具有雙功能基團(tuán)的疏水性電荷誘導(dǎo)層析介質(zhì)及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有雙功能基團(tuán)的疏水性電荷誘導(dǎo)層析介質(zhì)及其制備方法。層析基質(zhì)依次加入二甲基亞砜和烯丙基溴進(jìn)行活化；活化基質(zhì)與N-溴代丁二酰亞胺反應(yīng)；將溴代醇化后的基質(zhì)與色氨酸溶液混合，偶聯(lián)色氨酸配基；依次用丙酮和二氧六環(huán)洗滌，并對(duì)色氨酸配基的羧基末端進(jìn)行活化；活化后依次用丙酮溶液和水洗滌，加入氨基苯并咪唑溶液反應(yīng)，偶聯(lián)氨基苯并咪唑配基；最后采用乙醇胺水溶液對(duì)未反應(yīng)的羧基末端進(jìn)行封閉。本發(fā)明所研制的新型層析介質(zhì)，兼有色氨酸和氨基苯并咪唑兩種功能配基，模仿抗體Fc片段特異性結(jié)合蛋白的關(guān)鍵位點(diǎn)殘基設(shè)計(jì)，在保留疏水性電荷誘導(dǎo)層析配基的特點(diǎn)上，對(duì)抗體的選擇性有大幅度提高，可以用于抗體的高效分離。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種具有雙功能基團(tuán)的疏水性電荷誘導(dǎo)層析介質(zhì)及其制備方法，屬于 生物化工領(lǐng)域中的蛋白層析分離技術(shù)。 具有雙功能基團(tuán)的疏水性電荷誘導(dǎo)層析介質(zhì)及其制備方法

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的迅速發(fā)展，對(duì)生物分離方法也提出了新的要求，越來越多的 生物產(chǎn)品需要高效的生物下游技術(shù)進(jìn)行分離和純化，其中層析技術(shù)是目前最有效的生物分 離和純化技術(shù)，而層析介質(zhì)是其中的關(guān)鍵。
[0003] 抗體是一種重要的生物技術(shù)產(chǎn)品，廣泛用于疾病治療、預(yù)防和診斷。隨著抗體工程 的發(fā)展，通過免疫方法制備多克隆抗體和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)制備單克隆抗體的技術(shù)已經(jīng)越來越 成熟，抗體種類不斷增多，制備規(guī)模也不斷擴(kuò)大，這就要求有高效的抗體分離純化技術(shù)與之 相適應(yīng)。
[0004] 抗體產(chǎn)品的質(zhì)量要求通常較高，純度一般大于90%，同時(shí)要求保持生物活性等，傳 統(tǒng)的分離技術(shù)常難以滿足要求。常規(guī)的離子交換層析和疏水相互作用層析能夠分離抗體， 但是特異性和選擇性較差，分離步驟較多，影響抗體純度和活性收率?；诘鞍譇或蛋白G 的親和層析，是目前抗體分離的通用技術(shù)，選擇性高，但介質(zhì)價(jià)格昂貴，且蛋白配基易被料 液中蛋白酶降解而脫落，增加后續(xù)分離的負(fù)擔(dān)，重復(fù)使用次數(shù)有限，因此操作成本較高，限 制其大規(guī)模應(yīng)用。
[0005] 上世紀(jì)80年代Porath等提出了含有砜基和巰基乙醇的親硫?qū)游觯≒orath et al. 1985，185: 306)用于抗體的分離，但是需要添加無機(jī)鹽以促進(jìn)吸附。 1998 年，Burton 和 Harding 提出了疏水性電荷誘導(dǎo)層析（Hydrophobic charge induction chromatography, HCIC)新方法，配基兼有疏水和離子化基團(tuán)，中性pH條件下通過疏水 作用結(jié)合蛋白，調(diào)節(jié)溶液pH使得蛋白和配基間產(chǎn)生靜電排斥，從而實(shí)現(xiàn)洗脫（Burton and Harding, 7； 次 1998，814: 71)。