專利名稱：離子通道的高通量篩選的制作方法
離子通道的高通量篩選
背景技術(shù)：
離子通道是存在于每個(gè)生物體的每個(gè)細(xì)胞中的膜蛋白。該通道控制離子流入和流出細(xì)胞，從而在細(xì)胞機(jī)能中起到關(guān)鍵作用。毫不驚奇地是，離子通道構(gòu)成一類非常重要的藥物靶標(biāo)。為了有效研發(fā)新藥物，研究人員需要可容許通過化合物(候選藥物)對離子通道的作用來進(jìn)行高通量篩選化合物(候選藥物)的方法和設(shè)備。該藥物篩選方法和設(shè)備需要用于測量離子通道活性的裝置和向離子通道施用化合物的裝置。通常使用所謂的膜片鉗技術(shù)研究離子通道。該技術(shù)包括測量單個(gè)細(xì)胞的電信號(電流和/或電壓)。將所述細(xì)胞布置在裝置中，使得電信號的大小與離子通道的狀態(tài)直接相關(guān)，特別是它們允許通過的電流量。因此，該技術(shù)允許對活細(xì)胞、細(xì)胞膜和人造膜中的離子通道事件進(jìn)行直接的電測量。 被廣泛認(rèn)可的是，膜片鉗的全細(xì)胞和穿孔膜片配置提供了用于藥物篩選的測量離子通道活性的最佳方法。在這些方法中，通過感應(yīng)電流放大器直接且高分辨率地測量出流過離子通道的離子電流。遺憾的是，目前的膜片鉗設(shè)備存在許多缺點(diǎn)，特別是對于高通量離子通道篩選，尤其是對于配體門控離子通道而言更是如此。

發(fā)明內(nèi)容
本文中公開的一些實(shí)施方案涉及儀器、多孔板(multi-well plate)以及相關(guān)的孔設(shè)計(jì)，從而允許對離子通道和離子轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)行高通量平行檢驗(yàn)。多孔板的每個(gè)孔包括底部區(qū)域，所述底部區(qū)域的大小和形狀被制成能夠同時(shí)容納傳感電極和移液器，所述移液器用于輸送例如測試化合物、洗滌液、以及任選的配體(用于配體門控離子通道檢驗(yàn))。所述多孔板可與具有移液器頭部和電極板的儀器相連，從而提供各種優(yōu)點(diǎn)。首先，該布置允許在通過移液器施加配體之后立刻測量電流，從而有利于分析配體門控離子通道。其次，允許相對復(fù)雜的檢測方案，其中單細(xì)胞(及其相關(guān)細(xì)胞)可用于對離子通道(包括配體門控離子通道)既進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn)又進(jìn)行檢測實(shí)驗(yàn)。此外，某些孔設(shè)計(jì)具有特定的輪廓特征，從而有利于細(xì)胞和移液器提供的液體之間的液態(tài)接觸。這改善了用緩沖液或其它洗滌液洗滌孔和細(xì)胞的操作，從而允許測試細(xì)胞順次暴露于各種試劑或其它刺激。通常，該設(shè)計(jì)允許對單個(gè)孔中的同一細(xì)胞(或多個(gè)細(xì)胞)進(jìn)行對照和檢測實(shí)驗(yàn)。這對于配體門控離子通道而言是特別有益的。在各種實(shí)施方案中，組裝的設(shè)備包括在每個(gè)孔的底部的一個(gè)或多個(gè)孔眼、孔下方的氣室(plenum)、被封接至所述孔眼的具有多離子通道的細(xì)胞、在孔內(nèi)位于細(xì)胞旁邊的傳感電極、以及細(xì)胞上方的移液器，最后是與傳感電極相連的電子設(shè)備。