專利名稱：基于靶蛋白親和選擇的活性成分高通量篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及高通量篩選領(lǐng)域，具體涉及一種基于靶蛋白親和選擇的活性成分或活性成分 群的高通量篩選方法，為一種利用多維色譜-質(zhì)譜聯(lián)用篩選對靶蛋白具有高親和力的活性成分 特別是活性成分群的方法。
背景技術(shù)：
在創(chuàng)新藥物研究過程中，發(fā)現(xiàn)具有生物活性的先導(dǎo)化合物(Lead Compoimds)是全部研 究工作的基礎(chǔ)。目前，先導(dǎo)化合物的篩選大多采用動(dòng)物、器官(組織)和細(xì)胞水平的篩選模 型，雖然從中篩選到一些有效藥物，但是這種方法的篩選費(fèi)用較高、所需化合物樣品量大、 費(fèi)吋費(fèi)力、實(shí)驗(yàn)周期長，因此不適用于含量較低的天然產(chǎn)物的篩選，更不適合進(jìn)行大規(guī)模、 高通量的篩選。
隨著后基因時(shí)代的到來，人們對疾病過程有了更深刻的認(rèn)識，明確了越來越多的生物大 分子(如酶、受體、離子通道等)在生理、病理過程中的關(guān)鍵作用，而分子生物學(xué)技術(shù)的成 熟又為蛋白質(zhì)分子在人體外表達(dá)提供了工具。應(yīng)用基因重組技術(shù)將與疾病相關(guān)的重要酶、受 體等蛋白在合適的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，從而可以建立以分子為靶向的分子或細(xì)胞水平的高通量、 超高通量篩選模型(參見Broach J. R., Thoner J. High-throughput screening for drug discovery. iVfi(,",e， 1996， 384:14; Landro J. A.， Taylor I. C., Stirtan W. G, et al. HTS in the new millennium: the role of pharmacology and flexibility. J尸Aa尸附flco/ Tox/co/Me幼o(hù)必，2000, 44: 273-289; 陳蘇 紅，王華，王升啟.基于細(xì)胞功能的超高通量篩選在化學(xué)基因組學(xué)藥物發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用.國外醫(yī) 學(xué)藥學(xué)分冊，2002， 29: 345-348等)。雖然這種高通量篩選技術(shù)以其快速、高效等優(yōu)勢發(fā)展成為 現(xiàn)代新藥發(fā)現(xiàn)過程中的三項(xiàng)主要技術(shù)之一，但該技術(shù)無分離過程和化合物鑒定功能，因此只 適用于結(jié)構(gòu)已知的單體化合物(群)的篩選，在應(yīng)用于天然產(chǎn)物提取物，特別是中藥提取物 等復(fù)雜體系時(shí)往往會由于各類成分之間的相互干擾而得出一些假陰性或假陽性結(jié)果(參見 Bogustavasky J. HTS assay development: Is smaller really better Drug Discov. Dev.， 2004, 7: 37-40)。
生物色譜法是一種可以考察化合物復(fù)雜體系(如中藥提取物)對酶、受體、細(xì)胞膜等結(jié) 合情況的一種較新的方法，該方法是以硅膠或凝膠為載體，其上涂敷或鍵合上活性酶、受體 或細(xì)胞膜等制備成色譜固定相，根據(jù)藥物與酶、受體或細(xì)胞膜的相互作用的強(qiáng)弱不同將不同