專利（US Patent 5, 652, 348)描述了 HCIC 介質(zhì)的制備方法。專利（US Patent 5,719,269;US Patent 7, 144, 743)也報(bào)導(dǎo)了 HCIC 介 質(zhì)的制備工藝。專利（CN101279243 ;CN101279244 ;CN101284224)報(bào)道了在HCIC介質(zhì)空間 臂中引入砜基來提高介質(zhì)對(duì)抗體的選擇性以及相關(guān)制備方法。這些HCIC介質(zhì)主要采用含 巰基的雜環(huán)化合物為配基，其功能基團(tuán)相對(duì)單一，抗體的選擇性有限，難以滿足從復(fù)雜料液 中直接分離高純度抗體的要求。因此，優(yōu)化設(shè)計(jì)配基結(jié)構(gòu)，開發(fā)特異性更強(qiáng)的HCIC介質(zhì)，對(duì) 于抗體的經(jīng)濟(jì)高效分離有著重要的意義。
[0006] 本發(fā)明在分析抗體Fc片段特異性結(jié)合天然配基的基礎(chǔ)上，提出雙功能基團(tuán)的概 念，設(shè)計(jì)了基于色氨酸和氨基苯并咪唑的新配基，偶聯(lián)到多孔微球基質(zhì)上，制備了新型的疏 水性電荷誘導(dǎo)層析介質(zhì)，改善了疏水基團(tuán)的空間排布，提高了抗體結(jié)合的選擇性，有效增強(qiáng) 了 pH誘導(dǎo)的靜電排斥作用，有利于抗體的高效洗脫，新介質(zhì)顯示出良好的抗體分離應(yīng)用前 旦 -5^ 〇


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種具有雙功能基團(tuán)的疏水性電荷誘導(dǎo)層析介質(zhì)及其制備 方法。
[0008] 具有雙功能基團(tuán)的疏水性電荷誘導(dǎo)層析介質(zhì)包括層析基質(zhì)和配基，所述的層析基 質(zhì)為帶有羥基的親水性多孔微球，所述的配基為色氨酸的羧基和氨基苯并咪唑的氨基反應(yīng) 后形成的雙功能配基，所述的氨基苯并咪唑?yàn)?-氨基苯并咪唑、4-氨基苯并咪唑或5-氨基 苯并咪唑。
[0009] 當(dāng)氨基苯并咪唑?yàn)?-氨基苯并咪唑時(shí)，層析介質(zhì)的結(jié)構(gòu)組成為： 當(dāng)氨基苯并咪唑?yàn)?-氨基苯并咪唑時(shí)，層析介質(zhì)的結(jié)構(gòu)組成為： 八廣 'r \ ， OH €Τ) 當(dāng)氨基苯并咪唑?yàn)?-氨基苯并咪唑時(shí)，層析介質(zhì)的結(jié)構(gòu)組成為： Η、 Ο:.?。丨一 . ·《 NW- ?^Γ)
[0010] 所述的層析基質(zhì)為具有多孔結(jié)構(gòu)和表面羥基的親水性微球。
[0011] 所述的層析基質(zhì)為瓊脂糖凝膠或纖維素微球。
[0012] 所述的配基為經(jīng)烯丙基溴活化后依次偶聯(lián)的色氨酸和氨基苯并咪唑。
[0013] 所述的具有雙功能基團(tuán)的疏水性電荷誘導(dǎo)層析介質(zhì)的制備方法包括如下步驟： 1)將層析基質(zhì)抽干后，加入0. 2-1倍層析基質(zhì)質(zhì)量的20% (v/v)二甲基亞砜、0. 1-1倍 層析基質(zhì)質(zhì)量的烯丙基溴和〇. 1-0. 5倍層析基質(zhì)質(zhì)量的氫氧化鈉，25°C下150rpm搖床中活 化8-48小時(shí)，抽濾，用去離子水洗滌得到活化層析基質(zhì)； 2) 將活化層析基質(zhì)和0. 1-0. 5倍層析基質(zhì)質(zhì)量的N-溴代丁二酰亞胺混合進(jìn)行溴代醇 化，25°C下150rpm搖床中反應(yīng)1-5小時(shí)，抽濾，用去離子水洗滌得到溴代醇化的層析基質(zhì)； 3) 將溴代醇化的層析基質(zhì)和0. 1-0. 3倍層析基質(zhì)質(zhì)量的色氨酸以及0. 