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括多個(gè)孔的多孔板，其中所述多孔板的至少一個(gè)孔具有這樣的底部，所述底部的特征在于(a)細(xì)胞腔室，所述細(xì)胞腔室的大小和形狀被制成能夠容納移液器吸嘴(tip)，以及(b)電極袋，所述電極袋的大小和形狀被制成能夠容納傳感電極。在某些情況下，細(xì)胞腔室和電極袋被布置為允許同時(shí)容納所述移液器吸嘴和所述傳感電極。另外，孔的底部可提供有位于電極袋和細(xì)胞腔室之間的液體連接部。通常，所述細(xì)胞腔室在該細(xì)胞腔室的底部表面中包括一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞封接孔眼(cell sealingaperture)ο在各種實(shí)施方案中，所述細(xì)胞腔室包括移液器導(dǎo)流件，移液器導(dǎo)流件可具有與所述移液器吸嘴配合的形狀和大小。例如，所述移液器導(dǎo)流件可在垂直方向上為錐形。在更具體的方案中，移液器導(dǎo)流件的形狀和大小防止當(dāng)移液器插入導(dǎo)流件時(shí)，從移液器吸嘴分配出的液體的大部分向上流動而流出移液器導(dǎo)流件。在該設(shè)計(jì)中，以及當(dāng)所述孔包括位于所述細(xì)胞腔室和所述電極袋之間的液體連接部時(shí)，從移液器吸嘴分配出的液體首先流入所述細(xì)胞腔室，然后在流出而進(jìn)入所述孔的上部區(qū)域之前穿過所述電極袋。在采用電極板的實(shí)施方案中(將在下文中進(jìn)行更詳細(xì)的描述)，移液器導(dǎo)流件可與電極板中的通孔大體上同軸。電極袋的尺寸可依賴于各種隨應(yīng)用而定的特征，包括孔的大小、多孔板中孔的數(shù)目、電極的大小、細(xì)胞腔室與電極之間期望的液體相連、等等。在具體實(shí)施方案中，電極袋在垂直方向上的高度介于約O. 2和2mm之間。在另一具體實(shí)施方案中，電極袋和細(xì)胞腔室之間的中心至中心的距離介于約I和5mm之間。 類似地，細(xì)胞腔室的尺寸可依賴于隨應(yīng)用而定的特征，包括針對電極袋所列出的那些特征；以及某些隨移液器而定的特征，例如移液器吸嘴(例如，移液器的錐形部分)的大小和形狀以及與移液器頭部相關(guān)的傾斜度。在某些具體實(shí)施方案中，細(xì)胞腔室在垂直方向上的高度介于約O. 2和2mm之間。另外，細(xì)胞腔室的直徑或?qū)挾瓤山橛诩sO. 5和2mm之間。在某些具體實(shí)施方案中，細(xì)胞腔室的大小和形狀使得當(dāng)移液器吸嘴與細(xì)胞腔室接合時(shí)，移液器吸嘴距離細(xì)胞腔室底部在約O. 5mm或更近的范圍內(nèi)。本發(fā)明的另一方面涉及膜片鉗裝置，其特征可在于(a)電極板，該電極板包括多個(gè)傳感電極、以及多個(gè)相關(guān)聯(lián)的通孔，該通孔的大小和位置被制成能容納從移液器頭部伸出的移液器吸嘴；以及(b)多孔板，該多孔板包括多個(gè)孔，每個(gè)孔被布置成與所述電極板的一個(gè)電極和一個(gè)通孔對準(zhǔn)。另外，所述多孔板的至少一個(gè)孔包括大小和形狀被制成能夠容納其移液器吸嘴的細(xì)胞腔室。通常，多孔板的每個(gè)孔還包括用于封接該孔中的膜片的孔眼。另外，電極板的傳感電極通常被布置為在SBS柔性板的每個(gè)孔中提供一個(gè)電極，所述SB S柔性板具有96、384或1536個(gè)孔。通常，電極板包括多個(gè)觸點(diǎn)，所述觸點(diǎn)用于在傳感電極和所連的傳感和記錄電子設(shè)備之間提供電連接。