的成分分離開來，但該方法在實(shí)際使用中存在諸多遺憾。例如1、酶、受體或細(xì)胞膜與硅膠等載體結(jié)合后其生物學(xué)特征會受到一定的影響。2、該方法對色譜流動(dòng)相有著嚴(yán)格的限制，即 只能以生理緩沖液或極低濃度的有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相，否則會破壞生物大分子，這樣使色譜 利用不同流動(dòng)相而實(shí)現(xiàn)不同性質(zhì)的化合物的分離的特點(diǎn)難以發(fā)揮，化合物在生物色譜上難以 實(shí)現(xiàn)彼此的相互分離。在"毛希琴等，三種色譜模式聯(lián)用在中藥活性成分初步篩選中的應(yīng)用， 分析化學(xué)，2003， 31 (8): 992-995"的文獻(xiàn)中，有川芎在模擬生物膜色譜柱、蛋白色譜柱和 反相柱上的分離圖譜，顯而易見生物膜色譜的分離效能不理想，不如反相色譜柱。3、生物色 譜的制備程序因?yàn)樵黾恿斯枘z介質(zhì)與酶、受體或細(xì)胞膜等的結(jié)合過程，過程復(fù)雜，條件嚴(yán)格， 成本較高，如市售的蛋白柱高達(dá)上萬元一個(gè)。4、因?yàn)樗玫牧鲃?dòng)相是緩沖液，提供的圖譜對 化合物的分離效果不好且不能與LC-MS在線聯(lián)用，不能給出化合物的結(jié)構(gòu)信息。(參見孔 亮等，以人血清白蛋白為固定相的分子生物色譜分子幾種中藥活性成分的研究，高等學(xué)校化 學(xué)學(xué)報(bào)，2000， 21: 36。賀浪沖等，固定在硅膠表面細(xì)胞膜的酶活性及其色譜特性，科學(xué)通 報(bào)，1999 (6): 633-637。趙小娟等，淫陽藿根與葉活性成分的分析和比較，分析化學(xué)，2002， 30 (2): 195-197。高琨等，用細(xì)胞膜色譜法篩選研究紅毛七中的有效成分，中國藥學(xué)雜志， 2003 (1): 14-16。)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題在于建立一種基于靶蛋白親和選擇的既能適用結(jié)構(gòu)已知的單體化 合物或化合物群，又能適合結(jié)構(gòu)信息缺乏的復(fù)雜天然產(chǎn)物群(如中藥提取物)的高通量活性 成分的篩選方法。本發(fā)明可以避免因固定化導(dǎo)致靶蛋白生物學(xué)特性改變而影響到小分子化合
物篩選的準(zhǔn)確性，同時(shí)還可以利用高效液相—質(zhì)譜系統(tǒng)(LC-MS)的強(qiáng)大分離和結(jié)構(gòu)鑒定能 力，在篩選得到活性小分子(群)的同時(shí)在線獲得其結(jié)構(gòu)信息，以便快速的從化合物(群) 或中藥復(fù)雜體系中尋找具有活性的先導(dǎo)化合物或中藥有效成分群。
本發(fā)明的高通量篩選方法依次包括如下abc三個(gè)步驟
a、將靶蛋白與待測化合物或待測化合物群在緩沖液中共孵育，此時(shí)有活性的待測化合物 與靶蛋白結(jié)合成靶蛋白-活性成分復(fù)合物，孵育得到的混合溶液中包括靶蛋白-活性成分復(fù)合 物和沒有與靶蛋白結(jié)合的游離小分子化合物，將混合溶液上樣于分子排阻色譜柱(size exclusion chromatography, SEC)或在線固相提取柱(online solid-phase extraction, SPE)，用緩 沖液洗脫，洗脫液于SEC或第一根SPE后流經(jīng)紫外檢測器，在蛋白的最大紫外吸收波長280nm 下檢測，靶蛋白-活性成分復(fù)合物先出峰并被檢測出現(xiàn)第一個(gè)色譜峰，該色譜峰進(jìn)入線圈，色 譜峰后的洗脫液切換入廢液。由于下面的步驟中還會用到SPE，因此這一步的SPE稱為SPE,， b步驟用到的SPE稱為SPE2。所述待測化合物可以是單體化合物，或由單體化合物組成的化合物群，還可以是含有未 知成分的復(fù)雜的中藥提取物。待測化合物如果能與靶蛋白結(jié)合成復(fù)合物，則該待測化合物是 對該靶蛋白相關(guān)疾病有效的藥物，具體有效程度依賴后面的方法測試計(jì)算。如果待測化合物 是單體化合物，則復(fù)合物是靶蛋白-活性成分復(fù)合物，如果待測化合物是化合物群，則復(fù)合物 是靶蛋白-活性成分群復(fù)合物，本發(fā)明更適合于化合物群的高通量篩選，為了簡化均簡稱為靶 蛋白-活性成分復(fù)合物。
上述靶蛋白與待測化合物孵育所用緩沖液和洗脫SEC或SPE,所用緩沖液一般保持一致， 優(yōu)選自pH6.0~8.0的磷酸鹽緩沖液、pH6.0~8.0的三羥甲基氨基甲垸緩沖液、pH6.0~8.0乙酸 銨緩沖液或PH6.0~8.0碳酸氫銨緩沖液。