5-1M碳酸鈉緩 沖液混合，碳酸鈉緩沖液的pH為10-12, 25°C下150rpm搖床中反應(yīng)8-24小時(shí)，得到色氨酸 偶聯(lián)的介質(zhì)； 4) 取色氨酸偶聯(lián)的介質(zhì)，分別用體積百分比為30%、70%和100%的丙酮溶液清洗，再 用二氧六環(huán)清洗，加入0. 1-1倍層析基質(zhì)質(zhì)量的二氧六環(huán)、N-羥基琥珀酰亞胺和N，N-二 環(huán)己基碳酰亞胺，N-羥基琥珀酰亞胺濃度為0. 1-0. 5g/ml，N，N-二環(huán)己基碳酰亞胺濃度為 0. 1-0. 5g/ml，25°C振蕩8-24小時(shí)，得到N-羥基琥珀酰亞胺活化的介質(zhì)； 5) 取N-羥基琥珀酰亞胺活化的介質(zhì)，依次用體積百分比為70%和30%的丙酮溶液清 洗，去離子水洗滌，加入0. 5-2倍層析基質(zhì)質(zhì)量的20mg/ml氨基苯并咪唑溶液，25°C下150 rpm水浴搖床中反應(yīng)8-24小時(shí)；最后將介質(zhì)抽濾，去離子水洗滌，加入到含有1-5倍層析基 質(zhì)質(zhì)量的乙醇胺中，25°C下150rpm搖床中反應(yīng)2-8小時(shí)，去離子水洗滌，得到具有色氨酸和 氨基苯并咪唑雙功能配基的疏水性電荷誘導(dǎo)層析介質(zhì)，其配基密度為30-100 μ mol/ml。
[0014] 本發(fā)明以色氨酸和氨基苯并咪唑?yàn)殡p功能配基制備新型的疏水性電荷誘導(dǎo)層析 介質(zhì)，既保留了傳統(tǒng)疏水性電荷誘導(dǎo)層析的優(yōu)點(diǎn)，又通過仿生學(xué)模仿抗體Fc片段特異性結(jié) 合天然配基關(guān)鍵殘基的空間分布，引入雙功能基團(tuán)的概念，優(yōu)化配基的空間排布，提高抗體 結(jié)合的選擇性，因此具有獨(dú)特的分離性能。主要特點(diǎn)體現(xiàn)在：首先，抗體吸附量大，特異性 高，靜態(tài)吸附容量可達(dá)l〇〇mg/ml介質(zhì)以上，且在較寬的電導(dǎo)率范圍（O-lOOmS/cm)都能保持 高吸附容量，顯示出非鹽依賴的吸附特性，無需對(duì)料液進(jìn)行稀釋或加鹽處理；其次，僅需調(diào) 節(jié)溶液pH至4-6,借助配基-蛋白間的靜電排斥力，就可實(shí)現(xiàn)蛋白的快速洗脫；其三，采用 烯丙基溴活化偶聯(lián)色氨酸，并通過酰胺鍵與氨基苯并咪唑進(jìn)一步偶聯(lián)，所得介質(zhì)性能穩(wěn)定， 清洗再生方便。本發(fā)明的關(guān)鍵在于引入了色氨基側(cè)鏈吲哚基團(tuán)，與氨基苯并咪唑配基形成 空間互補(bǔ)，賦予了新介質(zhì)獨(dú)特的雙功能基團(tuán)分布，大大改善了傳統(tǒng)單一基團(tuán)結(jié)合選擇性有 限的缺點(diǎn)，提高了抗體結(jié)合的選擇性，顯示出良好的抗體分離應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1是實(shí)施例1中的層析基質(zhì)和偶聯(lián)2-氨基苯并咪唑的層析介質(zhì)的紅外譜圖，其 中743. lcnT1為N-Η的伸縮峰，1463. 2和1638. 2 cnT1為苯環(huán)基團(tuán)的特征峰，表明配基成功 偶聯(lián)； 圖2是采用實(shí)施例1所得到的層析介質(zhì)從單克隆抗體細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分離純化抗體 的電泳分析圖，其中洗脫1和洗脫2分別是pH5和pH4. 5洗脫得到的抗體樣品。

【具體實(shí)施方式】