在各種實(shí)施方案中，所述多孔板的所述至少一個(gè)孔包括電極袋，所述電極袋的大小和形狀被制成能容納電極板的傳感電極。如同上述的第一方面那樣，所述細(xì)胞腔室和所述電極袋可以被布置為允許同時(shí)容納所述移液器吸嘴和所述傳感電極。另外，如上所述，所述細(xì)胞腔室可包括移液器導(dǎo)流件，該移液器導(dǎo)流件具有與伸入所述至少一個(gè)孔中的移液器吸嘴配合的形狀和大小。從而，在某些實(shí)施方案中，移液器導(dǎo)流件可與電極板中的對應(yīng)通孔大體上同軸。本發(fā)明的另一方面涉及實(shí)施膜片鉗檢驗(yàn)的方法，所述方法的特征在于以下操作(a)提供細(xì)胞，該細(xì)胞被封接至孔的底部上的孔眼；(b)將所述細(xì)胞暴露于第一溶液；(C)在所述細(xì)胞暴露于所述第一溶液的同時(shí)或之后，測量所述細(xì)胞的第一電信號；(d)從插入所述孔中的移液器向所述孔的底部輸送新鮮的溶液；(e)在所述孔內(nèi)升高而不移除所述移液器，并且從所述孔的上部區(qū)域?qū)⒁后w吸入該移液器中；以及(f)將吸入所述移液器的所述液體從所述孔中移除。在各種實(shí)施方案中，該方法還包括在(f)中移除所述液體后，將所述細(xì)胞暴露于第二溶液，并且在所述細(xì)胞暴露于所述第二溶液的同時(shí)或之后，測量該細(xì)胞的第二電信號。在各種實(shí)施方案中，所述第一電信號提供對照測量，并且所述第二電信號提供檢測測量。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，(C)中測量第一電信號是在將所述第一溶液引入所述孔中之后立刻進(jìn)行的。另外，測量所述第一電信號可包括檢測來自于所述孔中的傳感電極的電流。上述方法的實(shí)施方案可采用上述的板和裝置來實(shí)施。例如，該方法中所用的孔可具有上述的限定細(xì)胞腔室的底部結(jié)構(gòu)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，細(xì)胞腔室的大小和形狀包括上述的一種或多種特征，包括涉及移液器導(dǎo)流件的特征。該方法的實(shí)施方案也可任選地采用如上所述的具有電極袋的孔。在實(shí)施本文所述的方法時(shí)，如上所述的尺寸、液體連接布置和其他特征都是可用的。在另一方面，本發(fā)明涉及在配體門控離子通道上進(jìn)行膜片鉗檢驗(yàn)的方法。該方法的特征可在于以下操作(a)將含有至少一個(gè)配體門控離子通道的膜片封接至檢驗(yàn)孔的孔 眼中；(b)將配體輸送至所述孔，并且測量由所述配體門控離子通道暴露于所述配體而導(dǎo)致的電信號；(C)從插入該孔中的移液器向該孔的底部移入新鮮的溶液，從而將膜片浸入所述新鮮的溶液中；(d)將移液器移至該孔中的不同位置，并從該孔中移除含有配體的舊溶液；(e)向所述膜片施加刺激；以及(f)將所述配體輸送至所述孔中，并在施加刺激后測量由所述配體門控離子通道暴露于所述配體而導(dǎo)致的電信號。在多孔板的通常操作中，該方法包括在多孔板的多個(gè)孔中對多個(gè)膜片重復(fù)進(jìn)行(a)中的封接膜片的操作。在各種實(shí)施方案中，(b)包括在向孔中輸送配體后立刻測量電信號。另外，在(C)和(d)完成后并且在進(jìn)行其它操作之前，可容許配體門控離子通道再次敏感化。通常，(a)中的刺激包括施用藥學(xué)活性化合物或生物材料。可采用上述的板和裝置實(shí)施所披露的LGIC檢驗(yàn)。