專利名稱：氟核磁共振用于高通量篩選的用途的制作方法
本申請要求享有于2003年3月14日提交的美國專利臨時申請No.60/454,766的優(yōu)先權(quán)，該申請通過引用的方式被全文包括在本申請中。
背景技術(shù)：
當(dāng)前許多市場上所銷售的藥物都是通過高通量篩選(HTS)由先導(dǎo)化合物所發(fā)展而來的。在HTS中所使用的用于治療的標靶通常是從可由不同方式表達的克隆基因所產(chǎn)生的重組蛋白。大的化合物集一般是對照用于識別抑制劑的蛋白質(zhì)來進行篩選的。
在過去十年間，由于在各項目中有系統(tǒng)地應(yīng)用組合化學(xué)，其結(jié)果導(dǎo)致專有化合物集的規(guī)模成指數(shù)級增長?，F(xiàn)今，通過組合化學(xué)方法得到巨大的化合物庫，并與從傳統(tǒng)藥物化學(xué)和天然來源的化合物庫互為補充。機器人和自動控制的發(fā)展和應(yīng)用使得能夠在短時間內(nèi)對大量的化合物進行測試。若干新的檢測系統(tǒng)也被用于潛在先導(dǎo)分子的識別。
最近，核磁共振(NMR)已經(jīng)成為一種用于探測與藥物標靶相互作用的小分子的強有力的方法。盡管核磁共振并非一項靈敏的技術(shù)，但是它的優(yōu)點在于較少受到在其他的檢測系統(tǒng)中所觀測到的人為現(xiàn)象的影響。最近在低溫核磁共振探針技術(shù)方面的發(fā)展已經(jīng)減少了篩選所需的時間和所需的蛋白質(zhì)的量。
核磁共振方法已被用于對照同位素標記的蛋白質(zhì)篩選大的化合物集。在化合物混合物的存在下，對15N-1H HSQC光譜中的交叉峰的化學(xué)位移變化進行檢測。對混合物進行去褶合從而能夠識別與蛋白質(zhì)相互影響的分子(即，產(chǎn)生化學(xué)位移的化合物)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的三維結(jié)構(gòu)是已知的且已經(jīng)獲得了蛋白質(zhì)骨架共振的具體的NMR譜帶歸屬序列時，該方法就提供了關(guān)于配體結(jié)合位點和配體結(jié)合方式的重要的結(jié)構(gòu)信息。
另一種進行NMR篩選的方法是基于配體共振的檢測。在文獻中已經(jīng)給出了若干NMR參數(shù)以作為配體識別的工具。這些方法允許對篩選的化合物進行快速的去褶合，并且特別適合于低親和性配體介質(zhì)的識別。
然而，這些技術(shù)還存在一些缺陷。首先，不能直接獲得關(guān)于結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)信息。其次，由于在這些試驗中，通常使用相對于蛋白質(zhì)極大過量的測試化合物，因此不能檢測到高親和性配體和能夠與受體共價結(jié)合的分子。也就是說，將不能檢測到與蛋白質(zhì)結(jié)合更緊密的化合物或者動力學(xué)較慢的化合物，因為這些化合物在蛋白質(zhì)內(nèi)部的殘留時間比在NMR試驗中所使用的混合時間范圍(例如，1至2秒)更長。第三，溶解性差的可作為潛在配體的化合物難以被檢測到，因為該方法需要觀測配體的信號。
因此，所需要的是另外的可用于探測靶分子例如蛋白質(zhì)的配體的NMR方法，該方法不存在與常規(guī)的配體觀測篩選試驗有關(guān)的缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及合理的藥物設(shè)計。具體來說，本發(fā)明提供篩選與靶分子(例如，通常為蛋白質(zhì))相互作用的化合物的核磁共振(NMR)方法。該方法包括使用19F核磁共振，特別是19F核磁共振競爭結(jié)合試驗，以檢測結(jié)合相互作用。
競爭結(jié)合試驗包括在競爭分子的存在下置換參考化合物。優(yōu)選，參考化合物結(jié)合到靶分子的結(jié)合親和性在微摩爾范圍內(nèi)。盡管也可以使用本發(fā)明的方法評價比1微摩爾更弱(即，超過)的結(jié)合親和性的分子結(jié)合，但優(yōu)選與靶分子相互作用的測試化合物的結(jié)合親和性比1微摩爾更強(例如，在納摩爾范圍內(nèi))。
本發(fā)明的方法，特別是使用競爭結(jié)合試驗時，可被用于基于適當(dāng)安排的競爭結(jié)合試驗進行有效的高通量篩選(HTS)，且不具有與常規(guī)配體觀測篩選試驗相關(guān)的缺點。另外，該方法能夠使用單點測量來測定識別配體的KD值。使用該方法，可以在短時間內(nèi)對例如蛋白質(zhì)或DNA和RNA片段篩選數(shù)以千計的化合物。
還發(fā)現(xiàn)本發(fā)明可被用于化學(xué)混合物(即，兩種或多種測試化合物)例如植物和真菌提取物的快速篩選?？焖俸Y選技術(shù)一般包括提供多個測試樣品，每一測試樣品包含兩種或多種測試化合物的混合物。
本發(fā)明的方法包括使用至少如下步驟識別靶分子的配體提供與靶分子相互作用的19F-標記參考化合物；在靶分子的存在下采集19F-標記參考化合物的1D19F核磁共振波譜；提供包含至少一種測試化合物的測試樣品(優(yōu)選多個測試樣品)；在各測試樣品與靶分子的存在下采集19F-標記參考化合物的1D19F核磁共振波譜；比較在靶分子的存在下19F-標記參考化合物的波譜與在各測試樣品和靶分子的存在下19F-標記參考化合物的波譜，以測定一個或多個19F-標記參考化合物的共振的變化；以及識別至少一種與靶分子相互作用的測試化合物，其中該測試化合物置換19F-標記參考化合物。如果測試化合物(即，潛在的配體)將參考化合物從靶分子上置換下來，它就是一種配體。
優(yōu)選，本發(fā)明的方法包括識別參考化合物的步驟，該步驟包括在不存在靶分子的情況下采集潛在參考化合物的WaterLOGSY核磁共振波譜；在靶分子的存在下采集潛在參考化合物的WaterLOGSY核磁共振波譜；以及比較該WaterLOGSY波譜以鑒別該潛在化合物與靶分子有無相互作用。
對于本發(fā)明方法的某些具體實施方案，該參考化合物是與具有限定的行距、振幅和頻率的ERETIC信號所一起提供的。對于這些方法，在靶分子的存在下采集19F-標記參考化合物的1D19F核磁共振波譜包括在靶分子的存在下使用ERETIC信號采集19F-標記參考化合物的波譜；以及在各測試樣品和靶分子的存在下采集19F-標記參考化合物的1D19F核磁共振波譜包括在各測試樣品和靶分子的存在下采集19F-標記參考化合物的波譜。
對于本發(fā)明的某些具體實施方案，該19F-標記參考化合物是和一種19F-標記的非相互作用的化合物一起提供的。對于這些方法，在靶分子的存在下采集19F-標記參考化合物的1D19F核磁共振波譜包括在的靶分子存在下采集19F-標記參考化合物與19F-標記的無相互作用的化合物的波譜；以及在各測試樣品與靶分子的存在下采集19F-標記參考化合物的1D19F核磁共振波譜包括在各測試樣品以及靶分子的存在下采集19F-標記參考化合物與19F-標記的無相互作用的化合物的波譜。
在另一個具體實施方案，本發(fā)明提供一種篩選化合物以識別靶分子的配體的方法。該方法包括采集至少一種測試化合物的第一1D19F核磁共振波譜；將該至少一種測試化合物暴露于靶分子；采集已經(jīng)暴露于靶分子的至少一種測試化合物的第二1D19F核磁共振波譜；比較第一與第二波譜以測定一個或多個共振的變化并識別至少一種與靶分子相互作用的測試化合物。
附圖的簡要說明

圖1.由于在溶液中游離的小分子的19F信號的CSA相互作用以及當(dāng)被結(jié)合到一種大高分子時隨19F的拉莫爾頻率變化所導(dǎo)致的線寬的不同。使用方程1的最后項進行模擬，其假設(shè)條件為當(dāng)游離于溶液中時，對于小分子，CSA磁張量與100ppm的19F-CSA軸對稱并且相關(guān)時間τc為200ps。高分子的不同相關(guān)時間被認為對應(yīng)于不同尺寸的高分子(曲線所表示的值)。該虛垂線表示一些市售的波譜儀。與這些波譜儀的1H拉莫爾頻率對應(yīng)的值如該垂直線所示。