孵育體系要兼顧靶蛋白的高活性和化合物小分子的溶解性。有些化合物，尤其是天然產(chǎn) 物群(如中藥提取物)中化合物極性較小，在緩沖鹽體系中不溶解，需要選擇合適的溶媒使 二者共存，如加入低濃度的增溶劑等。增溶劑的選擇基于不破壞或基本不破壞靶蛋白的活性。 在實(shí)際操作過程中，靶蛋白可以承受的增溶劑的比例可以通過實(shí)驗(yàn)來檢驗(yàn)。例如通過Ellman 分光光度分析法證明乙酰膽堿酯酶在含有5%甲醇的緩沖鹽體系中活性幾乎不受影響。
孵育時(shí)緩沖液中優(yōu)選加入增溶劑，所述增溶劑優(yōu)選自吐溫、二甲基亞砜、聚乙二醇、曲 拉通、甲醇、乙醇中的一種或幾種的混合溶液。優(yōu)選的增溶劑體積占緩沖液體積的比例為 0.1-5%。
將待測化合物與靶蛋白在緩沖液中混合形成均相的混合體系，根據(jù)化合物成分的穩(wěn)定性 可選擇不同的孵育溫度。如果待測化合物中含有較多的揮發(fā)性成分，則優(yōu)選4'C的孵育溫度， 否則選擇25t:-37'C的孵育溫度，孵育時(shí)間優(yōu)選0.5-1.5小時(shí)。
分子排阻色譜優(yōu)選Sephadex G-25、 Sephadex G-50或Sephadex LH-20。洗脫流速優(yōu)選 0.3-0.5ml/min。
在分子排阻色譜分離中，孵育樣品上樣于3-5cm分子排阻色譜柱(SEC)上，用緩沖液 加以洗脫，洗脫液于SEC后通過紫外檢測器280nm檢測，靶蛋白-活性成分復(fù)合物于l-4min 內(nèi)被首先洗脫下來。由于凝膠填料能承受的壓力有限，洗脫流速以0.3-0.5ml/min為宜。在洗 脫過程中，靶蛋白-活性成分復(fù)合物周圍幾乎沒有游離小分子化合物，復(fù)合物與小分子化合物 的動(dòng)態(tài)平衡被不斷打破，結(jié)合于靶蛋白上的小分子不斷解離下來，所以凝膠層析過程越短越 好，只要能將蛋白質(zhì)大分子與小分子化合物分離開即可。另外，將靶蛋白-活性成分復(fù)合物與 游離小分子化合物相分離亦可選擇在線固相提取柱(SPE)，如Waters公司的OASIS HLB柱 及原理相似的其他在線固相提取柱。這種SPE如HLB采用親水親脂的水可浸潤性反相吸附 劑為填料，對蛋白質(zhì)、緩沖鹽等極性大物質(zhì)幾乎不予保留，對極性有機(jī)化合物有很好的保留作用，且可以承受高達(dá)170bar壓力，高流速(2-4ml/min)洗脫使柱內(nèi)產(chǎn)生湍流，靶蛋白-活 性成分復(fù)合物在湍流中快速通過HLB進(jìn)入線圈，大大減少了結(jié)合于復(fù)合物上的活性成分的提 前解離。同時(shí)，未結(jié)合的大量小分子化合物被保留于SPE上不進(jìn)入線圈。
b、 將洗脫液與解離液混合進(jìn)行解離。a步驟中含有靶蛋白-活性成分復(fù)合物的洗脫液與解 離液混合形成解離溶液，解離溶液中與靶蛋白結(jié)合的活性成分被解離成游離化合物，解離溶 液上樣于線圈后的在線固相提取柱(SPE2)，并于上樣后用高流速水溶液沖洗SPE2以除去吸 附其上的靶蛋白和緩沖鹽，活性成分不會被沖洗掉而保留于柱上；
解離溶液上樣于SPE2柱后，優(yōu)選用高流速水溶液(2-4ml/min)沖洗l-3min，除去靶蛋 白和緩沖鹽。SPE2在高流速水溶液沖洗下會形成湍流色譜，對靶蛋白等生物大分子不予保留 而對有機(jī)小分子能夠很好的保留。
上述檢測方法中，線圈可以為lml 5ml的環(huán)狀折疊線圈，用于將解離液和含有耙蛋白-活性成分復(fù)合物的洗脫液混合。靶蛋白-活性成分復(fù)合物解離所用解離液優(yōu)選酸水溶液或酸水 溶液與有機(jī)溶劑的混合溶液。酸水溶液優(yōu)選三氟乙酸、甲酸、乙酸或鹽酸，pH優(yōu)選l-3。有 機(jī)溶劑優(yōu)選甲醇或乙腈。兩者混合溶液中有機(jī)試劑所占體積比優(yōu)選為5%~30%。本發(fā)明采用 的解離液可有效的將靶蛋白-活性成分復(fù)合物進(jìn)行解離。
SPE2于線圈后起到了活性成分在線富集作用(見附圖1)，根據(jù)待測化合物性質(zhì)的不同選 擇相應(yīng)的SPE2，如Waters公司Oasis系列在線色譜柱或原理相近的其他SPE柱。