如同其它方法的實(shí)施方案那樣，孔可具有上述的限定細(xì)胞腔室和/或電極袋的底部結(jié)構(gòu)。另外，細(xì)胞腔室、電極袋和/或移液器導(dǎo)流件的大小和形狀(包括所述的尺寸)也可以如上文所詳述的那樣。以下將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的這些特征和其它特征及優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行更詳細(xì)的描述。


圖IA和IB為示出了平行進(jìn)行多個(gè)膜片鉗實(shí)驗(yàn)的多孔裝置的示意圖。圖2示出了典型的配體門控離子通道的反應(yīng)曲線。圖3示出了用于進(jìn)行所要保護(hù)的高通量膜片檢驗(yàn)的儀器，該儀器包括移液器頭部和多孔區(qū)站。圖4A示出了多孔膜片鉗區(qū)的分解圖，其包括氣室、膜片板、電極板和移液器頭部。圖4B為根據(jù)某些實(shí)施方案的膜片板401的頂視圖。圖4C至4E示出了適用于圖4B所示膜片板的電極板的實(shí)施方案。圖5A示出了膜片板中的單個(gè)孔的對角線橫截面。圖5B示出了圖5A中的孔，但是移液器升高至該孔的中間高度，以從該孔的上部區(qū)域吸出溶液。圖5C為具有細(xì)胞腔室和電極袋的孔的頂視圖。
圖6A為平行膜片鉗方法的高級流程圖。圖6B為示出了采用電壓門控離子通道實(shí)施檢驗(yàn)的流程圖。圖6C為示出了采用配體門控離子通道實(shí)施檢驗(yàn)的流程圖。圖6D為示出了實(shí)施孔洗滌過程的流程圖。
具體實(shí)施例方式離子通道通常包括兩個(gè)部分孔道(通道)以及調(diào)節(jié)所述孔道的電導(dǎo)的開關(guān)。離子通道是被動元件，其一旦被打開，離子便沿著當(dāng)前的電化學(xué)梯度的方向流動。離子轉(zhuǎn)運(yùn)體的相似之處在于它們參與到運(yùn)輸離子穿過細(xì)胞膜的過程中，然而它們不同于離子通道之處 在于其發(fā)揮功能需要能量，并且它們傾向于對抗已建立的電化學(xué)梯度而主動泵送。為了方便起見，本文中使用術(shù)語“離子通道”既表示離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，也表示離子通道。存在兩種主要類型的離子通道電壓門控離子通道(VGIC)和配體門控離子通道(LGIC)0 VGIC是通過改變跨細(xì)胞膜的電壓而活化的，而LGIC是通過化學(xué)化合物(配體)對通道蛋白的作用而活化的。研究LGIC需要位于膜片細(xì)胞附近的細(xì)胞外液迅速地交換。以下將結(jié)合主要部件來描述研究離子通道所用的、處于操作性配置狀態(tài)的儀器的例子。這些部件包括多個(gè)孔(即，不止一個(gè)孔)，每個(gè)孔具有被封接至孔眼的細(xì)胞；為所述的孔輸送和移除液體的移液器；以及用于傳感所述孔中的電信號的電極。在下面更具體的實(shí)施方案中，將從以下方面來描述該儀器移液器頭部、包括多個(gè)孔的膜片板、分開的電極板(包括多個(gè)電極，所述電極被布置為允許在膜片板的每個(gè)孔中獨(dú)立地傳感)。本發(fā)明的膜片板和電極板不局限于圖中所示的具體結(jié)構(gòu)。美國專利No. 6，488，829和PCT公開PCT/US2005/032044中示出了所披露的實(shí)施方案的某些相關(guān)特征，通過引用的方式將其描述膜片鉗儀器的內(nèi)容全部并入本文。