圖2.使用50μM的p21活化激酶的弱親和配體化合物A(KD＝10μM)進行的NMR篩選和去褶合。參考分子包含連接在六員芳環(huán)的CF3基團?；瘜W(xué)位移是以TFA為參照進行校正的。所記錄的兩個波譜中左圖是在不帶有τ＝0.1s的自旋回波圖的條件下記錄的，右圖是在帶有τ＝0.1s的條件下記錄的。圖譜(a)是僅以1.5μM的蛋白質(zhì)作為間諜分子的情形下獲得的；圖譜(b)是在20μM的七種化合物的混合物的條件下采集的，該混合物包含分子SPECS AB-323/25048456(荷蘭，Rijswijk，SPECS公司生產(chǎn))2-喹喔啉羧酸乙酯、異喹啉-3-羧酸甲酯、7-苯基-4-蝶啶醇、2-氨基-6-甲基喹喔啉-4-醇、5-甲基苯并咪唑和化合物B；圖譜(c)是在不含化合物B的混合物的存在下采集的；圖譜(d)是在僅有化合物B存在的情況下采集的。圖譜(e)所顯示的是在不含蛋白質(zhì)時將參考化合物溶于PBS中所采集的。每次試驗采集共計進行128次掃描并且每次掃描的重復(fù)時間為3.1s。
圖3.在用于p21活化激酶的弱親和配體化合物A以及無相互作用的三氟乙酸(TFA)分子的存在下記錄的一維19F波譜?；瘜W(xué)位移是以TFA為參照進行校正的。每次試驗采集共計進行128次掃描并且每次掃描的重復(fù)時間為3.1s?；衔顰和TFA的濃度分別為50以及15μM。圖譜(a)是在不存在蛋白質(zhì)的條件下記錄的，而圖譜(b)是在1.5μM的蛋白質(zhì)的存在下記錄的。圖譜(c)對應(yīng)于圖譜(a)和(b)之間的差別。示差光譜中所存在的僅有的信號是由間諜分子所產(chǎn)生的。
圖4.通過在用于p21活化激酶的弱親和配體化合物A以及無相互作用的三氟乙酸(TFA)分子的存在下記錄的一維19F波譜進行的HTS和去褶合?；瘜W(xué)位移是以TFA為參照進行校正的。圖譜(a-d)是使用50μM化合物A和15μM的TFA進行的NMR篩選和去褶合。圖譜(a)是在不存在蛋白質(zhì)的情況下記錄的，圖譜(b-d)是在1.5μM的蛋白質(zhì)的存在下記錄的。圖譜(b)是在不存在混合物的情況下記錄的，圖譜(c)是在20μM的包含六種化合物的混合物的存在下記錄的，該混合物包含分子SPECS AB-323/25048456、2-喹喔啉羧酸乙酯、異喹啉-3-羧酸甲酯、7-苯基-4-蝶啶醇、2-氨基-6-甲基喹喔啉-4-醇、5-甲基苯并咪唑，圖譜(d)是在加入了20μM化合物B的相同化學(xué)混合物的存在下記錄的。競爭分子化合物B的存在幾乎完全將參考化合物從蛋白質(zhì)(d)上取代下來，并且其波譜與溶于PBS的兩種分子的波譜(a)相似。
圖5.MDDR庫中包含一個氟原子的分子的百分比。該調(diào)查是從1981年至2000年間進行的，時間間隔為5年。各間隔的百分比標注在各條塊上方。
圖6.記錄的是隨HSA濃度變化的19F自旋回波波譜。對照分子(2)的CF3的共振位于+15.46ppm而間諜分子(1)的CF3共振位于+14.62ppm。該波譜是在320ms的總的自旋回波周期以及180個40ms之間的脈沖(2τ)的間隔條件下采集的。每次試驗采集共計進行96次掃描并且每次掃描的重復(fù)時間為3.5秒并且譜寬為25ppm。在傅里葉變換之前該數(shù)據(jù)被乘以一個1Hz指數(shù)函數(shù)。兩種分子的濃度為25μM而HSA的濃度由高到低為0、300、500、700和900nM。I(1)/I(2)的信號強度比由高到低為0.86、0.66、0.38、0.21和0.07。
圖7.記錄的是隨HSA濃度變化的19F自旋回波波譜。對照分子(3)的CF共振位于-64.06(下面的圖譜)以及對照分子(2)的CF3共振位于+15.46ppm(上面的圖譜)。該波譜是在80ms的總的自旋回波周期以及180個40ms的脈沖(2τ)之間的間隔條件下采集的。對于下面的圖譜總共掃描96次，而對于上面的圖譜總共掃描64次，重復(fù)時間3.5s，譜寬25ppm。在傅里葉變換之前該數(shù)據(jù)被乘以一個1Hz的指數(shù)函數(shù)。(3)和(2)的濃度分別為50和25μM，而HSA的濃度從左至右為0、150、300、450、600nM。在繪制比例強度下的I(3)/I(2)的信號強度比從左至右為0.94、0.69、0.53、0.36和0.25。
圖8.隨結(jié)合的對照分子([EL]/[LToT])(Y軸)變化的圖7的兩個19F信號的信號強度比(X軸)的曲線圖。右面的最后一個點對應(yīng)于不存在蛋白質(zhì)時的值。如前所示，兩個比例([EL]/[LTOT])是使用對于(3)的41±3.3μM的ITC-派生的KD值的約束進行計算的。圓圈所表示的值是使用44.3μM的KD值計算的，方塊所表示的值是使用37.7μM的KD值表示的。曲線表示這些試驗點的最佳擬合。
圖9.使用對照分子(2)進行的19F-NMR篩選(上部)和使用檢測分子(3)進行的19F-NMR篩選(底部)。該波譜是在160ms的總的自旋回波周期以及180個40ms的脈沖(2τ)之間的間隔條件下采集的。對于上面的圖譜總共掃描96次，重復(fù)時間3.5s，譜寬25ppm。在傅里葉變換之前該數(shù)據(jù)被乘以一個1Hz的指數(shù)函數(shù)。(3)和(2)的濃度分別為50和25μM。左邊的譜圖是在不存在蛋白質(zhì)的情況下記錄的，而全部其他的譜圖是在600nM HSA的存在下記錄的。左起第2圖是在不存在化學(xué)混合物的條件下記錄的，左起第3圖是在50μM的5-CH3D，L色氨酸和蔗糖的存在下記錄的，右圖是在50μM的5-CH3D，L色氨酸和蔗糖和25μM的(4)的存在下記錄的。
圖10.19F-NMR篩選的探測范圍使用對照分子(2)進行的19F-NMR試驗(上部)和使用間諜分子(3)進行的試驗。該波譜是在320ms的總的自旋回波周期(上部)以及1.2s的總的自旋回波周期在180個40ms的脈沖(2τ)之間的間隔條件下采集的。共進行了64次(上部圖譜)和128次(下部圖譜)掃描，重復(fù)時間3.5s，譜寬25ppm。在傅里葉變換之前該數(shù)據(jù)被乘以一個1Hz的指數(shù)函數(shù)。(3)和(2)的濃度分別為50和25μM。左邊的譜圖是在不存在蛋白質(zhì)的情況下記錄的，而全部其他的譜圖是在僅有150nM HSA的存在下記錄的。左起第二個圖譜是在不存在化學(xué)混合物的條件下記錄的、右圖是在包含25μM的(4)的混合物的存在下記錄的。
圖11.在非氘化緩沖劑和洗滌劑的存在下進行的19F-NMR篩選。上圖是在50μM的間諜分子(3)和25μM的對照分子(2)的存在下，溶于100mM HEPES和1甘油的600nM的HSA溶液的質(zhì)子波譜。在用水屏蔽后，唯一可見的信號是緩沖劑和甘油的信號。以2.7s的重復(fù)時間記錄總共128次掃描。下部左起第1和第3圖譜是在不存在混合物的溶液中記錄的19F波譜，而左起第2和第4譜圖是在包含25μM(4)的混合物的存在下的相同溶液中記錄的。該波譜是在160ms的總的自旋回波周期以及180個40ms的脈沖(2τ)的間隔條件下采集的?？偣灿涗?4次(左圖)和128次(掃描)，重復(fù)時間為3.5s，譜寬25ppm。在傅里葉變換之前該數(shù)據(jù)被乘以一個1Hz的指數(shù)函數(shù)。
圖12.化合物1-4的結(jié)構(gòu)。
發(fā)明的詳細描述本發(fā)明涉及19F-NMR，特別是19F-NMR競爭結(jié)合試驗的用途。即，本發(fā)明涉及使用19F試驗的基于配體的篩選(優(yōu)選，競爭篩選)。在這些試驗中氟-19檢測相對于質(zhì)子檢測具有許多優(yōu)點。
在這些試驗中氟能作為一個優(yōu)選的核是因為當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合時，其顯著的化學(xué)位移各向異性(CSA)有助于配體信號的19F自旋-自旋弛豫。也就是說，CSA對19F自旋-自旋弛豫貢獻使得氟信號對于與標靶的配合形成的效果尤其敏感?？梢允褂冒陀H和性至中等親和性的配體作為參考分子用于新配體的檢測和表征。此外，由于大多數(shù)化合物中不含氟，因此氟的檢測顯著地減少或甚至消除了譜線的重疊，而這種譜線的重疊常在質(zhì)子(1H)NMR中出現(xiàn)。像質(zhì)子NMR那樣，19F-NMR也是高度靈敏的并能夠快速采集數(shù)據(jù)，從而使得能夠高通量地篩選巨大的化合物庫。氟常被用于藥物涉及中以提高生物活性化合物的藥物(代謝)動力學(xué)性質(zhì)。由于大約12％的包含有效化學(xué)目錄篩選化合物(Available Chemical Directory Screening Compounds(ACD-SC))的分子都包含一個氟原子，一般可以不借助于化學(xué)合成就能獲得用于競爭篩選的參考化合物。實際上，發(fā)現(xiàn)分別在大約150,000和40,000個分子中，分別含有氟代苯和三氟甲基苯基殘基。