結(jié)合于靶蛋白上的活性成分濃度很低，以至于一般情況下無法達(dá)到質(zhì)譜檢測限。SPE2能 夠有效的富集目標(biāo)化合物而除去靶蛋白、緩沖鹽等干擾物質(zhì)。根據(jù)所篩選化合物的性質(zhì)選擇 合適的SPE2,如堿性化合物宜選擇Waters公司的Oasis MCX在線色譜柱、Oasis WCX在線 色譜柱等，酸性化合物宜選擇Waters公司的Oasis MAX在線色譜柱、Oasis WAX在線色譜 柱等，而Waters公司的Oasis HLB在線色譜柱可富集所有有機(jī)化合物，亦可選擇與上述SPE 原理相近的其他SPE對目標(biāo)化合物進(jìn)行富集與去除蛋白。
上樣于SPE2上的化合物優(yōu)選用溶液高流速沖洗，根據(jù)化合物性質(zhì)不同，待測化合物如 果是堿性化合物，則用堿水沖洗同時(shí)堿化；待測化合物如果是酸性化合物用酸水沖洗同時(shí)酸 化，堿水優(yōu)選氨水溶液或二乙胺水溶液；酸水優(yōu)選三氟乙酸水溶液、甲酸水溶液、乙酸水溶 液或鹽酸水溶液。蛋白質(zhì)、緩沖鹽等被沖洗入廢液，活性成份保留于SPE2上。
c、 將b步驟的在線固相提取柱(SPE2)上的活性成分切換至高效液相一質(zhì)譜系統(tǒng)(LC-MS) 進(jìn)行分析，對篩選到的活性成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，并對其進(jìn)行定量分析，計(jì)算這些活性成分對 于靶蛋白的結(jié)合率，以此對其活性進(jìn)行預(yù)測。
SPE2被沖洗除去靶蛋白和緩沖鹽后直接切換至LC-MS進(jìn)行分析，優(yōu)選通過六通切換閥、
八通切換閥或十通切換閥切換。富集于SPE2上的活性成分被流動(dòng)相溶液(流動(dòng)相溶液優(yōu)選含 甲醇或乙腈水溶液)洗脫入C18反相色譜柱進(jìn)行分離，隨后經(jīng)質(zhì)譜檢測獲得其活性成分的結(jié) 構(gòu)信息。
解離溶液順流上樣于SPE2，活性成分集中富集于SPE2前段，六通(或八通、十通)閥 切換后流動(dòng)相溶液反沖于SPE2上，活性成分被反沖入反相色譜分析柱，這樣就使活性成分集 中進(jìn)入色譜柱進(jìn)行分離，在合適的色譜梯度洗脫下，活性成分混合物經(jīng)SPE2-LC-MS同樣可 得到很好的分離效果和色譜峰型(見附圖3)。
1. 活性成分對于靶蛋白的結(jié)合率計(jì)算
通過比較樣品中小分子化合物經(jīng)SEC/SPE廣SPE2-LC-MS的峰面積和經(jīng)二通-SPE2-LC-MS的峰面積，可以推算出各活性成分的結(jié)合率。具體公式如下
結(jié)合率(％) JEC掘-LC掘勺峰面積x腦 二通-SPE2 - LC - MS的峰面積
通過本發(fā)明對化合物的篩選，可以高效快速的從大量化合物中篩選出具有對耙蛋白高親 和力的可能的活性成分。通過結(jié)合率可以對篩選到的成分進(jìn)行初步的活性預(yù)測。
2. 滴定法計(jì)算待測化合物的動(dòng)力學(xué)常數(shù)
靶蛋白以酶為例，如果被測化合物與一已知酶抑制常數(shù)(Ki)的化合物競爭酶上的同一 位點(diǎn)，則被測化合物的Ki可以通過"滴定"的方式測定。被測化合物作為被滴定劑與酶孵育一 段時(shí)間后分別加入不同濃度的滴定劑，即已知Ki的化合物。隨著滴定劑濃度的增加，被滴定 劑逐步被置換出酶的活性位點(diǎn)。樣品通過上述篩選方法檢測到的滴定劑與被滴定劑的峰面積， 即可計(jì)算出被測化合物的Ki。計(jì)算公式oKi2 [ES2〗[S2]0Kh
其中[ES!]為酶-滴定劑復(fù)合物濃度(在該方法中為滴定劑的質(zhì)譜峰面積)，[ES2]為酶-被滴 定劑復(fù)合物濃度(在該方法中為被滴定劑的質(zhì)譜峰面積)，[S,]o為加入滴定劑總濃度，[S2]o 為被滴定劑總濃度，Ki,為滴定劑的Ki， Ki2為被滴定劑的Ki (待求Ki)。由上得Ki2 = [ESd[S2]oKi,/([ES2][Si:M。(參見D. Allen Annis，* Nairn Nazef, Cheng-Chi Chuang, et al. A General Technique To Rank Protein-Ligand Binding Affinities and Determine Allosteric versus Direct Binding Site Competition in Compound Mixtures. 乂爿Af. C7/￡M. 5"OC. 2004, 126, 15495-15503)。
