專利名稱：高通量藥物篩選用載體及其合成和藥物篩選的判定系統的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種高通量篩選用熒光載體微球及其合成方法、以及使用熒光載體微球建立藥物篩選模型的技術路線和質量判定標準和藥物篩選的智能化數學物理模型的構筑，是高分子化學、生物化學、物理化學和數學的多學科交叉領域。
背景技術：
高通量篩選技術(High-throughput Screening，HTS)是20世紀80年代后期形成的尋找藥物的高新技術，是應用先進的分子生物學、細胞生物學、計算機、自動化控制等高新技術，建立的一套更適合于藥物篩選的技術系統。高通量篩選技術以分子和細胞水平的實驗方法為基礎，以微孔板形式作為實驗工具載體，以自動化操作系統執(zhí)行實驗過程，以計算機對實驗獲得的數據進行分析外理，在同一時間內可以對數以萬計的樣品進行快速檢測。在高通量篩選中，親近閃爍分析技術(Scintillation ProximityAssay，SPA)由于具有檢測靈敏度高，分析適用性強和無須對反應物和底物進行繁瑣的分離等優(yōu)點已發(fā)展為高通量篩選中最常見、最基本的分析檢測手段之一。在目前的藥物篩選中使用的檢測方法中有大約20～50％是基于親近閃爍分析技術進行的。
親近閃爍分析方法的基本原理是將靶分子(受體、酶或相關蛋白質)固定于含有熒光閃爍劑的載體表面，當標記的配靶與受體發(fā)生親合時，標記同位素釋放的β粒子就會激活微球中的閃爍劑產生熒光(為生物醫(yī)學中的一種冷光)；反之無親合作用時，放射性同位素距離閃爍劑較遠，其釋放的能量被體相環(huán)境吸收，無法激活閃爍劑，故不產生冷光。冷光閃爍現象可以為高通量篩選提供直接配-靶相互作用信息，從而為發(fā)現先導藥物提供條件。從親近技術的基本過程看，高通量篩選技術涉及熒光載體的合成技術、使用熒光載體微球建立藥物篩選模型的技術路線和質量判定標準、以及藥物篩選的智能化數學物理模型的構筑技術。其中，載體微球材料的合成是藥物篩選的基礎，熒光載體微球與靶分子的相互作用模式是影響篩選質量的關鍵所在。依據材料的物理特性，高通量篩選技術要求載體具有良好的生物相容性及一定的光學透明性；而載體材料的合成技術則要求方法簡單，合成周期短且成本相對低廉。微球與靶分子、靶分子與靶分子自身間的相互作用，要保證靶分子天然構象的相對穩(wěn)定性，以確保篩選藥物的正確性。而智能化數學物理的構筑技術則要求在高通量的篩選中能方便地進行定性、定量的判斷和處理。
目前，高通量篩選中熒光載體的合成主要有以下幾種方法1、球外懸掛法(美國專利US Pat.No.519430)通過熒光染料與微球表面功能基團的共價結合使微球表面帶有一種或幾種熒光物質；2、共聚或包覆法(美國專利US Pat.No.5073498及US Pat.No.4717655)在微球的聚合過程中加入熒光物質，使熒光材料以共聚或包覆的形式固定于微球中；3、物理吸附染色法(美國專利US Pat.No.5723218)將微球浸泡于溶有熒光材料的溶液中，通過物理吸附作用使微球得以標記熒光。
目前，在高通量篩選過程中，靶分子通常以化學或靜電方式連接于載體材料的表面，因此載體微球須負荷一定的功能基。藥物的療效取決于建立的篩選模型中靶分子的結構和構象，大量基礎研究表明，載體表面的疏水性能對靶分子構象及吸附特異性構成顯著影響。為降低載體表面疏水性對生物大分子構象的影響，常用的做法是對微球的表面進行親水性改性。如目前國際成熟商品化的聚乙烯基甲苯熒光微球，其制備通常是先制備聚合物微球前驅體，隨后用聚羥基化合物對其表面進行親水性改性以降低表面疏水性，并進行表面功能化處理。盡管該種熒光載體在高通量篩選中獲得了較大范圍的應用，然而其明顯的缺陷是合成過程煩瑣復雜、合成周期長，且聚乙烯基甲苯的光學性有待于提高。
高通量篩選技術是以自動化為基礎，每天可對幾萬、幾十萬種化合物進行測試。其中，智能化數學物理模型的技術設計是實現篩選過程智能化與自動化的基礎，更是實現對樣品庫大規(guī)模篩選的前提。由于生物環(huán)境中，藥物與靶分子(特別是多靶點體系)的作用極為復雜(如化學偶聯、靜電作用、疏水作用及分子間氫鍵作用等)，因此很難在一般意義上進行定量模型的構筑。目前，國際知名藥物研究和生產機構均以各種經驗關系式、構效關系式和疊代關系式等作為其實現智能化與自動化的基礎。這些核心技術的構筑依賴于以往數據及經驗的積累，對于高通量篩選技術起步較晚的國家(如中國)的藥物研究極為不利。因此有必要將熱力學、動力學及統計力學結合起來，進行篩選方面的研究和應用。
自“八五”以來，國家新藥物攻關課題70％以上是仿制產品，發(fā)展新藥多是以仿效為主，仿創(chuàng)結合，真正由我國自己研制的全新藥物寥寥無幾。究其原因，那就是我國藥物篩選的核心技術和相關材料的研制技術遠遠落后于國際。高通量藥物篩選需要大量的檢測試劑(實際上即為建立的篩選模型)，而國內尚無規(guī)?；漠a業(yè)化基地，目前我國使用的檢測試劑基本依賴進口，價格十分昂貴。生物環(huán)境中藥物與靶分子作用的復雜性和特異性決定了篩選模型(特別是通用性模型)設計的困難性，因此高通量篩選中藥靶相互作用及固定化體系相互作用模型的設計及應用并不多見，在國內更是如此。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種高通量篩選中熒光載體及其相對簡單合成方法，并基于這種合成的載體形成藥物篩選模型的技術路線和質量判定標準，構筑不同篩選體系的智能化數學物理定量模型。
本發(fā)明的目的可通過以下措施來達到1、熒光載體的設計及合成，即設計合成一種生物相容性較強、表面疏水性相對較弱特點的熒光載體，生物靶分子可以通過共價鍵或靜電作用方式連接于載體表面；2、基于上述載體形成藥物篩選模型的技術路線，并根據配體與靶分子及靶分子自身間的相互作用，考察這種相互作用是否對生物大分子的構象造成影響，從而建立對篩選模型的篩選質量的判定系統；3、在建立的篩選模型具有實用性的基礎上，根據被篩藥物組成與細胞表面受體的可能作用方式，建立高通量篩選中智能化數學物理模型，定量處理配體化合物與靶分子相互作用；以統計學及力學理論為手段，構筑高通量藥物篩選的智能化與自動化的數學物理模型。
具體地說本發(fā)明的技術方案如下熒光載體的合成本發(fā)明提供的高通量藥物篩選用熒光載體，其特征在于所述熒光載體材料具有光學透明性，并在其表面通過活性氫位點，將穩(wěn)定劑的親油端接枝于載體粒子的表面，親水端位于載體粒子的外側。
它是由下列重量配比的原料制備而成A主單體10～12％w/w；B功能單體0.2～0.8％w/w；C穩(wěn)定劑1～2％w/w；D引發(fā)劑0.1～0.2％w/w；E熒光閃爍劑0.1～0.2％w/w；F分散介質100％；其中，所述主單體A為甲基丙烯酸酯或苯乙烯；功能單體B為含有醛基或磺酸基的不飽和有機物；C為聚乙烯基吡咯烷酮或聚乙烯醇，引發(fā)劑D為過氧化物類引發(fā)劑；熒光閃爍劑E為有機高度共軛體化合物；分散介質F為小分子一元醇或醇-水混合物。