競爭結(jié)合試驗包括在競爭分子的存在下置換一種參考化合物。優(yōu)選，該參考化合物在微摩爾范圍內(nèi)的結(jié)合親和力下與靶分子結(jié)合。盡管也可使用本發(fā)明的方法評價以弱于(即，超過)1微摩爾的親和力結(jié)合的化合物，但優(yōu)選測試化合物以強于(即，小于)1微摩爾(例如，該納摩爾范圍內(nèi))的結(jié)合親和力與靶分子結(jié)合。
盡管此處所述的方法特別用于識別與靶分子相對強的結(jié)合劑的配體，該方法也可被用于識別較寬范圍內(nèi)的結(jié)合親和力的配體。相對強的結(jié)合劑通常被定義為解離結(jié)合常數(shù)KD小于大約1微摩爾，優(yōu)選小于大約500nM，更優(yōu)選小于大約100nM的那些。
競爭結(jié)合試驗不局限于篩選高度可溶于緩沖水溶液的化合物庫。一般地，僅有參考化合物是可溶于水的，并且仍可通過它們對參考化合物的信號的間接作用檢測有限溶解度的化合物。為了避免對照分子與受體以及與用于篩選的混合物的分子的非特異性的相互作用所引起的干擾，對照分子(即，從起角色來看，被稱為間諜分子)通常是水溶性的。使用對照分子的滴定NMR試驗通常是首先在不同的配體濃度以及固定的蛋白質(zhì)濃度、或者不同的蛋白質(zhì)濃度以及固定的配體濃度下進行的(C.Dalvit等，J.Am.Chem.Soc.，124，7702-7709(2002))。這些試驗被用于篩選體系條件的優(yōu)化以及用于從單點測量中所識別出來的NMR采樣的結(jié)合常數(shù)。由于強配體對間諜分子具有巨大的影響，因此可以被容易地識別出來。然而，目前的1H-NMR競爭篩選法的代表性局限在于參考化合物與測試化合物之間的譜線重疊，特別是在篩選巨大的化學(xué)混合物時。通過利用其他的核(例如，19F)的NMR探測顯著地減少了這些問題。
本發(fā)明提供了使用與靶分子相互作用的配體的各種方法。
在某些具體實施方案中，該方法包括篩選化合物以識別靶分子的配體。該方法包括采集至少一種測試化合物的第一1D19F核磁共振波譜；將該至少一種測試化合物暴露于靶分子下；采集至少一種已經(jīng)暴露于靶分子的測試化合物的第二1D19F核磁共振波譜；比較第一和第二波譜以測定一個或多個共振的變化，并識別至少一種與靶分子相互作用的測試化合物。
在某些具體實施方案中，使用如下步驟提供與靶分子相互作用的19F-標記參考化合物；在靶分子的存在下采集該19F-標記參考化合物的1D19F核磁共振波譜；提供至少一個測試樣品(優(yōu)選多個測試樣品)，各測試樣品包含至少一種測試化合物；在各測試樣品和靶分子的存在下采集該19F-標記參考化合物的1D19F核磁共振波譜；比較在靶分子的存在下該19F-標記參考化合物的波譜與在各測試樣品和靶分子的存在下該19F-標記參考化合物的波譜，以測定一個或多個該19F-標記參考化合物共振中的變化；并識別其中至少一種與靶分子相互作用的測試化合物，其中測試化合物置換該19F-標記參考化合物(一般地，這時因為測試化合物具有至少與參考化合物一樣緊密的結(jié)合親和力的結(jié)果)。
一般地，一個或多個該19F-標記參考化合物共振的變化包括至少一個參考共振的信號強度的增加。優(yōu)選，一個或多個19F標記參考化合物共振的變化包括至少一個參考共振的銳化。
如果需要，在采集19F波譜之前，可以施加自旋回波型過濾器，如可以如實施例部分所述測定此處所述的任何方法最佳試驗條件。具體地說，這通常包括在用于比較步驟的在靶分子的存在下采集該19F-標記參考化合物的1D19F核磁共振波譜之前進行如下步驟在不同濃度的靶分子或不同濃度的19F-標記參考化合物的存在下，采集該19F-標記參考化合物的1D19F核磁共振波譜。所采集的信息用于測定識別至少一種與靶分子相互作用的測試化合物的最佳試驗條件。
當(dāng)在各測試樣品和靶分子的存在下采集該19F-標記參考化合物1D19F核磁共振波譜時，可以使用各種脈沖序列。為有效比較波譜，需要具有相同的試驗條件；然而，只要在篩選之前已經(jīng)產(chǎn)生了滴定試驗的圖形，靶化合物和19F-標記對照分子的濃度就可以改變。通常，溫度和緩沖條件是相同的，因為這些試驗條件的改變可以影響參考化合物的結(jié)合常數(shù)。
在上述用于兩種或多種測試化合物的混合物的一般化方法中，識別至少一種測試化合物可以優(yōu)選包括在各靶分子的存在下分別記錄該19F-標記參考化合物的1D19F核磁共振波譜。隨后比較在靶分子的存在下19F-標記參考化合物的波譜與在各測試化合物和靶分子的存在下19F-標記參考化合物的波譜，以測定所選擇的19F-標記參考化合物共振的變化。這些試驗的脈沖序列通常是相同的。這種通常被本領(lǐng)域技術(shù)人員稱為去褶合試驗。
若需要，可以使用NMR技術(shù)測定測試化合物和/或參考化合物的解離常數(shù)(即，結(jié)合親和力)，盡管也可使用其他的已知的技術(shù)(例如，等溫滴定量熱法)。優(yōu)選使用等溫滴定量熱法或熒光光譜法測定參考化合物的結(jié)合親和力，其具體細節(jié)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所屬性的并且如實施例部分所述。
例如，在一種NMR方法中，除了上述一般化方法的步驟外，可以采集在不同濃度的19F-標記參考化合物條件下在靶分子的存在下19F-標記參考化合物的1D19F的核磁共振波譜。做為選擇或另外可以采集在不同濃度的靶分子的存在下19F-標記參考化合物的1D19F核磁共振波譜。如實施例所述，該信息可被用于測定測試化合物的解離常數(shù)。
可以使用各種技術(shù)以提高本發(fā)明方法的精度。一般地，可以使用內(nèi)標，該內(nèi)標可以是一個無相互作用的化合物。
作為使用無相互作用的分子的一個替代方案是使用ERETIC方法(S.Akoka等，Anal.Chem.，71，2554-2557(1999)；和V.Silvestre等，S.Anal.Chem.，73，1862-1868(2001)。該技術(shù)依靠電子產(chǎn)生一個規(guī)定頻率、線寬和振幅的信號。使用源于樣品的FID采集一個假FID。調(diào)整該仿真信號的振幅，以形成一個與不存在蛋白質(zhì)時所記錄的參考化合物的信號相當(dāng)?shù)膹姸?。該幅值然后被用于滴定和NMR篩選試驗并測量真實和仿真信號的信號強度比。加入一個ERETIC信號類似于給正?；男盘栐黾右粋€偽信號。
對于本發(fā)明的某些具體實施方案，參考化合物是和具有規(guī)定線寬、振幅和頻率的ERETIC信號一起提供的。對于這些方法，在靶分子的存在下采集19F-標記參考化合物的1D19F核磁共振波譜包括在靶分子的存在下采集帶有ERETIC信號的19F-標記參考化合物的波譜；以及在各測試樣品和靶分子的存在下采集19F-標記參考化合物的1D19F核磁共振波譜包括在各測試樣品和靶分子的存在下采集具有ERETIC信號的19F-標記參考化合物的波譜。
對于本發(fā)明的某些具體實施方案，19F-標記參考化合物是與19F-標記無相互作用的化合物一起提供的。對于這些方法，在靶分子的存在下采集19F-標記參考化合物的1D19F核磁共振波譜包括在靶分子的存在下采集19F-標記參考化合物和19F-標記無相互作用的化合物的波譜；以及在各測試樣品和靶分子的存在下采集19F-標記參考化合物的1D19F核磁共振波譜包括在各測試樣品和靶分子的存在下采集19F-標記參考化合物和19F-標記無相互作用的化合物的波譜。由于這種無相互作用的化合物在測試濃度下不與靶分子結(jié)合，它們被用作對照物。
結(jié)合本發(fā)明的競爭結(jié)合試驗，可以使用WaterLOGSY方法以及本領(lǐng)域所公知的其他方法例如光譜或生物化學(xué)使用，以識別參考化合物。優(yōu)選通過下列步驟識別參考化合物在不存在靶分子的條件下采集一個潛在參考化合物的WaterLOGSY核磁共振波譜；在靶分子的存在下采集潛在參考化合物的WaterLOGSY核磁共振波譜；以及比較WaterLOGSY波譜以識別是否為與靶分子相互作用的潛在參考化合物。
該WaterLOGSY方法(亦被稱為經(jīng)由梯度波譜Y觀測的水-配體)(Water-Ligand Observed via Gradient Spectroscopy Y)是以從大量水的質(zhì)子向與靶分子(例如，蛋白質(zhì))相互作用的化合物的氫核的磁化傳遞為基礎(chǔ)的。使用WaterLOGSY技術(shù)，通過它們的水-配體核歐沃豪斯效應(yīng)(NOE)的反信號將結(jié)合化合物與非結(jié)合劑區(qū)分開來。該WaterLOGSY方法在下列文獻中有更具體的描述國際專利申請WO01/23330(2001年4月5日出版)、C.Dalvit等，J.Biomol.NMR，18，65-68(2000)、以及申請人于2002年6月5日提交的共同未決美國專利申請序列號No.60/386,896(代理編號No.01168.PRO1)。
