專利名稱：：一種分泌表達(dá)重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子-2的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種優(yōu)化分泌表達(dá)重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子(rhKGF-2)的制備方法，以及用于該方法的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。
背景技術(shù)：
：角質(zhì)細(xì)胞生長因子(keratinocytegrowthfactor，KGF)是在1989年由Rubin等從人胎肺成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)上清中分離并純化的，并發(fā)現(xiàn)具有促進(jìn)小鼠角質(zhì)細(xì)胞有絲分裂的作用，故將其定名為角質(zhì)細(xì)胞生長因子。1996年Yamasaki等從鼠的胚胎中擴(kuò)增出一種新的生長因子，即與KGF密切相關(guān)的另一種新的細(xì)胞因子，稱為KGF-2，又叫作成纖維細(xì)胞生長因子-10(FGF-10)。之后Emoto等從人肺中克隆到人KGF-2的cDNA，該基因定位于人第5號染色體5pl2-5pl3，人FGF-10由624個(gè)核甘酸組成，編碼208個(gè)氨基酸，分子量為19.3KD，與KGF-1有57%的同源性。KGF-2主要由間充質(zhì)細(xì)胞合成，通過與上皮細(xì)胞細(xì)胞膜上的受體作用，特異性促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖、分化和遷移，是胚胎器官發(fā)育中重要的多功能信號分子。KGF-2與KGF-1的生物學(xué)功能到目前研究為止有許多相同之處，如都能增加表面外胚層來源的上皮細(xì)胞增生，對其它細(xì)胞則無作用；由間充質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，以旁分泌的方式作用于上皮細(xì)胞等。但KGF-2在促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、減少瘢痕形成等方面優(yōu)于KGF-l，這些特點(diǎn)使KGF-2更適合于開發(fā)新的治療創(chuàng)傷的基肉工程藥物。KGF-2能夠通過刺激表皮細(xì)胞的增殖、遷移和分化直接促進(jìn)傷口的愈合，在組織的重塑過程中起趨化作用。KGF-2通過與損傷位點(diǎn)黏膜的表皮細(xì)胞上的受體結(jié)合，引起細(xì)胞向受傷處遷移，保護(hù)角質(zhì)細(xì)胞免受R0S誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，由此來加快傷口的愈合。此外，KGF-2同時(shí)也能通過刺激其他在組織修復(fù)和再生過程中有著非常重要作用的細(xì)胞因子(如血小板衍生生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子和成纖維細(xì)胞生長因子)的表達(dá)來間接作用于組織的重塑。KGF-2對皮膚的切口損傷修復(fù)過程有明顯的改善，可用于加速外科手術(shù)后的傷口愈合。此外，KGF-2對移植皮膚的愈合也具有極顯著的促進(jìn)作用。這可能是因?yàn)樗軌蛟黾觽谔幍臋C(jī)械張力和傷口膠原蛋白含量，促進(jìn)表皮細(xì)胞的生長，加快上皮和肉芽組織的形成，加速創(chuàng)口愈合。因此KGF-2可能是細(xì)胞內(nèi)起動(dòng)和加速傷口愈合的一個(gè)十分重要的媒介物。同時(shí)有研究表明，在這一過程中KGF-2能夠增加TGF-a和PDGF-AB的分泌，而這一效應(yīng)說明KGF-2可能正是作用于角質(zhì)細(xì)胞、纖維原細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，以及促進(jìn)表皮再生的媒介分子。KGF-2對于異體骨髓移植后引起的移植物抗宿主病也有一定的抑制作用。異體骨髓移植是惡性血液疾病的首選治療方法，這個(gè)方法的效果與移植物抗白血病反應(yīng)有很大的關(guān)系，而GVHD則是使骨髓移植受限的主要因素，是異體骨髓移植術(shù)后的主要并發(fā)癥，急性GVHD主要引起皮膚、肝臟和腸道等多器官上皮細(xì)胞壞死。