[0016] 以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述： 實(shí)施例1 取抽干瓊脂糖凝膠l〇g，加入2g 20% (v/v)二甲基亞砜、lg烯丙基溴和lg氫氧化鈉， 25°C下150rpm搖床中活化8小時(shí)，抽濾，用去離子水洗滌得到活化的層析基質(zhì)；然后將活化 的層析基質(zhì)、lg N-溴代丁二酰亞胺混合進(jìn)行溴代醇化，25°C下150rpm搖床中反應(yīng)1小時(shí)， 抽濾，用去離子水洗滌；接著將溴代醇化的層析基質(zhì)和lg色氨酸以及pH為10的0. 5M碳 酸鈉緩沖液混合，25°C下150rpm搖床中反應(yīng)8小時(shí)，得到色氨酸偶聯(lián)的介質(zhì)；取色氨酸偶聯(lián) 后的介質(zhì)，分別用30%、70%和100%丙酮溶液洗滌，再用100%二氧六環(huán)清洗并抽干，加入lg 的二氧六環(huán)、一定量的N-羥基琥珀酰亞胺和N，N-二環(huán)己基碳酰亞胺，使得其中N-羥基琥 珀酰亞胺濃度為〇. lg/ml和N，N-二環(huán)己基碳酰亞胺濃度為0. lg/ml，25°C振蕩8小時(shí)；取 N-羥基琥珀酰亞胺活化的介質(zhì)依次用70%和30%丙酮溶液洗滌，然后用大量去離子水清洗 干凈，加入5g的20mg/ml 2-氨基苯并咪唑溶液，25°C下150 rpm水浴搖床中反應(yīng)8小時(shí)； 最后將介質(zhì)抽濾，用去離子水洗漆，加入到l〇g乙醇胺中，25?下150rpm搖床中反應(yīng)2小 時(shí)，去離子水洗滌，得到以色氨酸和2-氨基苯并咪唑?yàn)殡p功能配基的疏水性電荷誘導(dǎo)層析 介質(zhì)，配基密度約為30 μ mol/ml。
[0017] 實(shí)施例2 取抽干瓊脂糖凝膠l〇g，加入l〇g 20%(v/v)二甲基亞砜、10g烯丙基溴和5g氫氧化鈉， 25°C下150rpm搖床中活化48小時(shí)，抽濾，用去離子水洗滌得到活化的層析基質(zhì)；然后將活 化的層析基質(zhì)、5g N-溴代丁二酰亞胺混合進(jìn)行溴代醇化，25°C下150rpm搖床中反應(yīng)1小 時(shí)，抽濾，用去離子水洗滌；接著將溴代醇化的層析基質(zhì)和3g色氨酸以及pH為12的1M碳 酸鈉緩沖液混合，25°C下150rpm搖床中反應(yīng)24小時(shí)，得到色氨酸偶聯(lián)的介質(zhì)；取色氨酸偶 聯(lián)后的介質(zhì)，分別用30%、70%和100%丙酮溶液洗滌，再用100%二氧六環(huán)清洗并抽干，加入 10g的二氧六環(huán)、一定量的N-羥基琥珀酰亞胺和N，N-二環(huán)己基碳酰亞胺，使得其中N-羥基 琥珀酰亞胺濃度為〇. 5g/ml和N，N-二環(huán)己基碳酰亞胺濃度為0. 5g/ml，25°C振蕩24小時(shí)； 取N-羥基琥珀酰亞胺活化的介質(zhì)依次用70%和30%丙酮溶液洗滌，然后用大量去離子水清 洗干凈，加入20g的20mg/ml 2-氨基苯并咪唑溶液，25°C下150 rpm水浴搖床中反應(yīng)8小 時(shí)；最后將介質(zhì)抽濾，用去離子水洗漆，加入到50g乙醇胺中，25?下150rpm搖床中反應(yīng)8 小時(shí)，去離子水洗滌，得到以色氨酸和2-氨基苯并咪唑?yàn)殡p功能配基的疏水性電荷誘導(dǎo)層 析介質(zhì)，配基密度約為lOOumol/ml。
[0018] 實(shí)施例3 取抽干瓊脂糖凝膠l〇g，加入2g 20% (v/v)二甲基亞砜、lg烯丙基溴和lg氫氧化鈉， 25°C下150rpm搖床中活化8小時(shí)，抽濾，用去離子水洗滌得到活化的層析基質(zhì)；然后將活化 的層析基質(zhì)、lg N-溴代丁二酰亞胺混合進(jìn)行溴代醇化，25°C下150rpm搖床中反應(yīng)1小時(shí)， 抽濾，用去離子水洗滌；接著將溴代醇化的層析基質(zhì)和lg色氨酸以及pH為10的0. 