可被用于本發(fā)明的方法的靶分子包括各種分子，特別是大分子，例如多肽(優(yōu)選，蛋白質(zhì))、多核苷酸、有機聚合物等等。這些化合物可以在活細胞或溶菌產(chǎn)物中。
在此處所使用的“多核苷酸”是指任意長度的聚合形式的核苷酸，或者核糖核苷酸或脫氧核苷酸(deoxynucleotide)，并且包括雙鏈或單鏈DNA以及RNA。多核苷酸可以包括編碼和非編碼區(qū)，并且可以直接由天然來源(例如，微生物)獲取，或者可以借助于重組體、酶或化學(xué)技術(shù)制備。多核苷酸的拓撲結(jié)構(gòu)可以是線性的或者環(huán)形的。多核苷酸可以是例如媒介物，例如表達或克隆媒介物，或者是一個片段。
此處所使用的“多肽”是指氨基酸的聚合物并且不是指具有規(guī)定長度的氨基酸的聚合物。因此，例如，術(shù)語肽、低聚肽、蛋白質(zhì)和酶被包括在多肽的定義中。該術(shù)語還包括多肽的后表達修飾，例如糖基化、乙?；?、磷酸化等等。
參考化合物是一個與選定靶分子以非常淺的結(jié)合親和力相互作用的化合物。相對弱的相互作用參考化合物一般被定義為解離結(jié)合常數(shù)KD為至少10微摩爾的化合物。
可用來評價的測試化合物可以是任何重量的化合物，其與標靶潛在地具有各種結(jié)合親和力。值得注目的是，本發(fā)明的方法具有能夠檢測為相對強的結(jié)合劑的化合物。相對強結(jié)合劑一般被定義為解離結(jié)合常數(shù)KD為小于大約1微摩爾的化合物。以使用本發(fā)明的方法篩選的化合物包括，例如，植物提取物、真菌提取物、其他天然產(chǎn)品和小有機分子庫。
本發(fā)明可以從具有大范圍的化合物庫中篩選配體(該方法特別適用于具有極低溶解性的化合物)。值得注目地和有利地，對于某些具體實施方案，本發(fā)明優(yōu)選包括在相對低的標靶(即，靶分子)濃度下進行結(jié)合試驗。因此，本發(fā)明的優(yōu)選的具體實施方案允許檢測僅能邊緣溶解的化合物。一般地這些化合物在水中的溶解度不大于10μM。
盡管如果需要可使用更高的濃度，優(yōu)選各樣品中各測試化合物的濃度不大于大約100μM。然而，本發(fā)明的方法的顯著優(yōu)點在于可以使用極低的配體濃度(例如，不大于大約10μM)。
所使用的提取物濃度以及測試化合物對靶分子的比例可以隨靶分子的尺寸、有效靶分子的量、所需要的結(jié)合親和力檢出限和所需要的數(shù)據(jù)采集的速度的改變而改變。優(yōu)選靶分子的濃度約為100nM至大約10μM。
用于測試混合物的溶劑可以是各種溶劑，只要這些溶劑不是標靶降解(例如使變性)。一般地使用水和DMSO。可以使用質(zhì)子化的溶劑和洗滌劑。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，已知，在需要時可以向該測試化合物中加入其他的組分(例如，緩沖劑)以獲得某些優(yōu)點。
還可發(fā)現(xiàn)本發(fā)明可用于化學(xué)混合物(即兩種或多種測試化合物的混合物)的快速篩選。
快速篩選技術(shù)一般地包括提供多個測試樣品，各測試樣品包含兩種或多種測試化合物的混合物。
一旦配體(優(yōu)選高親和性配體)已被識別和確認，其結(jié)構(gòu)就被用于具有類似結(jié)構(gòu)的用于測試活性或親和性的有效化合物，或用于控制用來測試活性或親和性的結(jié)構(gòu)相關(guān)化合物。然后從市場購得這些化合物或者合成這些化合物。最常見的情形是，然后使用酶試驗評價它們的活性。在分子標靶不是酶或者不能進行酶試驗時，可以使用類似于上面的描述的使用NMR技術(shù)、或其他的物理方法例如等溫變性量熱法測試其親和性。在該步驟中所識別的與分子標靶的親和性為大約1.0×10-6M或更大的化合物通常被當(dāng)作先導(dǎo)化學(xué)模板。
在有些情況下，使用更復(fù)雜的NMR試驗或其他的物理方法例如量熱法或X-射線晶體衍射法研究配體結(jié)合。
用于優(yōu)化1H和19F檢測的冷凍探針技術(shù)可以進一步提高這些篩選方法的處理能力。在這種情況下，限制因素將是樣品變化所需的時間、平衡樣品溫度和樣品。
實施例通過下面的實施例進一步說明本發(fā)明的目的及優(yōu)點，但是這些具體實施例中所述的具體材料及其使用的量，以及其他的條件和具體情況，不應(yīng)被過度地解釋為對本發(fā)明的限制。
材料和方法對于本實施例(I)的第一組試驗，絲氨酸/蘇氨酸p21活化激酶的激酶域(MW大約34000)被表達為一個大腸桿菌中的GST融合蛋白質(zhì)并在除去GST標記后將其純化均勻。將NMR樣品溶于pH7.4的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，代碼P-3813，Lot 100K8211，Sigma公司生產(chǎn))。將D2O加入到溶液(8％最終濃度)中以進行信號鎖定。在氘代DMSO的儲液中制備小分子并在253K溫度下保存。
對于實施例(II)的第二組試驗，脂肪酸游離人血清白蛋白(A-3782)是從Sigma公司購得并未經(jīng)進一步純化而使用。在5μM EDTA的存在下，將NMR樣品溶于pH為7.4的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，代碼P-3813，Lot 100K8211，Sigma公司生產(chǎn))中。將D2O加入到溶液(8％最終濃度)中以進行信號鎖定。在或者氘代DMSO或水的濃縮儲液中制備小分子并在253K溫度下存儲。
NMR對于實施例(I)的第一組試驗，全部NMR波譜是在293K溫度下，使用配備有取樣管理系統(tǒng)(SMS)自動進樣器的Varian Inova 600MHz(對于19F為564MHz)核磁共振波譜儀記錄的。使用激動造型序列(T.-L.Hwang，J.Magn.Reson.A，112，275-279(1995))在1H檢測試驗中實現(xiàn)對水的抑制。該模式的兩個對水具有選擇性的180°二次脈沖和四脈沖場梯度地脈沖寬度分別為2.6和1毫秒(ms)。
對于實施例(II)的第二組試驗，全部核磁共振波譜是在300K溫度下試驗Bruker Avance 600核磁共振波譜儀在564MHz的19F拉莫爾頻率下操作所記錄的。所使用的雙線圈{19F}-{1H}探針中將內(nèi)層線圈調(diào)整到19F的頻率將外層線圈調(diào)整到1H的頻率。這些探針的氟背景不會對測量產(chǎn)生干擾。這些信號較寬并因此在使用自旋回波模式所記錄的參考分子和對照分子的波譜中并不明顯。在采樣期間，全部的波譜都是使用一個弱Waltz-16質(zhì)子去耦進行記錄的。通常記錄4-8次空掃以平衡溫度。在采樣之前使用了不同長度和2τ時間間隔的Carr-Purcell-Meibom-Gill模式，并且參照三氟乙酸對化學(xué)位移進行校正。
熒光熒光測試是通過一個Jasco J-715分光偏振計使用垂直于該激發(fā)束的輔助光電倍增管來采集的。該激發(fā)波長是310納米(頻帶寬度5納米)并使用一個385納米截止濾光片。使用與NMR試驗中所使用的相同來源的脂肪酸游離HSA進行親和性測試。在5μM EDTA的存在下在pH值為7.4的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，代碼P-3813，Lot 100K8211，Sigma公司生產(chǎn))中制備分析物和HSA溶液。在使用前通過一個0.2μM的濾波器過濾該緩沖液。通過將2.0mL的3μM的分析物溶液等分到一個通道長度為1.0cm的小石英池中，并使用HSA(裝料濃度250μM)滴定該溶液。
ITC試驗使用Microcal Inc.(Northampton，MA)制造的OMEGA滴定微量熱計進行等溫滴定量熱試驗。滴定微量熱計由容納在絕熱外殼中的樣品池和參比池組成。參比電池中裝滿PBS。在1.37mL的樣品池中放入23μM的溶于PBS+2％DMSO的HSA溶液。0.8mM的溶于相同緩沖劑的分析物被放在一個250μL的注射器中。在25℃溫度下，通過計算機控制的步進電動機向樣品池中注射三十次分析物(每次注射8μL，每次12秒)。注射器攪動速度為400rpm。通過一個與Microcal毫微伏特放大器連接的熱電裝置測量各次注射吸收和釋放的熱。結(jié)合相互作用的滴定等溫線由每次注射的微分熱流組成。通過向PBS注入分析物的稀釋熱是微不足道的。結(jié)合等溫線與包括在該儀器中的使用迭代非線性最小平方算法的單一結(jié)合部位模型(T.Wiseman等，Anal.Biochem.，179，131-137(1989))一致。
