大腸桿菌制備生物汽油的方法，將構(gòu)建好的工程大腸 桿菌以1-2 100-130的比例接種內(nèi)含卡那霉素和氯霉素的Μ9液體培養(yǎng)液中，35-37°C， 225rpm條件下培養(yǎng)至OD6citlnmS 0. 6-0. 8時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0. 1-0. 2mmol ·Ι^， 誘導(dǎo)目的蛋白的過(guò)量表達(dá)，然后轉(zhuǎn)入28-30°C，225rpm繼續(xù)培養(yǎng)18-24小時(shí)；培養(yǎng)后的菌液 離心取上清液，用等體積的正己烷萃取，減壓蒸發(fā)除去正己烷后制得生物汽油。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述制備生物汽油的方法，其中，生物汽油為C8-C12的烷烴
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述制備生物汽油的方法，其中，正己烷經(jīng)過(guò)減壓蒸餾后回收使用。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備生物汽油的方法，其中，所得脂肪醇通過(guò)GC-MS分析其 組成及含量。
全文摘要
一種用于制備中碳脂肪醇的工程大腸桿菌和制備中碳脂肪醇的方法，該方法通過(guò)在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)硫脂酶基因，脂酰-CoA還原酶基因和脂肪醛脫羧酶基因等，使大腸桿菌獲得生產(chǎn)生物汽油的能力，結(jié)合過(guò)量表達(dá)乙酰-CoA羧化酶基因并敲除大腸桿菌的脂酰-CoA脫氫酶基因，進(jìn)一步提高工程大腸桿菌的生物汽油的生產(chǎn)能力。該方法可用于新一代生物汽油的的生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C10L1/04GK101899412SQ200910090470
公開(kāi)日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2009年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月12日
發(fā)明者劉煒, 咸漠, 徐鑫, 楊建明, 鄭艷寧 申請(qǐng)人:青島生物能源與過(guò)程研究所