進一步地，所述A主單體為甲基丙烯酸甲酯或苯乙烯；所述B功能單體為丙烯醛或丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸；所述C穩(wěn)定劑為聚乙烯基吡咯烷酮；所述D引發(fā)劑為過氧化苯甲酰，所述E熒光閃爍劑為DPO(2，5-diphenyloxazole)或BPOB〔1，4-Bis(5-phonyloxazol-2-yl)benzene〕，所述F分散介質為甲醇或甲醇與水。
本發(fā)明提供的制備高通量藥物篩選用熒光載體方法包括如下步驟a.主單體、閃爍劑、穩(wěn)定劑、引發(fā)劑和部分分散介質一次性加入到四口反應瓶中，室溫下在氮氣氛中攪拌使體系混合均勻，功能單體溶于另一部分分散介質中。
b.在氮氣的保護下攪拌，升溫至60-80℃，反應8-15h；將溶于分散介質的功能單體緩慢地滴加至反應體系中，繼續(xù)反應10-20h后分離、洗滌，即得最終目標載體。
其中，上述制備方法中所述原料配比為A主單體10～12％w/w；B功能單體0.2～0.8％w/w；C(穩(wěn)定劑)1～2％w/w；
D引發(fā)劑0.1～0.2％w/w；E熒光閃爍劑0.1～0.2％w/w；F分散介質100％。
其中，所述主單體A為甲基丙烯酸酯或苯乙烯；功能單體B為含有醛基或磺酸基的不飽和有機物；C穩(wěn)定劑為聚乙烯基吡咯烷酮或聚乙烯醇，引發(fā)劑D為過氧化物類引發(fā)劑；熒光閃爍劑E為有機高度共軛體化合物；分散介質F為小分子一元醇或醇-水混合物。
其中，功能單體B可以為丙烯醛或丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸；所述D引發(fā)劑可以為過氧化苯甲酰，所述E熒光閃爍劑為DPO〔2，5-diphenyloxazole〕或BPOB〔1，4-Bis(5-phonyloxazol-2-yl)benzene〕，所述F分散介質為甲醇或甲醇與水。
本發(fā)明對藥物篩選模型質量的判定系統由以下步驟組成以上述合成微球為載體，以酶和相關蛋白質為靶分子，研究載體與靶分子的相互作用機制，探討靶分子與載體及靶分子自身相互作用對篩選的影響，進而建立對藥物篩選模型質量的判定系統，其主要包括(1)共價鍵或靜電作用的方式偶聯生物靶分子根據分子間相互作用的方式，如共價鍵、靜電力等，選擇載體與靶分子相應的固定化形式。通常，共價鍵連結方式為高通量篩選中最基本的固定化形式，其要求載體表面能提供可與靶分子鍵合的表面功能基。由于醛基和生物大分子的-NH2基反應能形成席夫堿(Schiff base)，且具有高的反應活性，故表面帶有醛基的微球成為制備的主要載體。靜電作用是生命現象中最普遍存在的一種作用，也是藥物篩選中有效的聯結靶分子的常用方法之一。目前常用的有磺酸基及羧酸基載體等。在藥物篩選中，依靶分子性質可選用不同固定化模式。操作中，將合成功能載體微球與生物靶分子孵育一段時間，離心分離，由紫外-可見光譜測定吸附量，由吸附量的大小初步選擇是共價鍵還是靜電力形式固定。
(2)選擇載體與靶分子適當的外部環(huán)境(pH和離子強度)靶分子性質依賴于外部環(huán)境，如pH條件及離子強度等。在等電點附近，靶分子幾乎不帶電，其結構處于折疊或締合狀態(tài)，其結果使固定化量增加，此時由篩選獲得的化合物可能不符合生物體環(huán)境中靶分子的真實構象；遠離等電點，靜電排斥作用將使蛋白質吸附量急劇減小，也不符合生物體環(huán)境中靶分子的真實構象。因而，應選擇與靶分子所處的生物體環(huán)境相近的pH條件。
離子強度對靶分子構象和固定化量的影響可分為兩種，其一是所謂的“原鹽效應”，另一是靜電作用。原鹽效應使蛋白質游離濃度減小，結果將降低藥物篩選中靶分子的固定化量，從而降低高通量篩選的檢測靈敏性；其次，由于鹽離子的存在，其所帶電荷對靶蛋白分子的雙電層有壓縮作用，將降低靶分子間的靜電作用范圍，所以能增加藥物篩選中靶分子的固定化量；結果在靶蛋白的等電點附近，蛋白質吸附量隨離子強度增加而下降；在遠離等電點時，隨著離子強度的增加，蛋白質吸附量相應能增加藥物篩選中靶分子的固定化量；結果在靶蛋白的等電點附近，蛋白質吸附量隨離子強度增加而下降；在遠離等電點時，隨著離子強度的增加，蛋白質吸附量相應增加。靜電作用的不利點是雙電層的壓縮可能對靶分子性質影響，特別是有些陰離子還能和氨基鍵合，將導致靶分子構象的改變，從而影響篩選的真實性。因此，在高通量篩選中，體系應采用較低的離子強度或不引入離子，以消除“原鹽效應”和靜電作用對靶分子構象的影響。
(3)利用紫外原位技術考察固定化過程中對靶分子構象的影響藥物的療效取決于靶分子在生物體內和體外篩選過程中構象的一致性。因此，在高通量篩選中，固定化過程不應使靶分子構象發(fā)生重大改變，否則體外獲得的化合物將會變?yōu)轶w內的無效物。本發(fā)明利用紫外原位技術在線監(jiān)測固定化過程中靶分子紫外吸收曲線的變化。在固定化過程中，由于載體與靶分子相互作用的存在，靶分子的紫外吸收光譜會逐步發(fā)生變化。若UV光譜圖變化較大，則說明靶分子與載體相互作用較強，使靶分子的構象發(fā)生了大的改變，由體外篩選獲得的化合物將會變?yōu)轶w內無效的化合物，沒有治療效果；反之，若吸收光譜僅出現最大吸收峰位的小幅或微幅漂移，而不呈現光譜圖形的重大變化，則靶分子與載體相互作用較弱，由體外篩選獲得的化合物將具有治療效果。
(4)動態(tài)條件下測定靶分子的吸附等溫線在高通量篩選中，依據靶分子與載體材料的相互作用原理，載體材料的生物相容性要求對靶分子的構象和活性等性質影響較小，不能使靶分子變性。因此，載體材料的生物相容生必須在動態(tài)中考查。由于固定化過程是吸附與脫附的平衡過程，所以測定體相中靶分子性質隨時間的變化就可了解吸附-脫附過程中載體材料對靶分子性質的影響。吸附等溫線及相關動力學過程是研究靶分子固定化規(guī)律的基本手段，更是研究分子間相互作用的定量判別依據之一。吸附動力學可以給出吸附達到平衡時(即吸附達最大量)所需的時間，為等溫線的測定提供選擇平衡條件的基礎。在不同時間段測定載體對靶分子的吸附量，當吸附量達最大值時，與之對應的時間稱之為平衡時間。等溫線測定時，以生物靶分子的不同濃度體系測定其相應吸附量，以平衡濃度對吸附量作吸附等溫線。從吸附等溫線獲得數據經與多種吸附模型擬合后，可確定靶分子遵守的固定化規(guī)律，初步了解吸附-脫附動態(tài)過程中載體材料對靶分子生物構象的影響的大小。