實施例I結(jié)果和討論19F弛豫理論19F的縱向弛豫不是競爭結(jié)合試驗的有用參數(shù)，因為它缺乏識別與大分子相互作用的小分子所必需的直接τC相關(guān)性。然而，自旋-自旋弛豫速度R2卻是一個非常有效的參數(shù)，因為它包含了通過如下方程描述的異核19F-1H偶極相互作用以及19F化學(xué)位移各向異性(CSA)相互作用在零頻率下計算的譜線密度(M.Goldman，Quantum Description ofHigh-Resolution NMR in Liquids，Clarendon Press，Oxford，(1988)) 215Δσ2B02γF2τc{23+12(1+ωF2τc2)}---(1)]]>Hi表示與氟原子空間上接近的參考化合物以及蛋白質(zhì)的全部質(zhì)子，Δσ為19F原子的CSA以及B0為磁場的強度，γH和γF分別為質(zhì)子和氟的旋磁比，ωH和ωF分別為質(zhì)子和氟的拉莫爾頻率，τc為相關(guān)時間，且rFHi為Hi質(zhì)子和氟原子之間的核間距。
由于19F的CSA非常大(多達數(shù)百ppm)(J.T.Gerig，Methods inEnzymol.，177，3-23(1989)；和J.T.Gerig，Prog.NMR Spectrosc.，26，293-370(1994))，它將顯著地增加結(jié)合配體部分自旋-自旋弛豫。CSA對弛豫的影響與磁場的平方成正比。因此，在更高磁場下的效果更為明顯?？梢詮膱D1的模擬中理解這一點，其中由于游離于溶液的小分子的以及當(dāng)與不同大小的大分子結(jié)合時的19F線寬的差異是一個與拉莫爾頻率相關(guān)的曲線。對于有利于溶于中的小分子，模擬時使用Δσ為100ppm，τC為200ps。由圖1可知，由于CSA的強烈影響，現(xiàn)有的最強的磁場對于強結(jié)合配體和被19F選擇性標記的蛋白質(zhì)的試驗并不是最佳的。相反，強磁場特別適于使用弱親和性參考分子進行的競爭結(jié)合HTS試驗。游離和結(jié)合狀態(tài)的參考分子之間的19F共振線寬的差異隨磁場的強度而增加。此外，在游離與結(jié)合狀態(tài)下的氟配體共振的化學(xué)位移差異(δ游離-δ結(jié)合)也變得更大。這些導(dǎo)致對交換術(shù)語R2，ex對參考化合物的線寬的產(chǎn)生顯著的影響(J.W.Peng，J.Magn.Reson.，153，32-47(2001))R2,ex=[EL][LTOT](1-[EL][LTOT])24π2(δfree-δbound)2K-1---(2)]]>[EL]/[LTOT]為結(jié)合配體的份數(shù)，1/K-1配體結(jié)合到蛋白質(zhì)上的殘留時間。
參考化合物以及篩選參數(shù)的選擇NMR篩選試驗一般是相對于蛋白質(zhì)在10-100倍過量的配體(僅產(chǎn)生少部分的結(jié)合配體)的條件下進行的，前述部分中的術(shù)語(Δσ，B0，δ游離-δ結(jié)合，1/K-1等)在參考化合物的選擇中非常重要。由于蛋白質(zhì)的影響所引起的移動，當(dāng)與游離配體的化學(xué)位移相比時，與蛋白質(zhì)結(jié)合的參考化合物的19F信號的化學(xué)位移可以是非常不同的(J.T.Gerig，Prog.NMR Spectrosc.，26，293-370(1994)；和J.Feeney等，J.Am.Chem.Soc.，118，8700-8706(1996))。因此甚至具有μM范圍的中等結(jié)合親和力的分子也可以顯示出兩個清楚的共振，一個為結(jié)合形式，另一個為游離形式。這是由在與游離化合物和結(jié)合化合物之間的交換速度相比時，兩個共振化學(xué)位移的差異更大這一實事所導(dǎo)致的。在HTS中，僅監(jiān)測在游離配體頻率下的信號，因為蛋白質(zhì)的濃度非常低(數(shù)百nM至1-5μM))，以允許觀測結(jié)合形式的很寬的共振。
為了評價任何用于競爭篩選的給定氟化配體的適用性以及為了測定最佳試驗參數(shù)，試驗分子的滴定試驗是通過采集1D19F R2過濾試驗或簡單的1D試驗通過改變結(jié)合配體的份數(shù)(C.Dalvit等，J.Am.Chem.Soc.，124，7702-7709(2002))來進行的。為了獲得更好的試驗靈敏度，在采集周期期間使用1H去耦。測試測試化合物以及試驗條件，以確定它們的靈敏度以及用于確定一個在與標靶結(jié)合時顯示出顯著的微擾的單一氟共振的存在。
一旦識別了適宜的配體以及確定了試驗條件，然后就可以通過如圖2所示監(jiān)測參考分子的19F信號的自旋-自旋弛豫的變化(或者經(jīng)由使用CPMG或自旋回波模式進行的R2過濾試驗或簡單地通過分析線寬)進行篩選。
在這種情況下，在1.5μM的PAK4的存在下使用50μM的中等親和性配體化合物A(KD＝10μM)作為參考化合物。在包含高親和配體的下化合物混合物的存在下，在自旋回波之后可以看到化合物的信號顯著增強(比較圖2a與2b)。這種信號的增加顯示由于與包含在混合物中的分子的競爭結(jié)合使得參考分子化合物A的結(jié)合減小。簡單去褶合試驗(2c和2d)允許識別作為活性分子的化合物B。
當(dāng)使用自旋回波類型序列時，建議在硬180°脈沖之間使用足夠長的延遲以便充分利用方程(2)的交換項。之所以能這樣做是因為不存在同核標量耦合并且異核標量耦合下的逸出被重聚焦了。然而，延遲不應(yīng)過長以避免靜磁場的非均勻性所產(chǎn)生的弛豫。
除了氟化參考化合物，包含一個不與受體相互作用的氟化小分子(對比化合物)是有利的。圖3顯示在存在與不存在蛋白質(zhì)的條件下所記錄的間諜分子和無相互作用分子的19F波譜中的這一原理。當(dāng)間諜分子的信號發(fā)生光譜變化時，小分子的信號不會發(fā)生變化。從圖3的示差光譜可以看出這一點。該無相互作用的分子的信號為一個內(nèi)標，該內(nèi)標可用于使用單一使用校正間諜分子的信號變化。應(yīng)當(dāng)指出的是，即使小分子與受體具有弱相互作用(mM范圍)，這也不會對測量產(chǎn)生干擾。當(dāng)與弱結(jié)合常數(shù)相比小分子的濃度(10-30μM)的數(shù)量級更小，因此與受體結(jié)合的化合物的份數(shù)是可以忽略不計的。為了證明這一點，選擇三氟乙酸(TFA)作為與受體無相互作用的小分子。應(yīng)當(dāng)指出的是在篩選中的一些化合物中可能含有痕量的TFA。因此，盡管它對于這里所提出的概念的證明是有效的，應(yīng)當(dāng)選擇其他的參考化合物以用于更普遍的應(yīng)用。同時使用間諜分子和參考化合物通過HTS和去褶合以識別先導(dǎo)化合物的應(yīng)用如圖4所示。該六化合物混合物的確不影響間諜分子共振的線寬(圖4c)并且參考化合物A的信號明顯不如TFA的信號強。然而，在七化合物混合物中存在一個強競爭分子(化合物B)將導(dǎo)致間諜分子共振的銳化，并且這兩個信號具有相當(dāng)?shù)膹姸取?br> 如C.Dalvit等，J.Am.Chem.Soc.，124，7702-7709(2002)所述，可以從與結(jié)合配體份數(shù)成曲線關(guān)系的19F共振的信號強度比例以及測量在競爭分子的存在下參考分子的信號強度的變化得到識別NMR采樣的結(jié)合常數(shù)。在該具體情形中，NMR-采樣化合物B的結(jié)合常數(shù)為200+/-100nM。當(dāng)將19F試驗用于HTS時，同樣重要的是記錄1H波譜以測定包含該化學(xué)混合物的化合物的濃度，并由此得出一個NMR采樣的可靠的結(jié)合常數(shù)。
在采集期開始之前，還可以在19F試驗中施加一個1H至19F NOE步驟，以避免從質(zhì)子到氟原子自旋地磁化轉(zhuǎn)移?？梢酝ㄟ^不同的方式進行該步驟。對于不與大受體相互作用的小分子，能觀察到19F信號的增強。對于與受體弱相互作用的分子，觀察到非常到非常弱的信號增加或者信號減弱，這取決于結(jié)合受體的份數(shù)、蛋白質(zhì)相關(guān)時間，以及，取決于NOE步驟是如何實施的。這些異核NOE的差異可被有效地用于競爭結(jié)合HTS試驗。當(dāng)在競爭分子的存在下，間諜分子被從受體上置換下來后，由于異核NOE使得線寬更小以及信號增強，其19F信號也變得更強。