Clouthier等用鼠科動(dòng)物BMT模型B63B6D2F1來研究KGF-2對于GVHD的影響。受試小鼠在給予KGF-2(每天5mg/kg)后，全身性的GVHD和靶器官的組織病理方面均有明顯的降低。與對照組相比，KGF-2同時(shí)還導(dǎo)致小鼠的血清中腫瘤壞死因子-a水平和脂多糖水平的下降。相反，KGF-2并不影響T細(xì)胞的增殖、細(xì)胞因子的產(chǎn)生或?qū)顾拗骺乖募?xì)胞毒反應(yīng)。動(dòng)物模型的研究表明，在預(yù)防輻射對正常機(jī)體造成的損傷方面，KGF-2有非常顯著的作用。它能提高骨髓對全身輻射的耐受性，保護(hù)小腸隱窩免受輻射損傷，降低輻射引起的胃腸道損傷，預(yù)防粘膜炎的發(fā)生，并能調(diào)節(jié)和維持干細(xì)胞的分裂及存活。此外，KGF-2對漬瘍和腸炎也有很好的療效，靜脈注射KGF-2幾乎能完全恢復(fù)小鼠腸道表面的正常細(xì)胞構(gòu)造，顯著降低急性和慢性腸損傷。持續(xù)的KGF-2給藥，能維持小鼠正常體重，改善宏觀和微觀腸炎癥和潰瘍，并且沒有明顯的毒副作用。目前，美國人類基因組科學(xué)公司正在進(jìn)行三項(xiàng)KGF-2的II期臨床實(shí)驗(yàn)一是靜脈潰瘍；二是骨髓移植前高劑量化療引起的粘膜炎；三是潰瘍性大腸炎。其中靜脈潰瘍的實(shí)驗(yàn)已基本完成，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了KGF-2良好的療效和安全性。KGF-2作為一種新型多肽類藥物有著廣闊的開發(fā)和應(yīng)用前景。目前國際上的rhKGF-2大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)工藝，其表達(dá)產(chǎn)物無論是否以可溶性蛋白形式存在，都表達(dá)于胞漿內(nèi)，且必須經(jīng)過超聲波破碎菌體后才能使蛋白釋放出來，不但對蛋白本身有破壞作用，而且也增加了純化的難度與成本。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種新型簡易的制備方法，在不用通過超聲波完全破碎菌體的情況下就能夠獲得人角質(zhì)細(xì)胞生長因子-2，從而減少粗提時(shí)對蛋白的破壞，簡化純化步驟，提高成品的產(chǎn)量。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種簡便并且高效的制備rhKGF-2的方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種用于該方法的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種優(yōu)化的表達(dá)人角質(zhì)細(xì)胞生長因子-2的表達(dá)載體，它含有分泌信號肽編碼序列，能將KGF-2蛋白分泌到細(xì)胞周質(zhì)中表達(dá)，即為pET22b(+)。在本發(fā)明的第二方面我們將KGF-2正確編碼序列應(yīng)用^Vco/禾n歷V^/7/酶切后插入到分泌信號肽pe/5的后面，這樣設(shè)計(jì)的好處在于我們可以得到與天然KGF-2氨基酸序列相同的蛋白質(zhì)序列而不用擔(dān)心有其他雜質(zhì)氨基酸摻入。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種宿主細(xì)胞，它含有本發(fā)明上述的表達(dá)載體編碼人角質(zhì)細(xì)胞生長因子-2的DNA序列。所述的宿主細(xì)胞是大腸桿菌BL21(DE3)。該菌體的細(xì)胞壁較脆弱，在反復(fù)凍融的條件下就可破裂，釋放出周質(zhì)間隙中的蛋白。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種生產(chǎn)人角質(zhì)細(xì)胞生長因子-2的方法，它包括步驟(a)通過LB培養(yǎng)基和改良種子培養(yǎng)基進(jìn)行工程菌的活化和擴(kuò)增，在適當(dāng)?shù)墓迌?nèi)培養(yǎng)基及補(bǔ)料方式，培養(yǎng)參數(shù)控制條件下表達(dá)外源蛋白角質(zhì)細(xì)胞生長因子-2;(b)通過低溫高速離心或超濾方式獲得含外源蛋白角質(zhì)細(xì)胞生長因子-2的菌體。