(5)以經典理論(Langmuir，Freundlich，Temkin和Association等溫模型)為手段，探討靶分子間可能存在的相互作用，及靶分子在表面存在的狀態(tài)及分子間相互作用形式對篩選質量可能造成的影響，從而建立了本發(fā)明所述的篩選質量的評估系統。
在高通量篩選模型的構建中，靶分子與載體表面、表面相與表面相、表面相與體相靶分子相互作用能對靶分子構象構成顯著影響。靶分子構象的變化可能使體外篩選獲得的化合物變成體內無效的化合物，因此應對分子間相互作用進行評估。在目前研究分子間的相互作用時，Langmuir、Freundlich及Temkin經典吸附理論已被廣泛采用。其中，Langmuir經典理論被認為各種理論發(fā)展的基礎，是一個理想的模型，類似于理想氣體狀態(tài)方程。大量實踐證明，Langmuir理論只適用理想模型，即靶分子間相互作用極弱或無相互作用，且載體表面是均勻的情形。本發(fā)明中按下式對吸附過程進行擬合CQ=1KQm+1QmC]]>式中C為靶分子平衡濃度；Q與Qm分別為實際吸附量及最大吸附量；K為靶分子與載體的親合常數。依據上式可知，在高通量篩選中，若C/Q對C作圖為一直線，則靶分子間沒有相互作用或相互作用極弱。此時分子間相互相用對靶分子構象影響較小，故用此靶分子作為受體建立的高通量藥物篩選模型，篩選獲得的化合物可直接應用于生物體環(huán)境中。
Freundlich及Temkin吸附理論僅適用于在靶分子存在相互作用及靶分子與載體表面相互作用較強的情形。與Freundlich理論相比，Temkin吸附理論描述的是相互作用更強的體系。在本發(fā)明的高通量篩選實驗中，可分別按下式對吸附過程進行擬合lnQ=m1nlnC+lnKQm]]>(Freundlich理論定量表達式)Q＝A0lnC+A0lnf(Temkin理論定量表達式)式中C、Q及Qm的物理意義同上，分別為靶分子平衡濃度，實際吸附量與最大吸附量；K、A0和f為常數。顯然，在高通量篩選中，若InQ(或Q)對lnC為一直線，則靶分子間存在著較強的相互作用。分子間相互相用對靶分子構象影響較大，篩選條件下靶分子的構象可能已不同于生物體環(huán)境中靶分子的真實構象。此時，篩選獲得的配體化合物的有效性有待于進一步競爭實驗的證實，特別是對遵守Temkin理論的體系。
締合模型主要應用于等電點附近的篩選體系。在高通量篩選中，靶分子性質依賴于pH條件。在等電點附近，蛋白質分子幾乎不帶電，其結構處于折疊或締合狀態(tài)，其結果使固定化量增加；遠離等電點，靜電排斥作用將使蛋白質吸附量急劇減小。藥物的療效取決于靶分子的構象及自身的結構?？拷鞍踪|等電點，靶分子結構已處于折疊狀態(tài)，此時由篩選獲得的化合物可能不符合生物體環(huán)境中靶分子的真實構象。判別時，可按下式對吸附過程進行擬合CmQ=1KQm+1QmCm]]>(相互作用弱的體系)lnQ=(mn)lnC+lnKQm]]>(相互作用強的體系)
式中C、Q和Qm的物理意義同上，分別為靶分子平衡濃度、實際固定化量和最大固定量；K為親合常數；m為靶分子締合度；n為常數。在高通量篩選中，若Cm/Q對Cm作圖為一直線，則靶分子固定化是以締合狀態(tài)進行的。如前所述，藥物的療效取決于靶分子的構象及自身的結構。締合狀態(tài)分子構象已不同于游離態(tài)靶分子的真實構象，此時由篩選獲得的化合物基本不具備發(fā)展為合格藥物的潛力。
在進行高通量篩選模型(也即篩選試劑)的制備時，可采用批實驗的形式。在一個帶有攪拌裝置的恒溫槽內，放置數個反應管。反應前將載體材料和靶分子在給定溫度下恒溫約30分鐘，再放入反應管內進行固定化。固定一定時間后離心分離上清液，以紫外分光光度法測定殘余靶分子量，吸附量以總量減去殘余靶分子量計算。當以酶為靶分子研究固定化對靶分子生物活性的影響時，可用固定化前后酶活性的變化來表征。將離心分離后的固定化樣品重新分散于給定的緩沖液中，再加入底物進行催化水解，酶活性以單位時間催化水解產物量表示。經固定化的酶，其活性降低率的大小，即代表了載體對靶分子生物構象影響的程度。
通過以上途徑，本發(fā)明將靶分子的固定化形式、載體對靶分子構象及活性的影響程度、靶分子自身的相互作用、外部環(huán)境在高通量篩選中的角色進行了有效的概括，并能對篩選的質量進行初步的評估。本發(fā)明所提出的方法不僅適用于本文中所合成的載體和選擇的蛋白，而且可適用于許多類似的相關過程，尤其是動態(tài)法的提出能對固定化過程中蛋白質的性質進行在線的跟蹤。
本發(fā)明智能化數學物理模型包括(1)確定藥物與靶分子的親合常數KA(或解離常數Kd)；(2)依據篩選條件下藥物與靶標的相互作用模式，建立高通量藥物篩選的定量處理系統，即給出藥物發(fā)揮最佳療效的最適濃度。
具體地說，本發(fā)明智能化用數學物理模型是這樣建立的(1)確定藥物與靶分子的親合常數KA(或解離常數Kd)藥物研制和開發(fā)的首要步驟是尋找和鑒定與生物靶分子具有高親合力的配體化合物。因此在高通量藥物篩選中，配體化合物的親合常數KA(或離解常數Kd)是極其重要的參數。它不僅是對配體化合物親合能力大小的評價標志，更是對高通量篩選藥物質量評估的最基本的參數之一。
在配體化合物與受體(或抗原與抗體、酶與底物等)特異性結合的過程中，配體化合物一方面由于受到靶分子的親合作用力與靶分子結合；而另一方面受自身熱運動及頻率振動的影響，趨向于逃離結合位點。當配體化合物與靶分子的結合速率與解離速率相等時，配體化合物與靶分子親合作用達成動態(tài)平衡?；贚angmuir理論的處理可獲得Cm=1KAmm+1mmC---(1)]]>
式中m為配體對靶分子的結合量，其值可由固定化前后配體化合濃度的變化求得；C為配體化合物體相濃度(平衡濃度)；KA和mm為配靶親合常數及靶分子對配體的最大結合量。在篩選條件下，以C/m對C作圖，由直線的斜率可求得配體化合物的最大結合量，而以斜率除以截距可求得配體對靶標的親合常數KA。當將采樣參數編程后，由計算機自動完成庫化合物與標記配靶親合常數的比較，計算機便可直接給出是否有必要對該配體化合物繼續(xù)研究的信息。若標記配靶親合常數大于計算機中的親合常數，則說明所篩選的配體，即被篩物的療效強，或可成為拮抗劑；反之，說明療效弱，或無用。
(2)依據篩選條件下藥物與靶標的相互作用模式，建立高通量篩選的定量處理系統高通量篩選實現的是對樣品庫大規(guī)模的篩選，所以要求借助各種數學物理模型，對大量實驗數據進行快速的分析與定量處理，并給出相關的定量信息。在生物環(huán)境中，藥物與靶點的作用極為復雜，要想用常規(guī)的微分方程對其進行定量描述則極為因難，而且也得不到宏觀的統計性。本發(fā)明率先將熱力學、動力學及統計力學結合起來，依據上述的幾種藥物與靶分子相互作用方式，對藥物篩選過程中藥物與靶點間的作用模式進行了定量處理，獲得了它們相應的定量關系式，見李松軍，劉白玲，胡杰，高通量藥物篩選中篩選模型的建立，“中國科學院研究生院學報，2004，21(3)，333-339。