實施例II結(jié)果與討論原理19F-NMR信號的靈敏度與(γF/γH)3成正比，其中γF和γH分別是氟和質(zhì)子的旋磁比。由于19F是唯一的穩(wěn)定的氟同位素并具有1/2自旋，其靈敏度很高，是質(zhì)子的0.83倍。在質(zhì)子去耦的條件下，氟信號表現(xiàn)為單共振峰，因此信號很強烈。
19F橫向弛豫是用于通過競爭結(jié)合試驗進行的監(jiān)視的非常有用的參數(shù)。位于一點距離上的氟和質(zhì)子之間的偶極相互作用(0.88倍)與相同距離的兩個單獨質(zhì)子之間的偶極相互作用在大小上非常接近。因此對于參考分子的氟原子和質(zhì)子的偶極作用是非常接近的。氟信號的橫向弛豫速度R2具有額外的影響，這種液相影響源于19F原子的大量的CSA相互作用并且可通過下式表示(D.Canet，Nuclear MagneticResonance Concepts and Methods，John Wiley & Sons，Chichester，(1996))R2CSA=215Δσ2(1+ηCSA23)B02γF2τc{23+12(1+ωF2τc2)}---(3)]]>其中Δσ為19F原子的CSA并可通過Δσ＝σzz-(σxx+σyy)/2得出。不同的σ是該組分的該化學(xué)位移磁張量。不對稱參數(shù)ηCSA＝(3/2)(σxx-σyy)/Δσ并且對于軸對稱的化學(xué)位移磁張量ηCSA＝0。B0為磁場強度，γF是氟旋磁比，ωF為氟拉莫爾頻率，τc為相關(guān)時間。
如上述第一組試驗(I)的討論，所進行的模擬假定一個軸對稱的CSA磁張量并且對于游離與結(jié)合態(tài)的配體假定其具有相同的CSA，如圖1所示，僅由于CSA作用單獨導(dǎo)致的游離合結(jié)合狀態(tài)之間的參考分子的19F信號的線寬的差異可以非常大(C.Dalvit等，Comb.Chem.HTS，5，605-611(2002)以及上述實施例(I))。這些差異隨受體的尺寸以及磁場強度的平方而增加。高磁場可以導(dǎo)致高分子(例如，19F選擇性標記的蛋白質(zhì))或者強蛋白質(zhì)結(jié)合受體的氟信號具有非常寬的線寬(＞200Hz)。(W.E.Hull等，J.Mol.Biol.，98，121-153(1975)；J.T.Gerig，Methods in Enzymol.，177，3-23(1989)；和J.T.Gerig，Prog.NMR Spectrosc.，26，293-370(1994))。這樣的線寬使得高分子或高親和性配體的氟共振的直接檢測不能被用于篩選。相反，這樣的磁場強度非常適合于使用弱親和性參考分子的競爭結(jié)合試驗，其中可以控制和檢測的公開由觀測的線寬得到的游離和結(jié)合狀態(tài)之間的平均值(C.Dalvit等，Comb.Chem.HTS，5，605-611(2002)和上述實施例(I))。
在采集期開始前，脈沖序列一般采用Carr-Purcell Meibom Gill(CPMG)自旋回波模式(H.Y.Carr等，Phys.Rev.，94，630-638(1954)；和S.Meiboom等，Rev.Sci.Instrum.，29，688(1958))。在自旋回波模式末期，參考分子的信號強度I(n2τ)由如下方程得到(T.C.Farrar等，Pulse and Fourier Transform NMR，Introduction toTheory and Methods，Academic Press，New York，1971)I(n2τ)=I0e-γF2G2Dobs(n2τ)τ23e-n2τR2,obs---(4)]]>其中I0是首次90°脈沖之后的信號強度，2τ是180°脈沖的序列之間的時間間隔，G是靜態(tài)磁場的非均勻性，γF是氟的旋磁比，以及n是自旋回波模式的循環(huán)數(shù)。Dobs，所觀測到的弱親和性參考分子的遷移擴散系數(shù)，并由如下方程得出Dobs=[EL][LTOT]Dbound+(1+[EL][LTOT])Dfree---(5)]]>其中，D結(jié)合與D游離分別是結(jié)合與游離態(tài)的參考分子的擴散系數(shù)。[EL]/[LTOT]和(1-[EL]/[LTOT])分別是結(jié)合與游離配體的系數(shù)。
弱結(jié)合參考分子的橫向弛豫速度R2，obs由如下方程得出R2,obs=[EL][LTOT]R2,bound+(1-[EL][LTOT])R2,free+[EL][LTOT](1-[EL][LTOT])24π2(δfree-δbound)2K-1---(6)]]>其中R2，結(jié)合與R2，游離分別是游離與結(jié)合狀態(tài)的橫向弛豫時間。最后一項為交換項，其中δ結(jié)合與δ游離分別是游離與結(jié)合狀態(tài)的同位素化學(xué)位移，并且1/K-1是配體結(jié)合到蛋白質(zhì)上的殘留時間。僅當(dāng)該試驗是使用長為2τ(其中τ＞＞1/K-1)進行時，方程(6)才是有效的。使用τ＜5/K-1進行的試驗使得交換項對于所觀測的橫向弛豫速度的影響降低(Z.Luz等，J.Chem.Phys.，39，366-370(1963)；和A.Allerhand等，H.S.J.Chem.Phys.，41，2115-2126(1964))。
因此，使用一個長2τ期進行篩選。之所以可以這樣做是因為異核1H-19F標量耦合下的演化在該模式的末端被重聚焦了。然而，該2τ期不應(yīng)非常長，以至于減少由參考分子的空間擴散導(dǎo)致的信號衰減(即，方程(4)的第一指數(shù)項)。
間諜分子以及對照分子的選擇表1給出了在三種不同商用化合物庫中含有氟原子的分子的頻率。該表中還包含在試驗中所經(jīng)常試驗的單氟代苯和三氟甲基苯這兩種子結(jié)構(gòu)的數(shù)目。大量包含氟原子的分子使得不需要依靠化學(xué)合成進行間諜分子和對照分子的選擇。
表1中的一個有趣特征在于在MDDR庫中存在大量的含氟分子。如圖5所示，對該庫內(nèi)的按時間順序的調(diào)查顯示，在過去20年間，所開發(fā)的包含至少一種氟原子的化合物的百分比增加了一倍。可以觀察到從1981-1985年間的10.9％穩(wěn)步增加到1996-2000年間的19.4％。氟原子已經(jīng)日益被用于先導(dǎo)化合物的優(yōu)化以改善其效力、物理化學(xué)性質(zhì)和對于酶作用的新陳代謝穩(wěn)定性的過程中。
在這兩種分子的選擇過程中應(yīng)特別注意其溶解性。氟原子的存在增加了化合物的親油性。不是非常容易溶于水溶液中的分子不適合用于篩選試驗，因為它們可以以一種非專一的方式與受體結(jié)合。因此，對于潛在分子和對照分子的質(zhì)子和氟波譜以及質(zhì)子WaterLOGSY波譜實在不存在蛋白質(zhì)的條件下，一般在高于篩選過程所使用的濃度2至4倍(即，100至200μM)的濃度下測試的。僅有那些根據(jù)NMR波譜是可溶解的并且在該濃度下不集結(jié)的分子被認為是用于篩選的參照和對照分子的潛在的化合物。
含有CF3基團的化合物含有CF3基團的參考化合物的優(yōu)點在于其具有較高的氟信號靈敏度。參考分子5-[1-甲基-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-5-基]-2-噻吩羧酸(1)和對照分子1-[5-(三氟甲基)-1，3，4-噻二唑-2-基]哌嗪(2)的典型的自旋回波19F波譜是在不同濃度的HAS的濃度下在采集期間試驗質(zhì)子去耦所記錄的，如圖6所示。與NMR試驗的結(jié)果一致的是，使用(2)進行的ITC測試并沒有發(fā)現(xiàn)任何與HAS結(jié)合的證據(jù)(將8μL、800μM的(2)注射到30μM HAS中僅觀測到擴散熱)。NMR試驗中所使用的兩種分子的濃度都僅為25μM。參考分子的低濃度避免了由于非特異性結(jié)合以及集聚所產(chǎn)生的問題。這些分子的缺點在于即便在結(jié)合狀態(tài)下也可以觀測到氟原子圍繞著該基團的C3軸的快速旋轉(zhuǎn)。這導(dǎo)致游離狀態(tài)和結(jié)合狀態(tài)的參考分子間的CF3信號的線寬的差異有限。