圖IA示意性示出了多孔膜片鉗裝置的各種特征，該多孔膜片鉗裝置允許對多個(gè)細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)。在所示裝置中，示出了孔7a，以及鄰近的孔7b和7c的一部分。每個(gè)孔由垂直結(jié)構(gòu)元件19和底部水平結(jié)構(gòu)元件20限定。底部水平元件20包括許多孔眼，包括孔7a中的孔眼9a和孔7c中的孔眼9c。在膜片鉗實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞封接至各個(gè)孔眼，所示孔眼允許與細(xì)胞內(nèi)部離子耦聯(lián)。在示出的例子中，細(xì)胞Ia被封接至孔眼9a，細(xì)胞Ic被封接至孔眼9c。在底部水平元件20的下方具有氣室11，氣室11被設(shè)計(jì)為在膜片鉗實(shí)驗(yàn)過程中保留液體(例如細(xì)胞內(nèi)液)。氣室11在頂部以水平元件20為界，在底部以平行水平元件32為界，該平行水平元件32包括一個(gè)或多個(gè)電接地15的參比電極(例如參比電極13)。細(xì)胞Ia和Ic各自包括多個(gè)離子通道17，在該裝置的各個(gè)孔中評價(jià)離子通道對刺激的反應(yīng)。典型的膜片鉗檢驗(yàn)包括感測與流過孔中的不同細(xì)胞的電流(更具體而言為流過細(xì)胞中的離子通道的電流)相關(guān)的信號，以及使膜片接觸氣室。在某些實(shí)施方案中，膜片鉗實(shí)驗(yàn)為穿孔膜片實(shí)驗(yàn)。在全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)的這種變型中，封接至細(xì)胞孔眼的膜片被穿孔，或是使其具有可透性，從而降低孔眼中細(xì)胞膜片的電阻。當(dāng)然，該透化作用不影響離子通道的傳導(dǎo)性，但是降低了孔眼中膜的脂質(zhì)部分的電阻?？梢砸远喾N方式來誘導(dǎo)該膜片的電透化作用。在一些實(shí)施方案中，可通過使膜片接觸穿孔劑來實(shí)現(xiàn)。例如，可通過向氣室中的溶液提供這樣的試劑來實(shí)現(xiàn)。合適的穿孔劑的例子包括某些親脂性化合物或抗生素，例如兩性霉素B、制霉菌素或短桿菌肽。該類化學(xué)品是通過在細(xì)胞膜中形成一價(jià)離子(例如氯離子)可透過的化學(xué)孔道而起作用的。由于氯離子是針對常用的Ag/AgCl電極的帶電離子，所以這些化合物產(chǎn)生了通向細(xì)胞內(nèi)部的低電阻電通路。在一些實(shí)施方案中，施加相對較高的電壓將細(xì)胞膜穿孔并且產(chǎn)生類似的結(jié)果。在這樣的情況下，通過施加足夠強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間的電壓脈沖來實(shí)現(xiàn)透化作用，使得孔眼內(nèi)封接的膜發(fā)生物理性破裂。這通常被稱為電壓脈沖刺激(zapping)。應(yīng)該理解，本發(fā)明不限于穿孔膜片實(shí)施方案。也可使用其它類型的膜片鉗檢驗(yàn)，例如使膜片破裂的全細(xì)胞型。在許多檢驗(yàn)中，評價(jià)每種刺激對離子通道17的離子電流通過能力的影響。該電流被傳感電極(例如孔7a中的傳感電極2a，孔7b中的傳感電極2b)感應(yīng)到。這些電極通常為銀/氯化銀電極，該電極響應(yīng)于檢驗(yàn)溶液中的氯離子的可逆交換，為傳感電路提供電連接。借助于參比電極13 (可為第二 Ag/AgCl電極)，使測量電路完整。