依據藥物活性成分的不同，篩選條件下藥物與靶標的定量模式相應分為以下三種A.單一組分小分子化合物的篩選定量處理系統在簡單活性小分子化合物的篩選定量處理中，由于體系只有一種活性成分，故直接由統計理論可獲得結果ΔCB*=ama-b=nBCA0CB02nB-n]]>其中ΔCB*為最佳藥物作用量(ΔCB=CB0-CB]]>，指反應前后體系中藥物濃度的變化)a、b、m為常數(m=CA0CB0]]>，a＝nB，b＝n-nB)，n為可結合位點數，nB為被藥物分子占據的位點數，CA0和CB0分別為靶分子和藥物分子的初始濃度。
B.多組分藥物的篩選定量處理系統在多組分藥物篩選的處理中，若不同活性組分結合位點不同，則對具體組而言，與單組分子處理相似。當結合位點相同時，不同組分間存在著相互競爭；其最終結合量則由其與靶分子的親合力差異決定。靶分子對任意活性成分的吸收量用統計權重法處理，可得以下公式。
ΔCB*=xΣi=1maiΣi=1m(ai+bi)θi=nBCA0CB0n]]>式中符號及意義同上。
C.成分復雜藥物(如中草藥)的篩選定量處理系統中草藥成為極為復雜，其大多數組分不為人們了解，且取材地不同時組分可能不同。在與靶標作用時，這類藥物與靶標的親合作用與它們的組成密切相關。當不同活性組分結合位點不同時，其定量與單活性化合物的篩選系統相同。當結合位點相同時，親合能力強的將被靶標吸收，而親合能力相對較弱的則不被吸收。依據統計及力學理論可獲得這類藥物與靶分子親合時的定量關系ΔCB*=CA0nBRTexp(E‾RT)]]>ΔCB*、CA0、nB意義同上。式中R為標準氣體常數(8.314J·mol·K-1)，T為熱力學絕對溫度(K)， 為體系中組分與靶分子的平均親合能。從上式可知，在這類藥物的篩選過程中，藥物與靶點的相互作用不僅與靶標濃度及靶點分布密切相關，而且還與測試溫度密切相關。因此，在篩選這類藥物時要嚴格控制測試溫度。當將不同參數輸入計算機后，這類藥物的吸收量取決于靶標的初始濃度。通過藥物的吸收與靶標濃度的標準曲線又可推得藥物對結合位點的占據情況，從而為藥理研究提供了直接的理論依據。
在計算的幫助下，以上三式可成為靶點占據情況判別的重要依據之一。
縱上所述，K值是確定被篩化合物是否可作為藥物(也即前導藥物)的標準，ΔCB*給出了使藥物發(fā)揮最佳療效的最適濃度，K與ΔCB*結合，在高通量藥物篩選中作為高通量藥物篩選的定性和定量依據，即確立了本發(fā)明智能化用數學物理模型。
本發(fā)明的特點從以上說明可以看出，本發(fā)明由載體材料的一步合成方法、篩選中相互作用模型設計和智能化數學物理模型的構筑技術等三個模塊構成，分別涉及高分子化學、生物化學、物理化學及統計學等科學的范疇，形成了一個完整高通量篩選技術系統。
本發(fā)明合成載體有如下特點與其它載體材料，聚甲基丙烯酸甲酯微球不僅具有良好的生物相容性和相對較弱的疏水性，而且還具一定的光學透明性。因此，聚甲基丙烯酸甲酯更適合用作高通量篩選的載體材料。而聚苯乙烯微球則具有易于表面功能化，與生物大分子結合量大的特點。
為使生物大分子能以共價或靜電作用的方式連接于載體的表面，本發(fā)明選擇了含有醛基或磺酸基的不飽和有機化合物作為功能單體。依分散聚合機理可知，穩(wěn)定劑對形成粒子的穩(wěn)定化機理主要是空間位阻機理；合成中，通過活性氫位點，穩(wěn)定劑的親油端被接枝于粒子的表面，親水端位于外側，從而合成載體表面的疏水性明顯降低。因此，本發(fā)明合成載體具有功能化、生物相容性較強、表面疏水性相對較弱的特點。
本發(fā)明是通過分散聚合法一步合成功能化、生物相容性較好、表面疏水性相對較弱、粒徑范圍1～10μm的熒光載體，本發(fā)明合成方法具有如下特點1.采用分散聚合的方法，合成方法簡單，操作便利，一步便可合成目標載體；2.反應過程中不必改變實驗裝置或進行載體表面改性等處理；3.合成的目標產物離心分離后即可用于篩選模型的構筑和應用。
本發(fā)明對高通量篩選用載體的評估方案具有如下特點1.模型實驗設計是動態(tài)的而非靜態(tài)的，動態(tài)的實驗設計有利于了解更真實的固定化過程；2.吸附等溫線的測定可以確定靶分子固定化機制；3.經典吸附理論的應用可以從側面了解分子可能存在的相互作用，有利于對篩選質量作初步的評估；4.外部環(huán)境影響的測試可以為外部環(huán)境對篩選質量的影響提供洞察力，有利于篩選條件的選擇。
通過以上途徑，本發(fā)明對載體對靶分子性質的影響、靶分子的固定化形式、靶分子間的相互作用、外部環(huán)境在高通量篩選中的角色進行了有效的囊括，并能對篩選的質量進行初步的評估。
本發(fā)明智能化數學物理模型的特點在于1.藥物與靶標的相互作用的幾種形式及靶分子存在的幾種狀態(tài)在本發(fā)明智能化模型設計時均已被考慮，具有一定系統性；2.模型的構筑是化學熱力學、動力學及統計學在高通量篩選過程的具體應用，理論與實際結合，更具有實用性；3.相對于常用的經驗關系式，本發(fā)明模型對經驗數據的依賴性較少，可操作性強；4.首次系統地構筑了中草藥篩選模型；5.模型構筑時考慮了分子間相互作用對篩選質量的影響，并能對靶分子與靶分子、靶分子與微球、體相與表面相之間存在相互作用進行描述，其智能化水平明顯較同類篩選模型高；6.模型能對靶分子的固定化形式進行直接的評估，并能提供高通量篩選實驗設計是否合理及是否繼續(xù)的信息。
從上可以看出，由于本發(fā)明所提供的技術和材料涉及高通量篩選技術核心，原則上適用于一切篩選過程，因此本發(fā)明所提出的方法不僅適用于本文中所合成的載體和選擇的蛋白，而且適用于許多類似的相關過程，尤其是動態(tài)法的提出能對固定化過程中蛋白質的性質進行在線跟蹤。


附圖1本發(fā)明(實施例1)由分散聚合法一步合成的醛基化熒光微球的粒度分布曲線(平均粒徑9.864μm；一致性系數0.218781)。
附圖2本發(fā)明(實施例2)由分散聚合法一步合成的磺基化熒光微球的粒度分布曲線(平均粒徑3.130μm；一致性系數0.251607)。
附圖3本發(fā)明(實施例1和2)合成熒光載體的熒光光譜(Ex./Em.＝306nm/362nm)。
附圖4本發(fā)明(實施例3)高通量篩選中化學固定化對靶分子構象影響的原位UV曲線。
附圖5本發(fā)明(實施例3)高通量篩選中化學固定化對靶分子活性及熱穩(wěn)定性影響曲線附圖6本發(fā)明(實施例3)高通量篩選中固定化對靶分子時間穩(wěn)定性影響曲線。
附圖7本發(fā)明(實施例3)高通量篩選中pH條件對靶分子活性影響曲線。
附圖8本發(fā)明(實施例4)高通量篩選中載體對靶分子性質影響原位UV曲線附圖9本發(fā)明(實施例4)高通量篩選中分子間相互作用的Langmuir擬合。
附圖10本發(fā)明(實施例4)高通量篩選中分子間相互作用的Freundlich擬合。