5M碳 酸鈉緩沖液混合，25°C下150rpm搖床中反應(yīng)8小時(shí)，得到色氨酸偶聯(lián)的介質(zhì)；取色氨酸偶聯(lián) 后的介質(zhì)，分別用30%、70%和100%丙酮溶液洗滌，再用100%二氧六環(huán)清洗并抽干，加入lg 的二氧六環(huán)、一定量的N-羥基琥珀酰亞胺和N，N-二環(huán)己基碳酰亞胺，使得其中NHS濃度為 0. lg/ml和N，N-二環(huán)己基碳酰亞胺濃度為0. lg/ml，25°C振蕩8小時(shí)；取N-羥基琥珀酰亞 胺活化的介質(zhì)依次用70%和30%丙酮溶液洗滌，然后用大量去離子水清洗干凈，加入5g的 20mg/ml 4-氨基苯并咪唑溶液，25°C下150 rpm水浴搖床中反應(yīng)8小時(shí)；最后將介質(zhì)抽濾， 用去離子水洗滌,加入到l〇ml乙醇胺中，25°C下150rpm搖床中反應(yīng)2小時(shí)，去離子水洗滌， 得到以色氨酸和4-氨基苯并咪唑?yàn)殡p功能配基的疏水性電荷誘導(dǎo)層析介質(zhì)，配基密度約 為 30 μ mol/ml。
[0019] 實(shí)施例4 取抽干瓊脂糖凝膠l〇g，加入l〇g 20% (v/v)二甲基亞砜、10gl烯丙基溴和5g氫氧化 鈉，25°C下150rpm搖床中活化48小時(shí)，抽濾，用去離子水洗滌得到活化的層析基質(zhì)；然后將 活化的層析基質(zhì)、5g N-溴代丁二酰亞胺混合進(jìn)行溴代醇化，25°C下150rpm搖床中反應(yīng)1小 時(shí)，抽濾，用去離子水洗滌；接著將溴代醇化的層析基質(zhì)和3g色氨酸以及pH為12的1M碳 酸鈉緩沖液混合，25°C下150rpm搖床中反應(yīng)24小時(shí)，得到色氨酸偶聯(lián)的介質(zhì)；取色氨酸偶 聯(lián)后的介質(zhì)，分別用30%、70%和100%丙酮溶液洗滌，再用100%二氧六環(huán)清洗并抽干，加入 10g的二氧六環(huán)、一定量的N-羥基琥珀酰亞胺和N，N-二環(huán)己基碳酰亞胺，使得其中N-羥基 琥珀酰亞胺濃度為〇. 5g/ml和N，N-二環(huán)己基碳酰亞胺濃度為0. 5g/ml，25°C振蕩24小時(shí)； 取N-羥基琥珀酰亞胺活化的介質(zhì)依次用70%和30%丙酮溶液洗滌，然后用大量去離子水清 洗干凈，加入20g的20mg/ml 4-氨基苯并咪唑溶液，25°C下150 rpm水浴搖床中反應(yīng)8小 時(shí)；最后將介質(zhì)抽濾，用去離子水洗漆，加入到50g乙醇胺中，25?下150rpm搖床中反應(yīng)8 小時(shí)，去離子水洗滌，得到以色氨酸和4-氨基苯并咪唑?yàn)殡p功能配基的疏水性電荷誘導(dǎo)層 析介質(zhì)，配基密度約為lOOumol/ml。
[0020] 實(shí)施例5 取抽干瓊脂糖凝膠l〇g，加入2g 20% (v/v)二甲基亞砜、lg烯丙基溴和lg氫氧化鈉， 25°C下150rpm搖床中活化8小時(shí)，抽濾，用去離子水洗滌得到活化的層析基質(zhì)；然后將活化 的層析基質(zhì)、lg N-溴代丁二酰亞胺混合進(jìn)行溴代醇化，25°C下150rpm搖床中反應(yīng)1小時(shí)， 抽濾，用去離子水洗滌；接著將溴代醇化的基質(zhì)和lg色氨酸以及pH為10的0. 5M碳酸鈉 緩沖液混合，25°C下150rpm搖床中反應(yīng)8小時(shí)，得到色氨酸偶聯(lián)的介質(zhì)；取色氨酸偶聯(lián)后的 介質(zhì)，分別用30%、70%和100%丙酮溶液洗滌，再用100%二氧六環(huán)清洗并抽干，加入lg的二 氧六環(huán)、一定量的N-羥基琥珀酰亞胺和N，N-二環(huán)己基碳酰亞胺，使得其中N-羥基琥珀酰 亞胺濃度為〇. lg/ml和N，N-二環(huán)己基碳酰亞胺濃度為0. lg/ml，25°C振蕩8小時(shí)；取N-羥 基琥珀酰亞胺活化的介質(zhì)依次用70%和30%丙酮溶液洗滌，然后用大量去離子水清洗干凈， 加入5g的20mg/ml 5-氨基苯并咪唑溶液，25°C下150 rpm水浴搖床中反應(yīng)8小時(shí)；最后將 介質(zhì)抽濾，用去離子水洗滌，加入到l〇g乙醇胺中，25°C下150rpm搖床中反應(yīng)2小時(shí)，去離 子水洗滌，得到以色氨酸和5-氨基苯并咪唑?yàn)殡p功能配基的疏水性電荷誘導(dǎo)層析介質(zhì)，配 基密度約為30ymol/ml。