通過以上c步驟得到的化合物的分子量和碎片信息或與標(biāo)準(zhǔn)品化合物進(jìn)行比對，對篩選 到的活性成分(群)進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。同時(shí)，根據(jù)以上計(jì)算出的結(jié)合率的大小對其活性進(jìn)行初
步評價(jià)。
除上述步驟進(jìn)行化合物篩選，并計(jì)算其結(jié)合率和動(dòng)力學(xué)常數(shù)外，還可以通過質(zhì)譜方法測 定篩選到的活性化合物對靶蛋白的的半數(shù)抑制濃度(IC5Q)和通過Lineweaver Burk作圖法 計(jì)算篩選到的活性化合物對酶的抑制常數(shù)(Ki)，從而更好地判斷篩選到的化合物的藥理學(xué)活 性。
1、活性成分對靶蛋白ICM)的測定
以酶為例，具體方法是將酶的底物與不同濃度的被測化合物均勻混合，加入酶液引發(fā) 催化反應(yīng)，在一定時(shí)間終止反應(yīng)，樣品除蛋白后用質(zhì)譜檢測其產(chǎn)物增加量或底物減少量，能 夠抑制酶50%活性的被測化合物的濃度即為其IC5o。用同樣的條件與方法測定陽性藥物的 IC50，將被測化合物IC50與陽性藥物IC50加以比較，即可得出被測化合物對靶標(biāo)酶抑制活性 的大小。
2 、 Lineweaver Burk作圖法 在不同底物濃度下對酶反應(yīng)速率和底物濃度進(jìn)行Lineweaver Burk作圖，可計(jì)算該酶催 化特定底物的米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vmax。在不同抑制劑濃度下，根據(jù)不同底物濃度 所做直線相交的位置判斷被測化合物對酶的抑制類型，對不同濃度被測化合物相應(yīng)的反應(yīng)速 度公式進(jìn)行二次作圖即可計(jì)算出被測化合物對酶的抑制常數(shù)(Ki)。
利用本發(fā)明的高通量篩選方法，所有來自人體和動(dòng)物的與疾病密切相關(guān)的活性蛋白均可 作為篩選化合物的靶標(biāo)。優(yōu)選的靶蛋白來自于人體或動(dòng)物組織的與老年癡呆、心血管疾病或 腫瘤疾病相關(guān)的酶或受體。目前有大量商品化的蛋白可以購買，亦可自己進(jìn)行純化制備，靶 蛋白一般(如酶或受體)高濃度溶解于緩沖鹽溶液中，-20°。分裝保存，以保持靶蛋白的活性。 具體篩選化合物時(shí)可根據(jù)文獻(xiàn)資料和預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇合適的靶蛋白，如文獻(xiàn)顯示甾體生物堿有膽 堿酯酶抑制活性，那么即可選擇膽堿酯酶作為篩選甾體生物堿群的耙蛋白。
運(yùn)用本篩選方法，通過SPE,的分離，靶蛋白-活性成分(群)復(fù)合物20秒全部進(jìn)入線 圈(見附圖2),經(jīng)過1.5min的在線前處理后即可直接進(jìn)行LC-MS分析，比目前報(bào)道的最快 的在線樣品前處理省時(shí)2min以上(參見Jimmy Flarakos， Kenneth L. Morand， and Paul Vouros. High-Throughput Solution-Based Medicinal Library Screening against Human Serum Albumin, 厶a/. C/z棚.2005, 77， 1345-1353.)。這大大提高了從化合物(群)中篩選活性成分(群)的效 率，是一種操作相對簡單，成本較低的高通量藥物篩選方法。運(yùn)用本發(fā)明的篩選方法，發(fā)明 人己從由27個(gè)甾體類生物堿組成的單體化合物中篩選出了 11個(gè)與丁酰膽堿酯酶有高親和力 的成分(見附圖3)，對這11個(gè)成分進(jìn)行了進(jìn)一步的活性測試，其中4個(gè)成分的IQo小于10pM， 而同等條件下陽性化合物加蘭他敏對BChE的ICso為3.23jiM，這充分說明了本發(fā)明用于高通
量篩選活性化合物的可行性。


圖l是靶蛋白親和選擇活性成分在線篩選裝置圖。1.分子排阻色譜柱/HLB等固相提取柱2.