在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體是含IPTG誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的表達(dá)載體pET22b(+)-rhKGF-2，或者所述的宿主細(xì)胞是大腸桿菌。在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)中進(jìn)行高密度發(fā)酵。在另一優(yōu)選例中，所述的步驟(b)包括步驟(i)采用凍融破碎發(fā)酵菌體，低溫高速離心棄沉淀收上清；(ii)通過鹽析和或超濾對破菌液上清液進(jìn)行初步純化；(iii)柱層析采用陽離子交換層析、親和層析、凝膠過濾層析及其組合。在另一優(yōu)選例中，所述的培養(yǎng)條件是培養(yǎng)溫度為3237'C，更佳地3537°C;pH在68之間，更佳地在6.87.3之間；葡萄糖或甘油濃度為110%，更佳地在36%;誘導(dǎo)劑IPTGO.1lmM，更佳地在0.50.8raM;誘導(dǎo)前0D,在0.820之間，更佳地在1518之間；誘導(dǎo)時(shí)間28小時(shí)，更佳地46小時(shí)。圖1:表達(dá)載體pET22b(+)-rhKGF-2的構(gòu)建線路圖。具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，用優(yōu)選的載體pET22b(+)進(jìn)行表達(dá)，該載體有助于rhKGF-2真核基因在原核中的正確折疊，并以可溶性形式分泌到細(xì)胞周質(zhì)間隙中，只通過反復(fù)凍融菌體就可釋放出目的蛋白，從而簡化了分離純化工藝。在另一優(yōu)選例中，用本發(fā)明優(yōu)化的hKGF-2編碼序列轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)高密度發(fā)酵培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)，rhKGF-2以可溶、活性形式存在于細(xì)胞周質(zhì)，同時(shí)簡便純化工藝，通過反復(fù)凍融的方法即可以破碎菌體，獲得高表達(dá)、高得率、極具產(chǎn)業(yè)化價(jià)值的一種制備rhKGF-2的方法。本發(fā)明的載體包括表達(dá)質(zhì)粒，例如含IPTG誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的質(zhì)粒表達(dá)載體，且在所述表達(dá)載體中插入了人角質(zhì)細(xì)胞生長因子-2(rhKGF-2)的編碼序列。一種特別優(yōu)選的表達(dá)載體是載體pET20b(+)、pET22b(+)、pET26b(+)和pET27b(+)。適用于本發(fā)明的宿主菌是原核宿主細(xì)胞，尤其是大腸桿菌BL21(DE3)。通常，在KGF-2優(yōu)選序列的5'端與3'端分別加起始密碼子和終止密碼子，并引入特異性酶切位點(diǎn)，然后克隆入含IPTG誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化與表達(dá)載體相容的大腸桿菌宿主菌，經(jīng)篩選鑒定后獲得工程菌。本發(fā)明的工程菌屬于IPTG誘導(dǎo)型。在本發(fā)明中，工程菌表達(dá)rhKGF-2的發(fā)酵條件沒有特別限制。可以采用本領(lǐng)域常規(guī)的發(fā)酵條件。通常，工程菌在以蛋白胨、酵母粉、NHX1等為氮源，甘油、葡萄糖、糖蜜等為碳源，磷酸鹽等為無機(jī)鹽，添加維生素及微量元素作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基；并通過控制參數(shù)(pH、溫度、罐壓、攪拌速度等)的調(diào)節(jié)及流加方式(酸堿及營養(yǎng)元素)，調(diào)節(jié)溶氧(D0)，比生長速率等因素，減少乙酸的積累，提高了菌體產(chǎn)量及表達(dá)水平。對于培養(yǎng)基的選擇，通常包括氮源、碳源、無機(jī)鹽、維生素、微量元素等的選擇。(a)氮源含有機(jī)氮源和無機(jī)氮源，其中有機(jī)氮源為蛋白胨、酵母粉的混合物，總濃度1.5-4%;無機(jī)氮源如氨水或NHX1等銨鹽，濃度0.41%。(b)無機(jī)鹽包括磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽等。