[0021] 實(shí)施例6 取抽干瓊脂糖凝膠l〇g，加入l〇g 20%(v/v)二甲基亞砜、10g烯丙基溴和5g氫氧化鈉， 25°C下150rpm搖床中活化48小時(shí)，抽濾，用去離子水洗滌得到活化的層析基質(zhì)；然后將活 化的層析基質(zhì)、5g N-溴代丁二酰亞胺混合進(jìn)行溴代醇化，25°C下150rpm搖床中反應(yīng)1小 時(shí)，抽濾，用去離子水洗滌；接著將溴代醇化的層析基質(zhì)和3g色氨酸以及pH為12的1M碳 酸鈉緩沖液混合，25°C下150rpm搖床中反應(yīng)24小時(shí)，得到色氨酸偶聯(lián)的介質(zhì)；取色氨酸偶 聯(lián)后的介質(zhì)，分別用30%、70%和100%丙酮溶液洗滌，再用100%二氧六環(huán)清洗并抽干，加入 10g的二氧六環(huán)、一定量的N-羥基琥珀酰亞胺和N，N-二環(huán)己基碳酰亞胺，使得其中N-羥基 琥珀酰亞胺濃度為〇. 5g/ml和N，N-二環(huán)己基碳酰亞胺濃度為0. 5g/ml，25°C振蕩24小時(shí)； 取N-羥基琥珀酰亞胺活化的介質(zhì)依次用70%和30%丙酮溶液洗滌，然后用大量去離子水清 洗干凈，加入20g的20mg/ml 5-氨基苯并咪唑溶液，25°C下150 rpm水浴搖床中反應(yīng)8小 時(shí)；最后將介質(zhì)抽濾，用去離子水洗漆，加入到50g乙醇胺中，25?下150rpm搖床中反應(yīng)8 小時(shí)，去離子水洗滌，得到以色氨酸和5-氨基苯并咪唑?yàn)殡p功能配基的疏水性電荷誘導(dǎo)層 析介質(zhì)，配基密度約為lOOumol/ml。
[0022] 實(shí)施例7 取抽干瓊脂糖凝膠l〇g，加入5g 20%(v/v)二甲基亞砜、5g烯丙基溴和2. 5g氫氧化鈉， 25°C下150rpm搖床中活化16小時(shí)，抽濾，用去離子水洗滌得到活化的層析基質(zhì)；然后將活 化的層析基質(zhì)、2g N-溴代丁二酰亞胺混合進(jìn)行溴代醇化，25°C下150rpm搖床中反應(yīng)4小 時(shí)，抽濾，用去離子水洗滌；接著將溴代醇化的層析基質(zhì)和2g色氨酸以及pH為12的0. 5M 碳酸鈉緩沖液混合，25°C下150rpm搖床中反應(yīng)20小時(shí)，得到色氨酸偶聯(lián)的介質(zhì)；取色氨酸 偶聯(lián)后的介質(zhì)，分別用30%、70%和100%丙酮溶液洗滌，再用100%二氧六環(huán)清洗并抽干，力口 入5g的二氧六環(huán)、一定量的N-羥基琥珀酰亞胺和N，N-二環(huán)己基碳酰亞胺，使得其中N-羥 基琥珀酰亞胺濃度為0. 3g/ml和N，N-二環(huán)己基碳酰亞胺濃度為0. 3g/ml，25°C振蕩8小時(shí)； 取N-羥基琥珀酰亞胺活化的介質(zhì)依次用70%和30%丙酮溶液洗滌，然后用大量去離子水清 洗干凈，加入l〇g的20mg/ml 2-氨基苯并咪唑溶液，25°C下150 rpm水浴搖床中反應(yīng)8小 時(shí)；最后將介質(zhì)抽濾，用去離子水洗漆，加入到5g乙醇胺中，25°C下150rpm搖床中反應(yīng)4小 時(shí)，去離子水洗滌，得到以色氨酸和2-氨基苯并咪唑?yàn)殡p功能配基的疏水性電荷誘導(dǎo)層析 介質(zhì)，配基密度約為60 μ mol/ml。