附圖11本發(fā)明(實施例4)高通量篩選中分子間相互作用的Association擬合。
附圖12本發(fā)明(實施例4)高通量篩選中pH條件對靶分子固定化量的影響。
附圖13本發(fā)明(實施例4)高通量篩選中離子強度對靶分子固定化量的影響。
附圖14本發(fā)明(實施例5)高通量篩選中配體化合物與靶分子的Langmuir模型及親合常數的測定方法。
附圖15本發(fā)明(實施例6)高通量篩選中單活性小分子化合物與靶分子的親合作用。
附圖16本發(fā)明(實施例6)高通量篩選中多組分藥物及成分極為復雜藥物與靶分子的親合作用。
附圖17本發(fā)明(實施例7)高通量篩選中靶分子間相互作用較強體系的Freundlich及Temkin模型。
附圖18本發(fā)明(實施例7)高通量篩選中等電點附近靶分子間的Association模型。
由上可以看出，在本發(fā)明中，載體材料的合成方法、合成載體微球的基本特征如粒度大小及分布和生物相容性、生物靶分子與載體的相互作用及靶分子自身相互作用、智能化數學物理模型的建立等均獲得了描述，這些構成了一個完整高通量篩選技術系統。下面將結合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳述，但不應理解為是對本發(fā)明的進一步限定，根據本發(fā)明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術思想前提下，做出其它多種形式的修改、替換或變更所實現的技術均屬于本發(fā)明的范圍。
具體實施例方式
實施例1本發(fā)明高通量篩選中熒光載體的合成(一)分散聚合法一步合成的醛基化載體微球。
將8g甲基丙烯酸甲酯或苯乙烯，0.8g聚乙烯基吡咯烷酮，0.1g 2，5二苯基噁唑或DPO(2，5-diphenyloxazole)或BPOB〔1，4-Bis(5-phonyloxazol-2-yl)benzene〕，0.14g過氧化苯甲酰，80g分散介質(甲醇/水＝7/1)放入100ml反應瓶中，室溫下攪拌30min使體系混合均勻。固定攪拌速率250rpm，在氮氣的保護下升溫至70℃，反應10h后，緩慢滴加3.2wt％丙烯醛的甲醇溶液10g。共聚14h后，離心分離后便后得目標載體(表面醛基含1.53mmol·g-1載體；Ex./Em.＝306nm/362nm)。通過以上操作，可由分散聚合法一步合成表面醛基化、粒徑約10μm、單分散的熒光微球(粒度分布見附圖1；熒光光譜表征見附圖3)。
實施例2本發(fā)明高通量篩選中熒光載體的合成(二)分散聚合法一步合成的磺基化載體微球。
磺基化的熒光載體的合成步驟同實施例1。將功能單體替換為丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸的甲醇溶液便可。在合成中，改變單體、穩(wěn)定劑、熒光試劑、引發(fā)劑的用量或調節(jié)甲醇與水的配比可用來制備不同粒徑的熒光載體。通過以上操作，可由分散聚合法一步合成表面磺基化、粒徑3.130μm、近單分散的熒光微球(粒度分布見附圖1；熒光光譜表征見附圖3)。
實施例3本發(fā)明高通量藥物篩選用載體的評估(一)篩選條件下，靶分子通常以化學共價鍵或靜電方式連接于載體材料的表面，因此須調查化學與靜電連接方式對靶分子性質可能造成的影響，并初步對它們在篩選中扮演的角色進行初步的評估。本實施例選擇胃蛋白酶為靶分子模板化合物，以合成的醛基化微球為載體，研究固定化對靶分子性質如活性及構象造成的影響。研究時，采用批實驗的形式，一個帶有攪拌裝置的恒溫槽內，放置數個反應管。與自由酶作對比，評價化學固定化對酶活性、穩(wěn)定性及構象造成的影響，并研究它們對篩選質量可能造成的影響。
a.胃蛋白酶的化學固定化及固定化對酶構象的影響室溫下，取約0.5g醛基化載體于10mL不同濃度蛋白酶(1到40mg/mL)的硼酸緩沖液中(pH＝11.5)孵育2h。吸附結束后，以3000rpm的轉速離心分離。上清液以紫外分光光度計測定殘余蛋白量，吸附量以總量減去殘余蛋白量計算?；瘜W固定化對靶分子構象的影響由原位紫外技術進行在線監(jiān)測(附圖4)。研究表明，化學固定化對靶分子構象能構成一定的影響。由于固定化使靶分子構象發(fā)生了一定的變化，所以，此時由篩選獲得的化合物質量及確鑿有效性需競爭實驗進一步考察。
b.胃蛋白酶活性及穩(wěn)定性的測定以酶催化干酪素水解生成酪氨酸為探針反應，游離酶和固定化酶活性獲得評價。在37℃恒溫水浴反應器內，2mL蛋白酶與5mL干酪素(1-wt％)反應5min后(pH3.0)，加入5mL三氯乙酸溶液(5-wt％)終止反應，產物經離心分離。取上清液于280nm處測定產生酪氨酸量。為測定活性隨時間的變化，酶和固定化酶分別擱置一段時間，每隔三天取樣測定其活性的變化?；瘜W固定化對酶活性和穩(wěn)定性的影響見附圖5及6，結果表明，固定化有利于靶分子穩(wěn)定性的提高，從而有利于篩選過程。
c.pH條件對蛋白酶活性的影響pH條件對蛋白酶活性的影響測定與步驟2類似，在25～60℃及pH2.2～5.0改變pH值測定蛋白酶的活性。pH條件對蛋白酶活性的影響見附圖7，結果顯示pH條件能對酶活性構成顯著影響，從而對篩選質量構成影響。因此選擇與靶分子所處的生物體環(huán)境相近的pH條件至關重要。
d.高通量篩選質量的初步評估依實驗結果(附圖4、5、6和7)，探討固定化對靶分子性質，如活性、穩(wěn)定性及構象產生影響的程度，決定真實篩選條件下是否有必要使用競爭實驗來驗證篩選所獲藥物的有效性。
實施例4本發(fā)明高通量藥物篩選用載體的評估(二)如前所述，篩選條件下，靶分子通常以化學或靜電方式連接于載體材料的表面。實施例3研究了化學偶聯對篩選可能造成的影響，本實施例調查靜電作用在篩選中扮演的角色。本實施例選擇生物醫(yī)學研究中常用的牛血清蛋白(BSA)為靶分子模板化合物，以合成的磺基化微球為載體，研究靜電環(huán)境中，蛋白質與載體、蛋白質與蛋白質、表面相與體相分子間相互作用對靶分子構象及篩選質量造成的影響。操作時，與實施例一類似，采用批實驗的形式，一個帶有攪拌裝的恒溫槽內，放置數個反應管。
a.靜電條件下BSA的吸附及動態(tài)中載體材料的相容性取不同濃度BSA溶液5mL與固含量約為60mg/mL磺基化載體小球3mL于37℃吸附至動態(tài)平衡。動態(tài)中，以原位紫外技術監(jiān)測載體對BSA性質的影響。如前所述，蛋白質在載體材料表面的固定化是一個動態(tài)的過程。配體化合物一方面由于受到靶分子的親合作用力與靶分子結合；而另一方面受自身熱運動及頻率振動的影響，趨向于逃離載體表面。當配體化合物與靶分子的結合速率與解離速率相等時，配體化合物與靶分子親合作用達成動態(tài)平衡。因此，載體材料的生物相容性必須在動態(tài)中檢測，其結果見附圖8。結果顯示經過若干吸附-脫附循環(huán)后，合成載體材料沒有使靶分子性質如構象變化，靶分子仍然保持最初的構象。這些表明，合成載體具有良好的生物相容性。