較佳的磷酸鹽緩沖體系濃度2050mM，pH6.57.5;鎂鹽、l丐鹽濃度為0.11慮。(c)在培養(yǎng)基中添加維生素B作為生長因素，濃度150ug/L。(d)微量元素包括Fe3+、Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+、硼酸等，濃度為10—810—6mM。(e)碳源包括甘油、葡萄糖、糖蜜等?？梢允菃我惶荚?，也可以是混合碳源。較佳的甘油濃度為36%;葡萄糖濃度為35%。(f)誘導(dǎo)劑使用IPTG，較佳的濃度在0.50.8mM;(g)培養(yǎng)階段溶氧(D0)30X以上，誘導(dǎo)階段在50%以上；pH培養(yǎng)階段控制在6.87.0，誘導(dǎo)階段控制在7.27.4;溫度培養(yǎng)階段控制在3537°C，誘導(dǎo)階段控制在3032°C;在發(fā)酵表達(dá)rhKGF-2后，以離心方式去除發(fā)酵液上清，獲得菌體。應(yīng)用反復(fù)凍融的方式進(jìn)行破菌，用緩沖溶液懸浮菌體后，對粗提液進(jìn)行離心，去沉淀，收獲上清液。粗提液可通過鹽析、超濾等方法進(jìn)行初步純化后再進(jìn)行層析純化，也可直接進(jìn)行層析純化。適用于本發(fā)明的層析技術(shù)包括陽離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析。(a)離子層析。選擇CMS印haroseFastF凝膠介質(zhì)，鹽梯度洗脫。(b)親和層析選擇肝素親和H印arinS印haroseCL-6B凝膠介質(zhì)，鹽梯度洗脫。經(jīng)過二步純化，可得到純度95X以上的rhKGF-2蛋白。純化后rhKGF-2可用常規(guī)技術(shù)制成各種劑型。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，選擇了有助于真核基因在原核細(xì)胞中正確翻譯的分泌型質(zhì)粒載體含IPTG誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的表達(dá)載體，且在所述表達(dá)載體中插入了rhKGF-2的編碼序列，構(gòu)建高效、穩(wěn)定分泌表達(dá)的rhKGF-2工程菌(大腸桿菌)。經(jīng)高密度發(fā)酵培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)，rhKGF-2以可溶形式存在于細(xì)胞周質(zhì)；表達(dá)水平高，占菌體總蛋白20%左右。由于表達(dá)水平較高，rhKGF-2又可以分泌到細(xì)胞周質(zhì)中，且具有天然活性，不但避免了粗提過程對蛋白質(zhì)的破壞，而且提高了純化收率，降低了成本。通過簡便、快速的純化方法，即獲得高質(zhì)量的rhKGF-2純品。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(1)表達(dá)工藝簡單。(2)表達(dá)量高。通過補(bǔ)料方式，使表達(dá)水平達(dá)到20%以上，菌體產(chǎn)量達(dá)60g/L以上。(3)純化工藝簡便，回收率高。由于蛋白可以分泌到細(xì)胞周質(zhì)中表達(dá)，因此簡化了純化工序，提高了成品率，使大規(guī)模生產(chǎn)rhKGF-2成為可能。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法。實(shí)施例1rhKGF-2表達(dá)工程菌的構(gòu)建1.目的基因的合成根據(jù)已知的rhKGF-2的天然氨基酸序列，按照大腸桿菌密碼子偏愛性并考慮消除發(fā)夾結(jié)構(gòu)等不利于表達(dá)的二級結(jié)構(gòu)，在不改變氨基酸序列的條件下，設(shè)計(jì)rhKGF-2的編碼序列引物。通過搭橋PCR方法獲得rhKGF-2的全長序列。人工合成重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子-2(rhKGF-2)基因的全序列時(shí)，在該基因的5，端引入.NcoI酶切位點(diǎn)及在3，端引入HindIII酶切位點(diǎn)。2.表達(dá)質(zhì)粒-pET22b(+)-rhKGF-2的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化宿主菌表達(dá)質(zhì)粒為購自InVitrogen公司的pET22b(+)表達(dá)載體(該表達(dá)載體含有IPTG誘導(dǎo)的啟動(dòng)子和peIB分泌信號態(tài))，宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3)。