盡管不是必需的，但是每個(gè)傳感電極通常具有與其自己關(guān)聯(lián)的傳感電子元件。然而，在一些情況下，多個(gè)電極(通常在多個(gè)孔中)共用傳感電子元件。如圖所示，傳感電子元件可包括統(tǒng)一由附圖標(biāo)記21表示的各種元件。這些元件包括高阻抗運(yùn)算放大器23和數(shù)據(jù)記錄系統(tǒng)25，其中高阻抗運(yùn)算放大器23被配置為用于感測電路中的電流，數(shù)據(jù)記錄系統(tǒng)25與放大器連接，用于記錄和任選地分析來自于孔的電信號?？籽?和細(xì)胞膜之間的高電阻封接可以使放大器記錄的電流以流過細(xì)胞膜的離子為主，而不是以圍繞孔眼直接流入孔溶液中的離子為主。設(shè)計(jì)或配置電壓控制器27用于在孔電極2和參比電極13之間施加外部電壓，從而對細(xì)胞的跨膜電壓電位提供控制。如圖IA所示，每個(gè)孔包括單獨(dú)的移液器，例如孔7a中布置的移液器3a和孔7c中布置的移液器3c。在膜片鉗實(shí)驗(yàn)過程中的任意給定時(shí)間，移液器可容納適用于當(dāng)前檢驗(yàn)階段的特定液體。在某些階段，移液器用于向其對應(yīng)的孔輸送液體，而在檢驗(yàn)的其它階段，移液器用于從其對應(yīng)的孔移除液體。在圖IA中，用附圖標(biāo)記5表示移液器中的液體移液器3a中為5a,移液器3c中為5c。每個(gè)孔的底部包括內(nèi)部結(jié)構(gòu)元件，例如孔7a中示出的元件31，其用于至少部分地將所述孔的移液器部分與所述孔的電極部分分開。如下文中更詳細(xì)解釋的那樣，這種結(jié)構(gòu)可用于在孔的不同部分中限定出分離的腔室或袋。各個(gè)孔中的移液器與其相關(guān)的細(xì)胞和電極之間良好的液體交換允許在檢驗(yàn)期間的任何時(shí)間點(diǎn)在給定孔中同時(shí)插入移液器和電極。該設(shè)計(jì)也有利于在研究配體門控離子通道時(shí)獲取數(shù)據(jù)。圖IB示出了類似于圖IA所示的實(shí)施方案，不同之處在于每個(gè)孔包括多個(gè)孔眼例如孔7a中的孔眼9a、9a’和9a”。如圖所示，每個(gè)孔眼被定位成能夠用獨(dú)立的細(xì)胞形成密封。由于該設(shè)計(jì)同時(shí)考慮到了單項(xiàng)刺激對平行實(shí)驗(yàn)中多個(gè)不同細(xì)胞的作用，所以采用該設(shè)計(jì)的實(shí)施方案被稱為“群體膜片鉗”或“平行膜片鉗”(PPC)。在該實(shí)施方案中，單個(gè)孔支持著多個(gè)細(xì)胞，它們對信號的貢獻(xiàn)被統(tǒng)一感測。該設(shè)計(jì)可以提供改善的數(shù)據(jù)，這是由于其將多個(gè)細(xì)胞的貢獻(xiàn)加以平均，而其中任意一個(gè)細(xì)胞可能與正常細(xì)胞表現(xiàn)大不相同。細(xì)胞與細(xì)胞之間的差異通常很顯著；各個(gè)細(xì)胞對特定刺激的反應(yīng)通常會表現(xiàn)出極大的不同。2005年9月9日提交的美國專利申請No. 11/222，576 (也可參見PCT公開PCT/US2005/032044)提供了 PPC檢驗(yàn)設(shè)計(jì)的更多細(xì)節(jié)，通過引用的方式將其對PPC技術(shù)的討論部分全部并入本文中。 應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于研究細(xì)胞膜中的離子通道。