b.吸附等溫線的測定及分子間相互作用探討B(tài)SA吸附等溫線測定操作與步驟a類似，吸附結束后，以3000rpm的轉速離心分離。上清液以紫外分光光度計測定殘余蛋白量，吸附量以總量減去殘余蛋白量計算。以經典吸附理論模型如Langmuir、Freundlich及Association等模型對實驗數據進行擬合，探討分子間作用。附圖9、10結果顯示，靜電作用對靶分子性質構成影響；在靜電條件下，靶分子間存在著明顯的相互作用。如前所述，分子間相互作用能對靶分子構象及篩選質量造成的影響。因此，此時，篩選所獲的潛藥的有效性需進一步競爭實驗室的驗證。當在等電點附近進行篩選時，如附圖11所示，靶分子間存在著嚴重的締合現象。此時，靶分子的構象已遠離生物環(huán)境中靶分子的真實構象，因此，此時獲得的活性化合物并無發(fā)展為藥物的潛力。
c.pH條件及離子強度的影響改變體系的pH值及離子強度(NaCl)，測定它們對吸附量的影響。附圖12和13的結果顯示，pH條件及離子強度對靶分子固定化量存在著顯著的影響，從而對高通量篩選分析檢測靈敏度構成影響。
d.靜電條件下篩選質量的評估基于步驟a、b、c的實驗結果(附圖8～13)，研究靜電條件下載體與靶分子及靶分子間相互作用對藥物篩選質量可能造成的影響，探索篩選條件在高通量篩選中扮演的角色。
本發(fā)明高通量篩選中智能化數學物理模型構筑的具體實例本發(fā)明篩選用智能化構筑技術源于大量基礎研究工作，用于指導篩選過程。該技術不僅構筑了高通量篩選中配體化合物與靶分子親合作用的定量基礎，而且還能對篩選質量進行初步的評估。本發(fā)明的部分智能化模塊，如智能化分子間相互作用及質量初步評估系統，在前文中已結合模型實驗設計進行了說明，但為了便于理解及本技術的完整性，下文一并將其列出。在生物環(huán)境中，藥物與靶標的相互作用極為復雜，特異性強，宏觀觀測的現象通常是大量微觀運動的外在表現。要想用常規(guī)的微分方程對配靶相互作用進行定量描寫則極為因難，而且也得不到宏觀的統計性。因此，在當今藥物篩選領域，常用的做法是采用統計的手段對其進行定理處理。
實施例5智能化數學物理模型構筑(一)以高通量篩選中配體化合物與靶分子相互作用為基礎，研究配體化合物與靶分子的親合常數。在高通量篩選中，配體化合物一方面由于受到靶分子的親合作用力與靶分子結合；而另一方面受自身熱運動及頻率振動的影響，趨向于逃離載體表面。當配體化合物與靶分子的結合速率與解離速率相等時，配體化合物與靶分子親合作用達成動態(tài)平衡(附圖14)?；贚angmuir理論的處理可獲得Cm=1KAmm+1mmC---(1)]]>
式中m為配體對靶分子的結合量，其值可由固定化前后配體化合濃度的變化求得；C為配體化合物體相濃度(平衡濃度)；KA和mm為配靶親合常數及靶分子對配體的最大結合量。顯然，在篩選條件下，以C/m對C作圖，由直線的斜率可求得配體化合物的最大結合量，而以斜率除以截距可求得配體對靶標的親合常數KA。在高通量篩選中，由于篩選的化合物樣品量大，很難用人工方法完成對大量數據的分析與處理。當將以上關系編程后，采樣參數經計算機處理后便可直接給出結果。
實施例6智能化數學物理模型構筑(二)在生物體環(huán)境中，藥物通過與生物大分子特定位點(靶點)結合產生藥理效應。依據藥物活性成分的不同，篩選條件下藥物與靶標的定量模式相應分為以下三種形態(tài)a.單活性小分子化合物與靶標作用的定量處理系統(附圖15)依據藥物與靶標的不同作用模式，統計力學理論可給出相應的結果。對單活性小分子化合物的篩選定量處理系統，由于其活性成分僅有一種，所以處理相應簡單。統計理論可直接給出結果C=n!nB!(n-nB)!×(CB0-CB)nB(CA0CB0-CB0+CB)n-nB(CA0)n-1(CB0)n---(2-0)]]>式中C為藥物與靶標復合物濃度；n為總結合位點；nB為藥物占據結合位點數；CA0為靶分子數；CB0及CB分別為藥物初始濃度及殘余濃度。因在一定實驗條件下，n、nB為定值，CA0和CB0為已知。為便于說明，將常數歸類后上式可簡化為C＝K(ΔCB)A(m-ΔCB)B(2-1)式中，K=n!nB!(n-nB)!(CA0)n-1(CB0)n;]]>m=CA0CB0;]]>a＝nB和b＝n-nB均為定值，ΔCB=CB0-CB]]>是反應前后體系中藥物濃度的變化，即細胞對藥物的吸收。由于藥物與靶點的鍵合分布為一峰形曲線，有一極值，即藥物與靶點鍵合的最可幾分布值。對上式求導可得最佳藥物作用量dCdΔCB=Ka(ΔCB0)a-1(m-ΔCB)b+Kb(ΔCB)a(m-ΔCB)b-1=0---(2-2)]]>所以最佳藥物作用量為ΔCB*=ama-b=nBCA0CB02nB-n---(2-3)]]>
由上式可以看出，藥物的最佳作用量不僅與靶點分布密切相關，而且還與藥物初始濃度密切相關。
b.多組分藥物與靶標作用的定量處理系統(附圖16)在高通量篩選中，多組分藥物中不同活性組分可能占據靶分子相同位點，亦可能占據不同結合位點。當不同活性組分結合位點不同時，其定量與單活性化合物的篩選系統相同，各組分的定量表達同式(2-0)。當結合位點相同時，不同活性組分相互競爭結合位點。這里設C為藥物與靶標復合物濃度；n為總結合位點；nB為藥物占據總結合位點數；CA0為靶分子數CB0及CB分別為藥物初始總濃度及殘余總濃度。經統計理論處理后可得藥物篩選中的定量關系式C=n!(CA0)nm-1(CB0)nm(n-nB)!Πi=1m(θinB)!Πi=1m{[θi(CB0-CB)]θinB[CA0CB0-θi(CB0-CB)]n-θinB}---(3-0)]]>θi在具體條件下是一個定值，表征組分對靶分子的親合力差異，其值可由實驗測定。在高通量篩選中，(3-0)最初只是一種經驗的智能化模塊。本發(fā)明通過模型的技術設計，明確給出了其具體來源。
因在一定實驗條件下，n、nB、θi為定值，CA0和CB0為已知，所以上式可簡化為C=KΠi=1m[(θiΔCB)ai(x-θiΔCB)bi]---(3-1)]]>式中，K=n!(n-nB)!Πi=1m(θinB)(CA0)mn-1(CB0)mn;]]>x=CA0CB0;]]>ai＝θinB和bi＝n-θinB均為定值，ΔCB=CB0-CB]]>是反應前后體系中藥物濃度的變化。兩邊取對數lnC=lnK+Σi=1mailn(θiΔCB)+Σi=1mbiln(x-θiΔCB)---(3-2)]]>以lnC對ΔCB求導可得極值dlnCdCB=Σi=1maiΔCB-Σi=1mbiθix-θiΔCB=0---(3-3)]]>與之相對應的得最佳藥物吸收量為ΔCB*=xΣi=1maiΣi=1m(ai+bi)θi=nBCA0CB0n---(3-4)]]>