用Ncol和HindIII雙酶切分別處理基因rhKGF-2和表達(dá)載體pET22b(+)，37'C酶切2小時(shí)回收相應(yīng)的片段用T4DNA連接酶在16"C連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，在含有氨芐青霉素(100ug/mU的LB平板上挑選陽性克隆并進(jìn)行質(zhì)粒酶切鑒定抽提的質(zhì)粒DNA用限制性內(nèi)切酶及Ncol+Hindlll在37'C反應(yīng)3小時(shí)，得到在pET22b(+)中插入了rhKGF-2基因的重組質(zhì)粒pET22b(+)-rhKGF-2。利用菌落PCR進(jìn)行陽性鑒定。應(yīng)用NcoI+HindlII雙酶切時(shí)，能切出大小約500bp的片段，表明序列已正確插入載體pET22b(+)中。酶切鑒定結(jié)果顯示經(jīng)過NcoI+HindlII雙酶切后，能從電泳上看到大小約500bp左右的片段，以上情況說明KGF-2基因己正確插入載體pET22b(+)中。此外，用常規(guī)方法進(jìn)行正、逆向序列分析，委托大連寶生物公司進(jìn)行序列的測定，證實(shí)克隆序列與設(shè)計(jì)序列完全一致。搖瓶試驗(yàn)，該工程菌培養(yǎng)后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)2小時(shí)后，目的蛋白表達(dá)量占總蛋白20%左右。實(shí)施例2合適表達(dá)載體的選擇按照實(shí)施例1類似的方法，將KGF-2序列分別插入幾個(gè)不同的表達(dá)載體，如pET28a(+)(購自invitorgen公司)、pET29a(+)(購自invitrogen公司)、pET-30Ek/LIC購自invitorgen公司)的相同酶切位點(diǎn)(NcoI/Hindin)，獲得質(zhì)粒pET28a(+)—rhKGF-2、pET29a(+)-rhKGF—2，pET—30Ek/LIC-rhKGF-2。將質(zhì)粒pET28a(+)-rhKGF-2、pET29a(+)-rhKGF-2，pET-30Ek/LIC-rhKGF-2分別轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主菌，挑選出抗性菌株。與含質(zhì)粒pET22b(+)/rhKGF-2的工程菌一起進(jìn)行搖瓶試驗(yàn)，經(jīng)IPTG(或阿拉伯糖)誘導(dǎo)2小時(shí)后，含質(zhì)粒pET22b(+)-rhKGF-2的工程菌表達(dá)的目的蛋白表達(dá)量占總蛋白20%左右，而含質(zhì)粒pET28a(+)-rhKGF-2、pET29a(+)-rhKGF-2，pET-30Ek/LIC-rhKGF-2的工程菌表達(dá)的目的蛋白表達(dá)量分別占總蛋白10%,12%和15%。這表明，pET22b(+)-rhKGF-2表達(dá)載體優(yōu)于其他表達(dá)載體。實(shí)施例3選擇最佳培養(yǎng)基挑實(shí)施例1中制備的轉(zhuǎn)入pET22b(+)-rhKGF-2的大腸桿菌BL21(DE3)單克隆，接種到含50mlLB種子液的250ml三角燒瓶中，培養(yǎng)34hr，待OD,達(dá)到0,81.0，按1:10的比例接種于含250ml改良種子液的誦ml三角燒瓶中，培養(yǎng)810h左右，待0D,達(dá)到68，按1:10上罐發(fā)酵，流加碳源(甘油)、鎂鹽、氨水調(diào)節(jié)pH6.87.0、溫度37°C、D0〉30%，待OD,達(dá)到1518，加入0.50.8raMIPTG開始誘導(dǎo)，適當(dāng)補(bǔ)加碳源(甘油)、氮源、磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH7.27.4、D0>50%、溫度3032。C、誘導(dǎo)45hr結(jié)束。樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測(并掃描)、測定蛋白含量。