相反，可供考慮的膜例如可選自以下種類中的任意一種或多種細(xì)胞、囊泡、細(xì)胞器、細(xì)胞膜碎片和合成膜，其中的任意一者包括一個(gè)或多個(gè)離子通道。在某些實(shí)施方案中，膜樣品可為大體球形的。膜樣品的位于隔板孔眼外的部分可大體上為原樣的。應(yīng)當(dāng)理解，在單一一個(gè)孔中同時(shí)存在傳感電極和移液器，這為檢驗(yàn)方案提供了不同的選擇，特別是對于適用于測量藥物對配體門控離子通道的效果的方案來說更是如此。圖2示出了典型的LGIC的反應(yīng)曲線。在該圖中，以相同的時(shí)間軸(橫坐標(biāo))繪制出配體濃度和通過離子通道的瞬時(shí)離子電流。配體門控離子通道通常在非常短的時(shí)間段內(nèi)對施加的配體作出反應(yīng)，該時(shí)間段通常小于I秒。非常慢地起作用的配體門控離子通道的反應(yīng)時(shí)間大約為I至2秒。在該反應(yīng)達(dá)到最大值(是由電流變化最大而測定的)之后，通道變得脫敏化。配體對離子通道產(chǎn)生最大的影響和脫敏現(xiàn)象之間的時(shí)間段通常也非常短，大約為若干秒或更短。因此，為了測量與配體門控離子通道的開放或閉合相關(guān)的電流變化，電極(傳感電極)和配體源應(yīng)當(dāng)同時(shí)都存在于孔中。注意，某些通道具有低的脫敏現(xiàn)象或沒有脫敏現(xiàn)象。在一些現(xiàn)有設(shè)計(jì)中，在任意一個(gè)時(shí)間，傳感電極和移液器中僅有一者能夠被容納于孔中。在這些設(shè)計(jì)中，電極和移液器不能一起同時(shí)地在指定孔中接觸溶液。為了進(jìn)行 LGIC檢驗(yàn)，該系統(tǒng)首先將配體移入孔中(這時(shí)傳感電極不在孔中)，只有在稍后，在移除移液器后，才向孔中插入電極。因此，該系統(tǒng)可能缺少有關(guān)該離子通道操作的關(guān)鍵的早期信息。在本發(fā)明中，電極和移液器分開并且獨(dú)立地、但是同時(shí)地接觸孔中的溶液。在本文所述的各種實(shí)施方案中，一個(gè)孔可同時(shí)包括電極和移液器這二者，但它們處于不同的位置。該移液器在典型LGIC檢驗(yàn)中具有包括輸送配體在內(nèi)的多種功能。在所披露的設(shè)計(jì)中，傳感電極可以持續(xù)監(jiān)測電流并提供用于產(chǎn)生電流示蹤的信號，同時(shí)，移液器向孔中輸送立即對配體門控離子通道產(chǎn)生影響的配體。圖3為用于進(jìn)行高通量膜片鉗檢驗(yàn)的特定裝置的頂視圖。如圖所示，不同的區(qū)站可用于為多孔板提供試劑、細(xì)胞、洗滌液等。所示裝置包括裝有多個(gè)移液器303的移液器頭部313，該移液器頭部可以在測試區(qū)315和位于該測試區(qū)兩側(cè)的其它區(qū)站之間移動，在測試區(qū)315中布置有多孔膜片板和關(guān)聯(lián)的電極板317，所述其它區(qū)站包括細(xì)胞儲池319、洗滌液儲池321、移液器清洗站323、配體儲池325、以及測試化合物或藥物站327。另外，該裝置可包括緩沖液站329，其中包含用于輸送至孔的新鮮的細(xì)胞外液。在裝有底架或桌子的平臺305上提供所有這些不同的區(qū)站，在平臺305的上方，移液器頭部可在合適的運(yùn)算邏輯的控制下水平和垂直地移動，該運(yùn)算邏輯可由適當(dāng)編程的計(jì)算機(jī)和/或硬編碼邏輯提供。