紫外檢測器3.線圈4.六通(或八通、十通)切換閥5. C18反相色譜分析柱6.質(zhì)譜檢測
器。,是靶蛋白一活性成分復(fù)合物，S是靶蛋白， 一是游離小分子化合物。
圖2是靶蛋白-活性成分復(fù)合物通過第一根SPE的280nm的檢測圖譜。本篩選方法SPE選用
Waters公司的OASIS HLB在線固相萃取柱，圖中l(wèi).靶蛋白-活性成分(群)復(fù)合物2.未與
靶蛋白結(jié)合的游離的小分子化合物
圖3(I) 27個(gè)甾體生物堿組成的單體化合物的總離子流圖
(II) (A) ~ (F)由上而下分別是生物堿標(biāo)準(zhǔn)品提物離子流圖、結(jié)合于AChE上的活 性成分提取離子流圖、結(jié)合于BChE上的活性成分提取離子流圖。其中(A) l.ebeienine 2.solasodine 3.puqiedinone 4.川貝酮5. ebeiedinone (B) 6.去甲蒲貝酮堿 7.puqiedine 8.ebeiedine (C) 9.貝母辛 IO.蒲貝雙酮(D) ll.西貝素 12.浙貝乙素 13.蒲貝酮堿 (E) 14.puqiedine 7-01 15.浙貝甲素 16.異浙貝甲素 (F) 25.西貝素苷26.蒲貝酮堿苷。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
老年癡呆疾病相關(guān)靶點(diǎn)的藥物篩選
篩選由27個(gè)甾體生物堿組成的單體化合物中對乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase, AChE)具有高親和力的成分。
被篩選的單體化合物由27個(gè)甾體生物堿組成，分別是蒲貝素A、蒲貝素B、蒲貝素C、 蒲貝素D、蒲貝素E、蒲貝素F、貝母辛、西貝素、西貝素苷、蒲貝酮堿、蒲貝酮堿苷、N-去甲蒲貝酮堿、伊貝堿苷A、浙貝甲素、浙貝甲素N-oxide、浙貝乙素、川貝酮、puqiedine-7-01 、 puqiedinone 、 puqiedine 、 p叫ietinedinone 、 veratridine、 ebeienine、 ebeiedinone 、 ebeiedine 、 solasodine、 isoverticine.將其一一進(jìn)行活性篩選是一個(gè)耗時(shí)，費(fèi)力，效率又低的過程。采用本 發(fā)明篩選方法可以快速的從中尋找出與乙酰膽堿酯酶具有高親和力的可能的活性成分。
AChE的制備乙酰膽堿酯酶凍干粉2000U (Acetylcholinesterase from electric eel, Sigma),用2ml乙酸銨緩沖液(10mM，pH7.5)充分溶解，配制成1000U/ml，置-20。C冰箱中 分裝備用。
甾體生物堿溶液的配制27個(gè)甾體生物堿用甲醇溶解，每個(gè)甾體生物堿的濃度為25)aM， 再用乙酸銨緩沖液(10mM， pH7.5)稀釋至濃度為2jaM。
篩選20plAChE溶液(1000U/ml)與20^1甾體生物堿溶液(2pM)均勻混合，在25'C 環(huán)境下靜置lh。40ul孵育溶液上樣于SPEl(Waters Oasis HLB)，乙酸銨緩沖液(10mM, pH7.5) 2ml/min洗脫20s，洗脫液(2ml/min)與解離液(0.2%三氟乙酸水溶液含20%乙腈，lml/min) 混合于線圈(2ml)解離lmin，同時(shí)解離后樣品上樣于SPE2 (Waters Oasis MCX)，此時(shí)六通 切換閥處于附圖1的上樣(LOAD)位置，用二乙胺水溶液(pH 10.0)4ml/min沖洗SPE2 lmin, 隨后將六通切換閥切換至附圖1的進(jìn)樣分析(INJECT)位置，富集于SPE2上的小分子化合 物被洗脫入LC-MS系統(tǒng)進(jìn)行分離分析。另外，在相同條件下，用二通代替SPE1，相同樣品 經(jīng)過如上步驟進(jìn)入LC-MS分離分析。
色譜與質(zhì)譜分析條件C18色譜柱，高效液相色譜-電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜(HPLC-ESI/TOF
MS);流動(dòng)相乙腈水(各含0.05%二乙胺)剃度洗脫；ESI離子源；正離子模式，質(zhì)量范 圍400 800m/z;噴霧毛細(xì)管電壓3500 V;干燥氣(N2)流速9.0L/min;干燥氣溫度 325°C;霧化壓力35psi;傳輸電壓150V。各生物堿的[M + H]+離子的質(zhì)荷比(m/z)分別為 蒲貝素A， 446;蒲貝素B， 444;蒲貝素C， 460;蒲貝素D， 460;蒲貝素E， 442;蒲貝素F， 476;貝母辛，428:西貝素，430;西貝素苷，592;蒲貝酮堿，430;蒲貝酮堿苷，592; N-去甲蒲貝酮堿，416;伊貝堿苷A， 576;浙貝甲素，432;浙貝甲素N-oxide， 448;浙貝乙素， 430;川貝酮，414; puqiedine-7-Ol ， 432; p叫iedinone， 414; puqiedine, 416; p叫ietinedinone， 428; veratridine， 674; ebeienine， 414; ebeiedinone， 414; ebeiedine416; solasodine， 414; isoverticine， 432。