從上式可以看出，在多靶點體系中，藥物的吸收量不僅與靶點的分布密切相關，而且還與初始的藥物用量密切相關。在高通量篩選過程中，由于篩選的化合物樣品量大，用人工方法對其進行復雜的計算極為困難，當將以上關系編程后，采樣參數經計算機處理后便可直接給出結果。
c.成分極為復雜藥物與靶標作用的定量處理系統(附圖16)中草藥成為極為復雜，其大多數組分不為人們所了解，且取材地不同時組分可能不同。在與靶標作用時，它與靶標的結合與它的具體組成密切相關。當不同活性組分結合位點不同時，其定量與單活性化合物的篩選系統相同。當結合位點相同時，親合能力強的將被靶標吸收，而親合能力相對較弱的則不被吸收。假定在篩選條件下，某中草藥中有m種組分能同靶標親合。設篩選條件下，體系中組分與靶點的平均親合能為 ，藥物占據細胞的總靶點數為nB，不同組分的親合能及占據的靶點數分別為E1、E2、E3、…、Ei、…、Em和n1、n2、n3、…、ni、…、nm。經統計力學處理可得ΔC=CA0nBRTexp(E‾RT)---(4)]]>式中ΔC為藥物總濃度過變化；CA0及nB的物理意義同前；R為標準氣體常數(8.314J/mol·K)；T為K氏溫度。從上式可以看出，在中草藥的篩選過程中，藥物與靶點的相互作用不僅與靶標濃度密切相關，而且還與測試溫度密切相關。當將不同參數輸入計算機后，這類藥物的吸收量取決于靶標的初始濃度。通過藥物的吸收與靶標濃度的標準曲線又可推得藥物對靶點的占據情況。當將以上關系編程后，采樣參數經計算機處理后便可直接給出結果。
實施例7智能化數學物理模型構筑(三)在高通量篩選中，靶分子的固定化形態(tài)及分子間相互作用能對靶分子性質構成影響。高通量技術依據各種數學物理模型，如Langmuir、Freundlich、Temkin及Association模型等，能對靶分子間相互作用進行初步的判斷，并給出相互作用對靶分子性質可能帶來影響的相關信息。在篩選條件下，只有構象與生物體環(huán)境中真實構象相同或相似的固定化靶分子，才具有篩選合格藥物的潛力。
篩選條件下，靶分子在載體表面的結合狀態(tài)通常有以下三種形式a.分子間相互作用較弱體系(附圖14)靶分子通過共價鍵或靜電作用偶聯于載體表面，靶分子與載體及靶分子間相互作用極弱或沒有相互作用，對靶分子構象影響較小。
在當今吸附固定化理論中，Langmuir經典理論是各種理論發(fā)展的基礎。大量實踐證明，類似于理想氣體狀態(tài)方程，Langmuir理論只適用理想模型，即靶分子間相互作用極弱或無相互作用，且載體表面是均勻的情形。操作中，可按下式對吸附過程進行擬合
CQ=1KQm+1QmC]]>式中C為蛋白平衡濃度；Q與Qm分別為實際吸附量及最大吸附量；K為蛋白與載體的親合常數。依據上式可知，在高通量篩選中，若C/Q對C圖為一直線，則靶分子間沒有相互作用或相互作極弱。此時，分子間相互相用對靶分子構象影響較小，所以篩選獲得化合物具有發(fā)展為合格藥物的潛力。
b.分子間相互作用較強體系(附圖17)靶分子通過共價鍵或靜電作偶聯于載體表面，靶分子與載體或靶分子間存在著較強的相互作用，對靶分子構象有一定的影響。
盡管Freundlich及Temkin吸附理論最初僅是經驗的，但后來證明它們僅適用于存在靶分子存在相互作用及靶分子與載體表面相互作用較強的情形。與Freundlich理論相比，Temkin吸附理論描述的是更強相互作用體系。在高通量篩選的實驗中，可分別按下式對吸附過程進行擬合lnQ=1nlnC+lnKQm]]>(Freundlich理論定量表達式)Q＝A0lnC+A0lnf(Temkin理論定量表達式)式中C、Q及Qm的物理同上，分別為蛋白平衡濃度，實際吸附量與最大吸附量；K、A0和f為常數。顯然，在高通量篩選中，若lnQ(或Q)對InC為一直線，則靶分子間存在著較強的相互作用。由于分子間相互相用能對靶分子構象構成影響，所以遵守Langmuir及Freundlich理論的體系篩選獲得的化合物的有效性需進一步競爭實驗的驗證。
c.等電點附近篩選體系(附圖18)在等電點附近，蛋白質分子幾乎不帶電，其空間結構處于折疊或締合狀態(tài)。如前所述，篩選所獲藥物的療效取決于篩選時靶分子的結構及構象。由于等電點附近靶分子的構象已遠離生物環(huán)境中靶分子的真實構象，所以此時篩選獲得的化合物不具有發(fā)展為有效藥物的潛力。在高通量篩選的實驗中，可按下式對靶分子固定化過程進行擬合CmQ=1KQm+1QmCm]]>(弱互相作用體系)lnQ=(mn)lnC+lnKQm]]>(強互相作用體系)式中C、Q和Qm的物理同步驟1，分別為靶分子平衡濃度、實際固定化量和最大固定量；K為親合常數；m為靶分子締合度；n為常數。顯然，在高通量篩選中，若Cm/Q對Cm圖為一直線，則靶分子固定化是以締合狀態(tài)進行了。締合狀態(tài)分子構橡已不同于游離態(tài)靶分子的真實構象，此時由篩選獲得的化合物基本不具備發(fā)展為合格藥物的潛力。
由以上說明可看出，本發(fā)明合成載體生物相容性較強、表面疏水性相對較弱，合成方法簡單，操作便利，一步便可合成目標載體。本發(fā)明評估系統應用經典吸附理論，可以從側面了解分子可能存在的相互作用，有利于對篩選質量作初步的評估；本發(fā)明智能化模型設計時，應用了化學熱力學、動力學及統計學考等理論，考慮了藥物與靶標的相互作用的幾種形式及靶分子存在的幾種狀態(tài)，具有系統性，更具有實用性。在技術層次及概括的全面性看，本發(fā)明是一種真正意義上的多學科的交叉技術，目前，在國際國內并無相同或相類似的專利或報道。
權利要求
1.一種高通量藥物篩選用熒光載體，其特征在于所述熒光載體材料具有光學透明性，并在其表面通過活性氫位點，將穩(wěn)定劑的疏水端接枝于載體粒子的表面，親水端位于載體粒子的外側。
2.根據權利要求1所述的高通量藥物篩選用熒光載體，其特征在于它是由下列重量配比的原料制備而成A主單體10～12％w/w；B功能單體0.2～0.8％w/w；C穩(wěn)定劑1～2％w/w；D引發(fā)劑0.1～0.2％w/w；E熒光閃爍劑0.1～0.2％w/w；F分散介質100％；其中，所述主單體A為甲基丙烯酸酯或苯乙烯；功能單體B為含有醛基或磺酸基的不飽和有機物；穩(wěn)定劑C為聚乙烯基吡咯烷酮或聚乙烯醇；引發(fā)劑D為過氧化物類引發(fā)劑；熒光閃爍劑E為高度共軛的有機化合物；分散介質F為小分子一元醇或醇-水混合物。
3.根據權利要求2所述的高通量藥物篩選用熒光載體，其特征在于所述主單體A為甲基丙烯酸甲酯或苯乙烯；所述功能單體B為丙烯醛或丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸；所述穩(wěn)定劑C為聚乙烯吡咯烷酮；所述引發(fā)劑D為過氧化苯甲酰，所述熒光閃爍劑E為DPO或BPOB，所述分散介質F為甲醇或甲醇與水。