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實(shí)施例4工程菌高密度發(fā)酵的研究接種到含50mlLB種子液的250ml三角燒瓶中，培養(yǎng)34hr，待OD,達(dá)到0.81.0，按1:10的比例接種于含250ml改良種子液的1000ml三角燒瓶中，培養(yǎng)810h左右，待0De。。達(dá)到68，按1:10上罐發(fā)酵，流加碳源(甘油)、鎂鹽、氨水調(diào)節(jié)pH6.87.0、溫度37°C、D0〉30%，待OD,達(dá)到1518，加入0.50.8raMIPTG開始誘導(dǎo)，適當(dāng)補(bǔ)加碳源(甘油)、氮源、磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH7.27.4、D0〉50%、溫度3032°C、誘導(dǎo)5hr結(jié)束。樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測(并掃描)、測定蛋白含量。實(shí)施例5rhKGF-2的純化發(fā)酵液在4。C下5000rpm離心10min，得菌體，菌體-8(TC速凍24h后室溫緩慢融化，再-2(TC冷凍7天后室溫緩慢融化。顯微鏡觀察，菌體細(xì)胞壁破裂，成為原生質(zhì)球。20000rpm離心30min，得上清。超濾濃縮及更換緩沖液使用狙llipore超濾器，超濾膜截流分子量為IOKD，超濾時(shí)留取濃縮液(作用是去除小分子雜質(zhì)和鹽類)。1.層析2(陽離子層析)層析介質(zhì)CMS印haroseFastF緩沖液溶液A:PBS(PH7.4，20raM)溶液B:PBS(PH7.4，20mM)+1MNaCl上樣將超濾濃縮的rhKGF—2溶液上樣。清洗上樣后用6CV的溶液A清洗層析柱。梯度清洗后用10CV將溶液B從0%升至100%。收集收集rhKGF-2樣品峰。2.層析2(親和層析)層析介質(zhì)-HeparinSepharose(X-6B緩沖液溶液A:PBS(PH7.4，20mM)溶液B:PBS(pH7.4，20mM)+lMNaCl上樣將離子交柱層析蛋白溶液上樣。清洗上樣后用6CV的溶液A清洗層析柱。梯度清洗后用10CV將溶液B從0X升至100X。收集收集rhKGF—2樣品峰。樣品經(jīng)過此二步純化，即離子層析、親和層析以后，純度提高至95%以上。權(quán)利要求1.一種分泌表達(dá)重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子-2的制備方法，其特征在于，提供了一種優(yōu)化的表達(dá)人角質(zhì)細(xì)胞生長因子-2的表達(dá)載體，它含有分泌信號肽編碼序列，能將KGF-2蛋白分泌到細(xì)胞周質(zhì)中表達(dá)，即為pET22b(+)。2.權(quán)力要求1所述的制備方法，提供了一種大腸桿菌細(xì)胞，它含有本發(fā)明所述的表達(dá)載體和編碼人角質(zhì)細(xì)胞生長因子-2的DNA序列。該宿主細(xì)胞壁較脆弱，在反復(fù)凍融的條件下就可破裂，釋放出周質(zhì)間隙中的蛋白，即為BL21(DE3)。3.權(quán)力要求1所述的制備方法，提供了一種裂解重組蛋白的制備方法，即將宿主細(xì)胞低溫反復(fù)凍融，在不破壞細(xì)菌內(nèi)膜的情況下即可使重組蛋白釋放到緩沖液中。全文摘要本發(fā)明提供了一種分泌表達(dá)重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子-2的制備方法，該方法提供了一種重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子-2的表達(dá)載體，它含有分泌信號肽編碼序列，能將KGF-2蛋白分泌到細(xì)胞周質(zhì)中進(jìn)行表達(dá)，含有此重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞經(jīng)低溫反復(fù)凍融，在不破壞細(xì)菌內(nèi)膜的情況下即可使重組蛋白釋放到緩沖液中，不破壞蛋白的活性。文檔編號C12N15/12GK101538571SQ20081003015公開日2009年9月23日申請日期2009年2月17日優(yōu)先權(quán)日2009年2月17日發(fā)明者劉孝菊,娜姚,張?jiān)讫?李校堃,萍楊,王會巖,王曉杰,王艷芳,田海山,健肖,肖業(yè)臣,黃亞東,黃志鋒申請人:溫州醫(yī)學(xué)院;廣東暨大基因藥物工程研究中心有限公司;吉林農(nóng)大生物反應(yīng)器工程有限公司