檢測結(jié)果:從27個(gè)甾體生物堿組成的單體化合物屮篩選出9個(gè)與AChE具親和力的成分， 見附圖3。分另ij是veratridine， puqiedine， ebiedine， ebeiedi醒e，蒲貝酮堿，蒲貝酮堿苷，蒲 貝雙酮，川貝酮，蒲貝素B。它們與1UAChE的結(jié)合率分別是0.01%, 0.01°/。， 0.008%， 0.01%, 0,01%, 0.005%, 0.01%, 0.02%， 0.005%。其中川貝酮和ebeiedinone對AChE的1(250分別為 99|iM、 79)iM。同等條件下加蘭他敏對AChE的ICso為0.45pM。
實(shí)施例2
老年癡呆疾病相關(guān)耙點(diǎn)的藥物篩選
篩選由27個(gè)甾體生物堿組成的單體化合物中對丁酰膽堿酯酶(Butyrylcholinestemse, BChE)具有高親和力的成分。
被篩選的單體化合物組成同實(shí)施例1。
BChE的配制丁酰膽堿酯酶凍干粉1200U(Butyrylcholinesterase from equine serum, Sigma)， 用3ml乙酸銨緩沖液(10mM，pH7.5)充分溶解，配制成400U/ml，置-20。C冰箱中分裝備用。
甾體生物堿溶液的配制27個(gè)甾體生物堿用甲醇溶解，每個(gè)甾體生物堿的濃度為50|aM， 再用乙酸銨緩沖液(10mM， pH7.5)稀釋至濃度為4pM。
篩選30^1 BChE溶液(400U/ml)與lOpl甾體生物堿溶液(4pM)均勻混合，在25。C 環(huán)境下靜置lh。 40ul孵育溶液進(jìn)樣于SPEl，其余步驟同實(shí)施例l。 色譜與質(zhì)譜分析條件同實(shí)施例1。
檢測結(jié)果從27個(gè)甾體生物堿組成的單體化合物中篩選出11個(gè)與AChE高親和力結(jié)合 的成分(見附圖3)。分別是veratridine， puqiedine， ebiedine， ebeiedinone，蒲貝酮堿，蒲貝 酮堿苷，蒲貝雙酮，川貝酮，異浙貝甲素，浙貝乙素，伊貝堿苷A。它們與BChE的結(jié)合率 分別是0.82%, 0.80%, 2.18%, 1.84%, 0.39%, 0.19%, 0.24%, 0.89%, 0.44%, 0.39%, 0.17%。其中 四個(gè)化合物對BChE的IC50小于10pm，分別是ebeiedinone 9.07|xM， ebeiedine 4.48(xM， puqiedine 8.49|aM,川貝酮9.09pM。同等條件下加蘭他敏對BChE的IC50為3.23|aM。由此可 知，這類甾體生物堿對丁酰膽堿酯酶有較好的抑制活性。
實(shí)施例3
心血管疾病相關(guān)靶點(diǎn)的藥物篩選
篩選由17個(gè)貝母類甾體生物堿組成的單體化合物中對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin Converting Enzyme, ACE， sigma)具有高親禾卩力的成分。
被篩選的單體化合物由17個(gè)甾體生物堿組成，分別是蒲貝素E、蒲貝素A、蒲貝素B、 蒲貝素C、蒲貝素D、 p叫iedine、蒲貝酮堿、蒲貝酮堿苷、蒲貝雙酮、ebeidinone、 ebeidine、 浙貝甲素、浙貝乙素、西貝素、西貝素苷、貝母辛、伊貝堿苷A。
ACE的制備血管緊張素轉(zhuǎn)化酶凍干粉6U (Angiotensin Converting Enzyme from rabbit lung,Sigma)，用200ul乙酸銨緩沖液(10mM, PH7.5)充分溶解，配制成30U/ml，置-20。C冰 箱中分裝備用。
甾體生物堿溶液的配制17個(gè)貝母類甾體生物堿用甲醇用甲醇溶解，每個(gè)甾體生物堿的 濃度為25nM，再用乙酸銨緩沖液(10mM，PH7.5)稀釋至濃度為2(xM。
篩選2(^1 ACE溶液(30U/ml)與20^1貝母類甾體生物堿溶液(2pM)均勻混合，在 25'C環(huán)境下靜置lh。 40ul孵育溶液進(jìn)樣于SPE1。其余步驟同實(shí)施例1。
色譜與質(zhì)譜分析條件同實(shí)施例1。
檢測結(jié)果從17個(gè)貝母類甾體生物堿組成的單體化合物(群)中初步篩選出3個(gè)與AChE 高親和力結(jié)合的成分。分別是蒲貝素E、蒲貝素A、蒲貝素B，結(jié)合率分別為0.4%, 0.01%, 0.005%。 實(shí)施例4
腫瘤疾病相關(guān)耙點(diǎn)的藥物篩選
篩選對組蛋白去乙?；? (Histonedeacetylase6， HDAC6)具有高親和力的成分。 被篩選化合物氯化筒箭毒堿，Trapoxin (TPX) 、 FK228、曲古抑菌素A。 HDAC6的酉己制HDAC6凍干粉50ug，用200ul乙酸銨緩沖液(10mM，PH7.5)充分溶
解，配制成250ug/ml,置-2(TC冰箱中分裝備用。