[0023] 實(shí)施例8 取抽干纖維素微球l〇g，加入6g 20%(v/v)二甲基亞砜、5g烯丙基溴和2. 5g氫氧化鈉， 25°C下150rpm搖床中活化24小時(shí)，抽濾，用去離子水洗滌得到活化的層析基質(zhì)；然后將活 化的層析基質(zhì)、5g N-溴代丁二酰亞胺混合進(jìn)行溴代醇化，25°C下150rpm搖床中反應(yīng)2小 時(shí)，抽濾，用去離子水洗滌；接著將溴代醇化的層析基質(zhì)和2g色氨酸以及pH為11的1M碳 酸鈉緩沖液混合，25°C下150rpm搖床中反應(yīng)16小時(shí)，得到偶聯(lián)色氨酸的介質(zhì)；取色氨酸偶 聯(lián)后的介質(zhì)，分別用30%、70%和100%丙酮溶液洗滌，再用100%二氧六環(huán)清洗并抽干，加入 8g的二氧六環(huán)、一定量的N-羥基琥珀酰亞胺和N，N-二環(huán)己基碳酰亞胺，使得其中N-羥基 琥珀酰亞胺濃度為〇. 2g/ml和N，N-二環(huán)己基碳酰亞胺濃度為0. 3g/ml，25°C振蕩24小時(shí)； 取N-羥基琥珀酰亞胺活化的介質(zhì)依次用70%和30%丙酮溶液洗滌，然后用大量去離子水清 洗干凈，加入15g的20mg/ml 2-氨基苯并咪唑溶液，25°C下150 rpm水浴搖床中反應(yīng)10小 時(shí)；最后將介質(zhì)抽濾，用去離子水洗漆，加入到8g乙醇胺中，25°C下150rpm搖床中反應(yīng)2小 時(shí)，去離子水洗滌，得到以色氨酸和2-氨基苯并咪唑?yàn)殡p功能配基的疏水性電荷誘導(dǎo)層析 介質(zhì)，配基密度約為75 μ mol/ml。
[0024] 實(shí)施例9 取抽干纖維素微球l〇g，加入6g 20% (v/v)二甲基亞砜、5g烯丙基溴和4g氫氧化鈉， 25°C下150rpm搖床中活化24小時(shí)，抽濾，用去離子水洗滌得到活化的層析基質(zhì)；然后將活 化的層析基質(zhì)、3g N-溴代丁二酰亞胺混合進(jìn)行溴代醇化，25°C下150rpm搖床中反應(yīng)4小 時(shí)，抽濾，用去離子水洗滌；接著將溴代醇化的層析基質(zhì)和lg色氨酸以及〇. 5M碳酸鈉緩沖 液（pHll)混合，25°C下150rpm搖床中反應(yīng)15小時(shí)，得到色氨酸偶聯(lián)的介質(zhì)；取色氨酸偶 聯(lián)后的介質(zhì)，分別用30%、70%和100%丙酮溶液洗滌，再用100%二氧六環(huán)清洗并抽干，加入 10g的二氧六環(huán)、一定量的N-羥基琥珀酰亞胺和N，N-二環(huán)己基碳酰亞胺，使得其中N-羥基 琥珀酰亞胺濃度為0. 3g/ml和N，N-二環(huán)己基碳酰亞胺濃度為0. 3g/ml，25°C振蕩6小時(shí)； 取N-羥基琥珀酰亞胺活化的介質(zhì)依次用70%和30%丙酮溶液洗滌，然后用大量去離子水清 洗干凈，加入12g的20mg/ml 5-氨基苯并咪唑溶液，25°C下150 rpm水浴搖床中反應(yīng)16小 時(shí)；最后將介質(zhì)抽濾，用去離子水洗漆，加入到l〇g乙醇胺中，25°C下150rpm搖床中反應(yīng)8 小時(shí)，去離子水洗滌，得到以色氨酸和5-氨基苯并咪唑?yàn)殡p功能配基的疏水性電荷誘導(dǎo)層 析介質(zhì)，配基密度約為50ymol/ml。
【權(quán)利要求】
1. 一種具有雙功能基團(tuán)的疏水性電荷誘導(dǎo)層析介質(zhì)，其特征在于包括層析基質(zhì)和配 基，所述的層析基質(zhì)為帶有羥基的親水性多孔微球，所述的配基為色氨酸的羧基和氨基苯 并咪唑的氨基反應(yīng)后形成的雙功能配基，所述的氨基苯并咪唑?yàn)?-氨基苯并咪唑、4-氨基 苯并咪唑或5-氨基苯并咪唑， 當(dāng)氨基苯并咪唑?yàn)?-氨基苯并咪唑時(shí)，層析介質(zhì)的結(jié)構(gòu)組成為： CH I ， Cf'] 當(dāng)氨基苯并咪唑?yàn)?-氨基苯并咪唑時(shí)，層析介質(zhì)的結(jié)構(gòu)組成為： hZ'X \=J 丫Ο， OH ?Τ) 當(dāng)氨基苯并咪唑?yàn)?-氨基苯并咪唑時(shí)，層析介質(zhì)的結(jié)構(gòu)組成為： /<1 ，r；c-vH--# \- 一? 一八、 / \,s=s,/ ............. :，人，