含有CF基團的化合物含有CF基團的化合物特別適合用于基于競爭結(jié)合的篩選試驗。19F-CSA可以非常大因此增加了方程(3)的參考分子的游離態(tài)與結(jié)合態(tài)的線寬的差異。例如芳族CF的CSA的范圍在單氟代苯的71ppm至六氟代苯的158ppm之間(H.Raber等，Chem.Phys.，26，123-130(1977))。此外，由于其“鄰位效應(yīng)”或氟原子直接參與了與蛋白質(zhì)的氫鍵，結(jié)合狀態(tài)的參考分子的19F-CSA可以增加。這兩個現(xiàn)象還將導(dǎo)致自由狀態(tài)和結(jié)合狀態(tài)的各向同性化學(xué)位移的巨大差別。對于弱親和性參考化合物，方程(6)的交換項可以在蛋白質(zhì)的存在下可以對參考化合物的線寬起到顯著的作用。氟信號通常與幾個質(zhì)子偶合而裂分，因此，為了改善其靈敏度，必需在采樣期間使用質(zhì)子去耦來記錄光譜。圖7顯示了使用質(zhì)子去耦的隨HSA濃度變化的參考分子2-羥基-3-氟苯甲酸(3)和對照分子(2)的代表性的自旋回波氟波譜。這些分子的一個缺點在于需要使用更高的濃度進行該試驗。圖7的波譜所使用的參考分子的濃度為50μM。
滴定和篩選試驗在選定了參考分子和對照分子之后，進行關(guān)于蛋白質(zhì)的滴定，其結(jié)果如圖6和圖7所示。兩個氟信號的強度比被繪制成關(guān)于蛋白質(zhì)結(jié)合參考分子的曲線，如圖8的實施例所述。使用通過其他技術(shù)(例如，ITC或熒光光譜學(xué))得到的解離結(jié)合常數(shù)計算結(jié)合化合物的份數(shù)，如C.Dalvit等，J.Am.Chem.Soc.，124，7702-7709(2002)；和C.Dalvit等，Comb.Chem.HTS，5，645-650(2002)所述。這些技術(shù)還提供了對照分子的結(jié)合位點數(shù)，該結(jié)合位點數(shù)是競爭結(jié)合試驗中一個非常重要的參數(shù)。ITC測試提供了一個n值，該n值對于(1)而言接近4、對于(3)而言接近1。因此，盡管分子(1)可在對試驗結(jié)果的解析中受到一定限制的條件下被用于篩選試驗，它不能被用于導(dǎo)出NMR采樣的結(jié)合參數(shù)。分子(3)代表了一種合適的參考分子，因為它在這些試驗所使用的濃度下與HSA僅具有一個結(jié)合位點。根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)，一種阿司匹林類似物，其公認的結(jié)合位點將是Sudlow位點I(位于子域IIA)(T.Peters，Jr.，All about Albumin Biochemistry，Genetics，andMedical Applications，Academic Press，San Diego，U.S.A.1996)所述。在圖8中，使用兩個通過實驗誤差測定的KD極限值提取對于蛋白質(zhì)結(jié)合參考分子(3)的部分的兩個不同的值。在這種具體情形下，ITC所導(dǎo)出的(3)的KD值位41±3.3μM，因此這兩個KD的極限值分別為37.7和44.3。
應(yīng)當(dāng)指出的是還可以在僅存在參考分子的條件下進行NMR試驗(C.Dalvit等，Comb.Chem.HTS，5，605-611(2002)以及上述實施例(I))。然而，在這種情況下，所記錄的兩個試驗必須是一個不帶CPMG序列(即2nτ＝0)以及另一個帶有長為2nτ的CPMG序列。然后將從這兩個波譜中所得出的信號強度繪制成關(guān)于結(jié)合參考分子份數(shù)的曲線。
然后利用圖8來設(shè)定篩選所需的條件。圖9顯示了對照含有(3)作為參考分子的HSA進行的篩選過程。對于篩選，所選擇的參考分子的總的自旋回波周期(2nτ)接近零。已知所存在的5-CH3的D，L色氨酸和蔗糖的混合物(左起第三個波譜)是非結(jié)合劑，不會改變間諜分子的波譜。相反，丙酮芐羥香豆素(warfarin)衍生物4-羥基-3-[1-(對碘苯基)-3-氧代丁基]香豆素(4)的存在(右邊的波譜)導(dǎo)致(3)的信號的再次出現(xiàn)。根據(jù)圖8的圖形，這是由于參考化合物從蛋白質(zhì)上被置換下來所導(dǎo)致的。用于計算NMR采樣的結(jié)合常數(shù)的置換程度如表2所示(C.Dalvit等，J.Am.Chem.Soc.，124，7702-7709(2002)；和C.Dalvit等，Comb.Chem.HTS，5，645-650(2002))。

全部濃度和結(jié)合常數(shù)的值都是以μM表示的。KD是由ITC所導(dǎo)出的(3)的結(jié)合常數(shù)，KIfluo是由熒光導(dǎo)出的(4)的結(jié)合常數(shù)。[I]，[LTOT]和[ETOT]分別是(4)，(3)和HSA的濃度KINMR是由NMR測試所導(dǎo)出的(4)的結(jié)合常數(shù)。
為了導(dǎo)出一個可靠的結(jié)合常數(shù)值，還必需測試其質(zhì)子波譜。這是通過簡單比較參考分子信號的積分來計算NMR采樣的濃度所必需的，其中濃度可從NMR采樣的信號的積分得到。由NMR導(dǎo)出的KD值優(yōu)選與由完全滴定熒光測試所導(dǎo)出的值進行比較。自從其首次被應(yīng)用以來(C.Dalvit等，J.Am.Chem.Soc.，124，7702-7709(2002)；和C.Dalvit等，Comb.Chem.HTS，5，645-650(2002))，就已經(jīng)使用這種方法計算了數(shù)百種化合物的結(jié)合常數(shù)。對于純粹競爭結(jié)合機制和單一結(jié)合部位而言，由單點NMR所導(dǎo)出的結(jié)合常數(shù)與由完全滴定熒光和ITC導(dǎo)出的結(jié)合常數(shù)之間完全吻合。該NMR方法還能夠測定高親和性結(jié)合常數(shù)，而該常數(shù)是不易由其它NMR方法得到的。
檢測限由于弱結(jié)合親和性參考分子的巨大的CSA以及巨大的交換作用，因此有可能顯著降低篩選需要蛋白質(zhì)的濃度?？梢詮膱D10理解這一點，其中篩選是在濃度僅為150nM的HSA的存在下進行的。盡管[LTOT]/[ETOT]的比值巨大(＝330)而[EL]/[LTOT]的比值小(＝0.00165，使用41μM的KD)，有可能觀察到小部分的結(jié)合配體的效果，并且在這種低蛋白濃度下進行篩選。這可能是一個幸運的情形。根據(jù)固態(tài)NMR試驗，在氟原子鄰位的OH基團會導(dǎo)致組分中垂直于芳環(huán)的19F化學(xué)位移張量的50ppm的位移，并導(dǎo)致巨大的19F-CSA(H.Raber等，Chem.Phys.，26，123-130(1977))。然而，使用其他的蛋白質(zhì)以及使用包含一個對氟苯甲基殘基的參考分子也可以觀測到類似的情形(數(shù)據(jù)未示出)。因此，交換項可能所觀測的自旋-自旋弛豫有顯著的影響。圖10所記錄的波譜使用了128次掃描且總的測量時間為10分鐘。用于優(yōu)化19F探測的冷凍探針技術(shù)的使用能夠進一步地改善其探測范圍。然后可以使用濃度低至50至100nM的蛋白質(zhì)濃度。這將能夠?qū)φ漳切┎荒芤暂^高量表達的蛋白質(zhì)(例如，膜蛋白質(zhì))篩選大量的化學(xué)混合物。可以使用冷凍探針技術(shù)非?？焖俚赜涗浄ㄗV。一個保守估計的使用冷凍探針技術(shù)的雙倍靈敏度改善將使探測時間減少4倍。因此，僅在150s的時間內(nèi)記錄圖10的波譜，從而提高了篩選過程的處理量。應(yīng)當(dāng)指出的是在氟檢測試驗中并不存在質(zhì)子檢測試驗中所遇到的輻射衰減問題，因為間諜和對照分子的濃度低。
在質(zhì)子化的溶劑和洗滌劑的存在下的篩選基于19F配體的競爭結(jié)合實驗的一個特別的優(yōu)點是可以甚至在質(zhì)子化的溶劑、緩沖劑或洗滌劑的存在下進行篩選。在100mM HEPES和1％甘油的存在下的HSA的質(zhì)子波譜如圖11所示。緩沖劑和甘油的強烈的信號屏蔽了進行篩選所需的參照和對照分子的弱信號。而在19F檢測試驗中就不存在這些問題。
因此可能即便在這些困難的試驗條件下進行如圖11所示的篩選。由于這些特性，基于氟配體的競爭結(jié)合篩選實驗對于對照溶于SDS(十二烷基磺酸鈉)或其他的洗滌劑的膜蛋白質(zhì)進行的分子的篩選是特別有利的。一旦一種適宜的參照分子被識別了，該基于19F配體的競爭結(jié)合NMR篩選將提供一個可靠的采樣。與膜簡單結(jié)合的分子和洗滌劑以及那些在不同測試中表現(xiàn)為潛在配體的分子在此處所示的19F試驗中將不會被檢測到。僅有與參考分子競爭結(jié)合的分子才會識別出來。最后，該試驗還可被用于植物和真菌提取物的篩選，以及用于活細胞內(nèi)部分子的篩選。