4.一種制備權利要求1所述的高通量藥物篩選用熒光載體方法，其特征在于它包括如下步驟a.主單體、閃爍劑、穩(wěn)定劑、引發(fā)劑和部分分散介質一次性加入到反應瓶中，室溫下在氮氣分中攪拌使體系混合均勻并排除氧氣，功能單體溶于另一部分分散介質中，連接于反應器上；b.在氮氣保護下攪拌，升溫至60-80℃，反應8-15h；將溶于分散介質的功能單體緩慢地滴加到反應體系中，繼續(xù)反應10-20h后分離、洗滌，即得最終目標載體。
5.根據權利要求4所述的制備藥物篩選用熒光載體的方法，其特征在于所述原料配比為A主單體10～12％w/w；B功能單體0.2～0.8％w/w；C穩(wěn)定劑1～2％w/w；D引發(fā)劑0.1～0.2％w/w；E熒光閃爍劑0.1～0.2％w/w；F分散介質100％；其中，所述主單體A為甲基丙烯酸酯或苯乙烯；功能單體B為含有醛基或磺酸基的不飽和有機物；C為聚乙烯吡咯烷酮或聚乙烯醇，引發(fā)劑D為過氧化物類引發(fā)劑；熒光閃爍劑E為高度共軛的有機化合物；分散介質F為小分子一元醇或醇-水混合物。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述A主單體為甲基丙烯酸甲酯或苯乙烯；所述B功能單體為丙烯醛或丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸；所述C穩(wěn)定劑為聚乙烯吡咯烷酮；所述D引發(fā)劑為過氧化苯甲酰，所述E熒光閃爍劑為DPO〔2，5-diphenyloxazole〕或BPOB〔1，4-Bis(5-phonyloxazol-2-yl)benzene〕，所述F分散介質為甲醇或甲醇與水。
7.一種高通量藥物篩選篩選質量的評估體系，它包括以下步驟(1)以共價鍵或靜電作用的方式在載體上偶聯生物靶分子，其中所述載體為權利要求1所述的熒光載體；(2)選擇載體與靶分子適當的外部環(huán)境，包括pH和離子強度；(3)考查固定化對靶分子構像的影響，即考察靶分子構像是否發(fā)生變化；(4)動態(tài)條件下研究靶分子的吸附等溫線，測定吸附-脫附過程中載體材料對靶分子構象的影響程度；(5)以經典理論Langmuir，Freundlich，Temkin和Association等溫模型為手段，探討靶分子間相互作用，及靶分子在表面存在的狀態(tài)及分子間相互作用形式對篩選質量的影響，從而建立了本發(fā)明所述的篩選質量的評估模型。
8.根據權利要求7所述高通量藥物篩的質量評估體系，其特征在于(3)所述的考察固定化對靶分子構像的影響是通過紫外光譜法、紅外或核磁分析法實現。
9.根據權利要求7所述高通量藥物篩選質量評估體系，其特征在于(5)所述的靶分子間相互作用包括靶分子自身、靶分子與載體、體相與表面相、表面與表面間存在的相互作用。
10.根據權利要求7所述的高通量藥物篩選質量評估體系，其特征在于(5)所述的篩選質量的評估模型包括(a)Langmuir模型CQ=1KQm+1QmC]]>式中C為靶分子平衡濃度；Q與Qm分別為實際吸附量及最大吸附量；K為靶分子與載體的親合常數；在高通量篩選中，靶分子在載體表面的吸附滿足此方程時，用靶分子與載體構建的篩選模型進行篩選所獲得的化合物，可直接應用于生物體環(huán)境中；(b)Freundlich模型和Temkin模型Freundlich模型lnQ=1nlnC+lnKQm]]>Temkin模型Q＝A0lnC+A0lnf在靶分子存在相互作用及靶分子與載體表面相互作用較強時適用Freundlich及Temkin模型；式中C為靶分子平衡濃度；Q與Qm分別為實際吸附量及最大吸附量；K、A0和f為常數；在高通量篩選中，滿足此二方程時，篩選獲得的配體化合物的有效性有待于進一步競爭實驗的證實；(c)Association締合模型等電點附近的篩選體系，靶分子結構已處于折疊狀態(tài)，判別時，可按下式對吸附過程進行擬合CmQ=1KQm+1QmCm]]>(相互作用弱的體系)lnQ=(mn)lnC+lnKQm]]>(相互作用強的體系)式中C、Q和Qm的物理意義同上，分別為靶分子平衡濃度、實際固定化量和最大固定量；K為親合常數；m為靶分子締合度；n為常數；在高通量篩選中，若Cm/Q對Cm作圖為一直線，則靶分子固定化是以締合狀態(tài)進行的；滿足此方程時由篩選獲得的化合物基本不具備發(fā)展為合格藥物的潛力。
11.權利要求1所述熒光載體用于高通量藥物篩的選智能化定量判定系統，包括①確定藥物與靶分子的親合常數KA，與計算機庫中的標記配基親合常數比較，考察是否有必要對該配體化合物繼續(xù)研究；②依據篩選條件下藥物與靶標的相互作用模式，建立高通量藥物篩選的定量判定系統，即給出藥物發(fā)揮最佳療效的最適濃度。
12.根據權利要求11所述的高通量藥物篩智能化判定系統，其特征在于步驟①確定藥物與靶分子的親合常數KA基于Langmuir理論獲得Cm=1KAmm+1mmC]]>
13.根據權利要求11所述的高通量藥物篩智能化判定系統，其特征在于步驟②建立的高通量藥物篩選的定量判定系統包括a.單一組分小分子化合物的篩選定量判定系統ΔCB*=ama-b=nBCA0CB02nB-n]]>b.多組分藥物的篩選定量判定系統ΔCB*=xΣi=1maiΣi=1m(ai+bi)θi=nBCA0CB0n]]>c.中草藥的篩選定量判定系統ΔCB*=CA0nBRTexp(E‾RT)]]>其中，ΔCB*為最佳藥物作用量(ΔCB=CB0-CB,]]>指反應前后體系中藥物濃度的變化)，a、b、m為常數(m=CA0CB0,]]>a＝nB，b＝n-nB)，n為可結合位點數，nB為被藥物分子占據的位點數，CA0和CB0分別為靶分子和藥物分子的初始濃度；R為標準氣體常數8.314J·mol·K-1，T為熱力學絕對溫度K， 為體系中組分與靶分子的平均親合能。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高通量藥物篩選用熒光載體及其制備方法，高通量藥物篩選的定量處理系統及篩選質量的智能化判別系統。所述熒光載體材料既具有光學透明性，又具有弱的疏水性表面，適宜作為高通量藥物篩選的靶點載體。其制備方法采用一步合成，簡單易行。本發(fā)明中的對篩選質量的智能化判定系統，應用了化學熱力學、動力學及統計學等理論，充分考慮了藥物與靶標相互作用的幾種形式及靶分子存在的幾種狀態(tài)，具有系統性，更具有實用性。
文檔編號C09K11/00GK101017163SQ200510096930
公開日2007年8月15日 申請日期2005年8月26日 優(yōu)先權日2005年2月6日
發(fā)明者劉白玲, 李松軍, 胡杰, 汪地強, 廖險峰, 林曉琴, 張敏 申請人:中國科學院成都有機化學有限公司