被篩化合物溶液的配置氯化筒箭毒堿，Trapoxin (TPX) 、 FK228、曲古抑菌素A用乙
酸銨緩沖液(10mMPH7.5)溶解，每個(gè)化合物濃度為2pM。
篩選20(J HDAC溶液(250ug/ml)與20pl被篩化合物混合溶液(2|_iM)均勻混合，
在25'C環(huán)境下靜置lh。 40ul孵育溶液進(jìn)樣于SPEl。其余步驟同實(shí)施例l。 色譜與質(zhì)譜分析條件同實(shí)施例1
檢測結(jié)果氯化筒箭毒堿，Trapoxin (TPX) 、 FK228、曲古抑菌素A對HDAC6均有結(jié) 合，結(jié)合率分別為2%，0.5°/。， 1.2%, 1%。氯化筒箭毒堿，Tmpoxin(TPX) 、 FK228、曲古抑菌 素A為HDAC6的抑制劑，在本實(shí)驗(yàn)中作為陽性藥物對本篩選方法進(jìn)行驗(yàn)證。初步證實(shí)了本 發(fā)明適合于腫瘤疾病相關(guān)靶點(diǎn)的藥物篩選。
權(quán)利要求
1、一種基于靶蛋白親和選擇的活性成分高通量篩選方法，包括篩選活性化合物，將篩選到的活性化合物導(dǎo)入高效液相質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行分析，進(jìn)行化合物結(jié)構(gòu)確證，并對其進(jìn)行定量分析，計(jì)算這些活性成分對于靶蛋白的結(jié)合率，評價(jià)其活性，其特征是篩選活性化合物包括如下步驟a、將靶蛋白與待測化合物在緩沖液中共孵育，孵育溶液上樣于分子排阻色譜柱或在線固相提取柱，用緩沖液洗脫柱子，洗脫液流經(jīng)紫外檢測器，在吸收波長280nm下檢測并收集首先出峰的洗脫液；b、將洗脫液與解離液混合進(jìn)行解離，解離溶液上樣于在線固相提取柱，靶蛋白和緩沖鹽流出柱子，而活性成分保留在線固相提取柱上；c、洗脫b步驟得到的保留活性成分的在線固相提取柱，洗脫液進(jìn)入高效液相-質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行分析。
2、 權(quán)利要求1的高通量篩選方法，還包括用質(zhì)譜方法對篩選到的活性成分進(jìn)行活性評價(jià)。
3、 權(quán)利要求1的高通量篩選方法，其中待測化合物是單體化合物、由單體化合物組成的化合 物群或含有未知成分的中藥提取物。
4、 權(quán)利要求l的高通量篩選方法，其中靶蛋白選自于人體或動(dòng)物組織的與老年癡呆、心血管 疾病或腫瘤疾病相關(guān)的酶或受體。
5、 權(quán)利要求1的高通量篩選方法，其中緩沖液選自pH6.0~8.0的磷酸鹽緩沖液、pH6.0 8.0 的三羥甲基氨基甲烷緩沖液、pH6.0~8.0乙酸銨緩沖液或pH6.0 8.0碳酸氫銨緩沖液。
6、 權(quán)利要求1的高通量篩選方法，其中孵育緩沖液中還含有增溶劑，所述增溶劑選自吐溫、 二甲基亞砜、聚乙二醇、曲拉通、甲醇、乙醇中的一種或幾種。
7、 權(quán)利要求l的高通量篩選方法，其中分子排阻色譜柱填料選自Sephadex G-25、 Sephadex G-50或Sephadex LH-20,洗脫流速0.3-0.5ml/min;
8、 權(quán)利要求1的高通量篩選方法，其中在線固相提取柱選自O(shè)asis MCX在線色譜柱、Oasis WCX在線色譜柱、Oasis MAX在線色譜柱、Oasis WAX在線色譜柱或Oasis HLB在線色譜柱。
9、 權(quán)利要求1的高通量篩選方法，其中在線固相提取柱洗脫流速是2-4ml/min。
10、 權(quán)利要求1的高通量篩選方法，其中解離液是酸水溶液或酸水溶液與有機(jī)試劑的混合溶 液，所述酸水溶液選自三氟乙酸、甲酸、乙酸或鹽酸，pH為l-3;所述有機(jī)試劑選自甲醇或 乙腈。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及高通量篩選領(lǐng)域，涉及一種基于靶蛋白親和選擇的活性成分或活性成分群的高通量篩選方法，本發(fā)明通過將靶蛋白與待測化合物在緩沖液中孵育，孵育得到的混合溶液上樣于分子排阻色譜柱或在線固相提取柱，緩沖液洗脫，洗脫液經(jīng)解離，解離液再經(jīng)在線固相提取柱分離，最后導(dǎo)入高效液相-質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行分析，進(jìn)行化合物結(jié)構(gòu)確證，并對其進(jìn)行定量分析，計(jì)算這些活性成分對于靶蛋白的結(jié)合率，以評價(jià)其活性。本發(fā)明的篩選方法大大提高了從化合物群中篩選活性成分(群)的效率，是一種操作相對簡單，成本較低的高通量藥物篩選方法。
文檔編號G01N27/64GK101339167SQ20081012461
公開日2009年1月7日 申請日期2008年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月27日
發(fā)明者周建良, 安婧婧, 萍 李, 李會軍 申請人:中國藥科大學(xué)