結(jié)論因此，使用一個包含19F原子的弱親并結(jié)合配體結(jié)合競爭結(jié)合實驗允許對照蛋白質(zhì)、DNA或RNA片段快速篩選大量的化學(xué)混合物。此外，該方法能夠?qū)MR采樣的結(jié)合常數(shù)進行直接測定。
試驗19F競爭結(jié)合HTS試驗不存在重疊問題，并且由于19F核的高靈敏度(是1H靈敏度的0.83倍)，因此可能快速篩選巨大的化學(xué)品或天然產(chǎn)物提取物庫。此外，可以在高濃度的非氘代洗滌劑的存在下進行蛋白質(zhì)溶液的試驗，因此，能夠試驗?zāi)さ鞍踪|(zhì)進行HTS。此外，由于未使用所篩選的實際分子的共振，僅需要間諜分子和對照分子含有氟殘基。因此，基于氟的競爭篩選在制藥工業(yè)中應(yīng)具有廣泛的用途，并將擴展NMR篩選對于藥物發(fā)現(xiàn)方法的影響。
該方法是一種快速方法并且僅需要有限量的蛋白質(zhì)，因此相對于高通量篩選中所試驗的其他的非NMR技術(shù)，該方法更有效。此外，該方法在單一試驗內(nèi)提供了一個有意義的NMR采樣的結(jié)合常數(shù)值。
由于其不存在重疊現(xiàn)象，因此能夠用于篩選來源于組合化學(xué)、藥物化學(xué)或天然產(chǎn)物提取物的大量的化學(xué)混合物。還可以使用該方法進行對照溶于不同洗滌劑的膜蛋白質(zhì)的篩選。最后，預(yù)期這些試驗可以擴展至一個對照位于活細胞內(nèi)部的受體的分子的篩選。
這里所引用的專利、專利文獻以及出版物的全部公開內(nèi)容通過全文引用的方式被單獨包括在本申請中。在不背離本發(fā)明的精神與范圍的前提下，對本發(fā)明之方法與組合物之各修改以及改變對本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。應(yīng)了解，本發(fā)明不受這里所述的具體實施方案和實施例的過度限制。所給出的這些實施例和具體實施方案僅是對本發(fā)明范圍的一種舉例說明，本發(fā)明的范圍僅受到如下所述的權(quán)利要求的限制。
權(quán)利要求
1.一種識別靶分子的配體的方法，該方法包括提供與靶分子相互作用的19F-標記參考化合物；在靶分子的存在下采集19F-標記參考化合物的1D19F核磁共振波譜；提供包含至少一種測試化合物的測試樣品；在各測試樣品和靶分子的存在下采集19F-標記參考化合物的1D19F核磁共振波譜；比較在靶分子的存在下該19F-標記參考化合物的波譜與在各測試樣品和靶分子的存在下該19F-標記參考化合物的波譜，以測定一個或多個該19F-標記參考化合物共振的變化；和識別至少一種與靶分子相互作用的測試化合物，其中該測試化合物置換19F-標記參考化合物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中測試化合物具有至少與參考化合物一樣緊密的結(jié)合親和力。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中一個或多個參考化合物共振中的變化包括在至少一個參考共振中的信號強度的增加。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中識別至少一種測試化合物包括在各靶分子的存在下記錄19F-標記參考化合物的單獨的1D19F核磁共振波譜。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，該方法進一步包括在不同的19F-標記參考化合物的濃度下，在靶分子的存在下，采集參考化合物的1D19F核磁共振波譜；和測定測試化合物的解離常數(shù)。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，該方法進一步包括在不同濃度的靶分子的存在下，采集19F-標記參考化合物的1D19F核磁共振波譜；和測定測試化合物的解離常數(shù)。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中在采集在用于比較步驟的在靶分子的存在下的19F-標記參考化合物的核磁共振波譜之前，該方法包括在不同濃度的靶分子或在不同濃度的19F-標記參考化合物的存在下采集19F-標記參考化合物的1D19F核磁共振波譜；和測定識別至少一種與靶分子相互作用的測試化合物的最佳實驗條件。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中靶分子是大分子。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中大分子是多肽或多核苷酸。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中大分子是蛋白質(zhì)。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該參考化合物在微摩爾范圍內(nèi)的結(jié)合親和力下與靶分子結(jié)合。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中參考化合物的結(jié)合親和力是通過等溫滴定量熱法或熒光光譜法測定的。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，該方法進一步包括一個識別參考化合物的步驟，該步驟包括在不存在靶分子的條件下，采集潛在參考化合物的WaterLOGSY核磁共振波譜；在靶分子的存在下采集潛在參考化合物的WaterLOGSY核磁共振波譜；和比較WaterLOGSY波譜以識別潛在參考化合物是否與靶分子相互作用。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中測試樣品包括兩種或多種測試化合物的混合物。
15.如權(quán)利要求14的方法，該方法進一步包括在各測試化合物和靶分子的存在下采集19F-標記參考化合物的1D19F核磁共振波譜；和比較在靶分子的存在下該參考化合物的波譜與在各測試化合物和靶分子的存在下該參考化合物的波譜，以測定所選擇的19F-標記參考化合物共振的變化。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，其中測試化合物具有比參考化合物更緊密的結(jié)合親和力。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其中提供19F-標記參考化合物包括提供19F-標記參考化合物和具有規(guī)定線寬、振幅和頻率的ERETIC信號；在靶分子的存在下采集19F-標記參考化合物的1D19F核磁共振波譜包括在靶分子的存在下采集帶有ERETIC信號的19F-標記參考化合物的波譜；和在各測試樣品和靶分子的存在下采集19F-標記參考化合物的1D19F核磁共振波譜包括在各測試樣品和靶分子的存在下采集帶有ERETIC信號的19F-標記參考化合物的波譜。
18.如權(quán)利要求1所述的方法，其中提供19F-標記參考化合物包括提供19F-標記參考化合物和19F-標記無相互作用的化合物；在靶分子的存在下采集19F-標記參考化合物的1D19F核磁共振波譜包括在靶分子的存在下采集19F-標記參考化合物和19F-標記無相互作用的化合物的波譜；和在各測試樣品和靶分子的存在下采集19F-標記參考化合物的1D19F核磁共振波譜包括在各測試樣品和靶分子的存在下采集19F-標記參考化合物和19F-標記無相互作用的化合物的波譜。
19.一種篩選化合物以識別靶分子的配體的方法，該方法包括采集至少一種測試化合物的第一1D19F核磁共振波譜；將至少一種測試化合物暴露于靶分子；采集至少一種已經(jīng)暴露于靶分子的測試化合物的第二1D19F核磁共振波譜；和比較該第一和第二波譜以測定一個或多個共振的變化，并識別至少一種與靶分子相互作用的測試化合物。
20.如權(quán)利要求1所述的方法，其中提供測試樣品包括提供多個測試樣品，各測試樣品包括至少一種測試化合物。
全文摘要
通過使用
文檔編號G01N33/53GK1668757SQ03817273
公開日2005年9月14日 申請日期2003年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月5日
發(fā)明者C·達爾維特, B·J·斯托克曼, M·弗洛科, M·維羅尼西 申請人:法瑪西雅厄普約翰有限責(zé)任公司