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有雙功能基團(tuán)的疏水性電荷誘導(dǎo)層析介質(zhì)，其特征在于所 述的層析基質(zhì)為具有多孔結(jié)構(gòu)和表面羥基的親水性微球。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的具有雙功能基團(tuán)的疏水性電荷誘導(dǎo)層析介質(zhì)，其特征在 于層析基質(zhì)為瓊脂糖凝膠或纖維素微球。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有雙功能基團(tuán)的疏水性電荷誘導(dǎo)層析介質(zhì)，其特征在于所 述的配基為經(jīng)烯丙基溴活化后依次偶聯(lián)的色氨酸和氨基苯并咪唑。
5. -種如權(quán)利要求1所述的具有雙功能基團(tuán)的疏水性電荷誘導(dǎo)層析介質(zhì)的制備方法， 其特征在于包括如下步驟： 1) 將層析基質(zhì)抽干后，加入0. 2-1倍層析基質(zhì)質(zhì)量的20% (v/v)二甲基亞砜、0. 1-1倍 層析基質(zhì)質(zhì)量的烯丙基溴和〇. 1-0. 5倍層析基質(zhì)質(zhì)量的氫氧化鈉，25°C下150rpm搖床中活 化8-48小時(shí)，抽濾，用去離子水洗滌得到活化層析基質(zhì)； 2) 將活化層析基質(zhì)和0. 1-0. 5倍層析基質(zhì)質(zhì)量的N-溴代丁二酰亞胺混合進(jìn)行溴代醇 化，25°C下150rpm搖床中反應(yīng)1-5小時(shí)，抽濾，用去離子水洗滌得到溴代醇化的層析基質(zhì)； 3) 將溴代醇化的層析基質(zhì)和0. 1-0. 3倍層析基質(zhì)質(zhì)量的色氨酸以及0. 5-1M碳酸鈉緩 沖液混合，碳酸鈉緩沖液的pH為10-12, 25°C下150rpm搖床中反應(yīng)8-24小時(shí)，得到色氨酸 偶聯(lián)的介質(zhì)； 4) 取色氨酸偶聯(lián)的介質(zhì)，分別用體積百分比為30%、70%和100%的丙酮溶液清洗，再 用二氧六環(huán)清洗，加入0. 1-1倍層析基質(zhì)質(zhì)量的二氧六環(huán)、N-羥基琥珀酰亞胺和N，N-二 環(huán)己基碳酰亞胺，N-羥基琥珀酰亞胺濃度為0. 1-0. 5g/ml，N，N-二環(huán)己基碳酰亞胺濃度為 0. 1-0. 5g/ml，25°C振蕩8-24小時(shí)，得到N-羥基琥珀酰亞胺活化的介質(zhì)； 5) 取N-羥基琥珀酰亞胺活化的介質(zhì)，依次用體積百分比為70%和30%的丙酮溶液清 洗，去離子水洗滌，加入0. 5-2倍層析基質(zhì)質(zhì)量的20mg/ml氨基苯并咪唑溶液，25°C下150 rpm水浴搖床中反應(yīng)8-24小時(shí)；最后將介質(zhì)抽濾，去離子水洗滌，加入到含有1-5倍層析基 質(zhì)質(zhì)量的乙醇胺中，25°C下150rpm搖床中反應(yīng)2-8小時(shí)，去離子水洗滌，得到具有色氨酸和 氨基苯并咪唑雙功能配基的疏水性電荷誘導(dǎo)層析介質(zhì)，其配基密度為30-100 μ mol/ml。
【文檔編號(hào)】B01J20/282GK104117345SQ201410198979
【公開日】2014年10月29日 申請(qǐng)日期:2014年5月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月13日
【發(fā)明者】林東強(qiáng), 童紅飛, 姚善涇 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)