具體而言，移液器頭部可為自動化的多通道移液器頭部，其具有拋棄型或非拋棄型吸嘴，例如標(biāo)準(zhǔn)多通道移液器(該移液器的例子為可得自加利佛尼亞州的MolecularDevices of Sunnyvale公司的FLIPR 儀器中所用的移液器)。通常使用拋棄型的塑料或玻璃移液器。該移液裝置頭部(fluidics head)可被安裝在X-Y-Z移動執(zhí)行裝置上。該執(zhí)行裝置以這樣的方式移動該移液裝置頭部，該方式允許移液器與孔上方的開口排成直線、并且穿過這些開口進(jìn)入安裝在測試區(qū)中的膜片板的孔中。該移液裝置頭部優(yōu)選既能從孔中吸出液體，也能向孔中分配液體。通常，本文所述的高通量實(shí)施方式采用自動化器械、數(shù)據(jù)處理和控制軟件、液體處理設(shè)備和檢測器。高通量篩選允許研究人員對離子通道快速進(jìn)行成百上千或上百萬種生物化學(xué)、遺傳或藥學(xué)檢測。高級系統(tǒng)允許對高密度多孔板平行地自動施加試劑和洗滌液。
圖4A示出了測試區(qū)的分解圖(例如圖3所示的測試區(qū)315)。該分解圖示出了氣室433、氣室上方的膜片板401、膜片板上方的電極板411，以及最后是位于電極板411上方的移液器頭部313。注意，氣室433包括多個(gè)圓盤狀參比電極421，例如接地并安裝在氣室腔413底部表面的Ag/AgCl電極。以下將更詳細(xì)地分別描述該測試區(qū)的各個(gè)部件。圖4B為根據(jù)某些實(shí)施方案的膜片板401的頂視圖。圖中示出的膜片板包括以陣列形式排列的384個(gè)分開的孔403。當(dāng)然，可使用具有不同孔數(shù)的板，例如具有1536個(gè)或96個(gè)不同的孔的膜片板。通過使用具有大量孔的膜片板，可同時(shí)并行且獨(dú)立地測量多個(gè)細(xì)胞的電流，這允許對施加于細(xì)胞的化合物或其它刺激進(jìn)行快速地表征。通過將每個(gè)細(xì)胞(或多個(gè)細(xì)胞)放入膜片板的一個(gè)單獨(dú)的孔中，使得該細(xì)胞(或多個(gè)細(xì)胞)與其它被研究的細(xì)胞分開。在某些實(shí)施方案中，膜片板的外部尺寸和形狀符合SBS (生物分子篩選學(xué)會)針對多孔板制定的標(biāo)準(zhǔn)，從而有利于通過標(biāo)準(zhǔn)自動化儀器進(jìn)行操作。如圖4B所示，每個(gè)孔403包括位于所示孔的左下區(qū)域的細(xì)胞腔室405、以及布置在細(xì)胞腔室右邊的電極袋407。下文 中將提供有關(guān)孔405的合適設(shè)計(jì)的進(jìn)一步細(xì)節(jié)。在某些實(shí)施方案中，膜片板由兩部分組成。其中一部分是由惰性、生物相容性且電絕緣性的塑料注射模塑而成的，所述塑料例如為聚碳酸酯、聚苯乙烯或任何其它合適的材料。該部分限定了孔的頂壁和側(cè)壁。如下所述，其也可限定移液器和電極袋或腔室。在具體的例子中，每個(gè)孔的底部包括一個(gè)或兩個(gè)相對較大的孔眼(例如直徑為約O. 25至5_或約I至2mm,或在具體情況下為約I. 5mm) 這些孔眼中的一個(gè)的大小和形狀應(yīng)該被制成能夠容納移液器吸嘴。如果使用兩個(gè)孔眼，則第二個(gè)的大小和形狀應(yīng)當(dāng)被制成能夠容納傳感電極。在某些實(shí)施方案中，電極直徑為約O. 5至2mm (例如約1mm)。膜片板的第二部分為電絕緣材料薄膜，例如玻璃或塑料膜，所述塑料膜例如為聚酰亞胺膜，例如Kapton (聚(4，4’-氧聯(lián)二亞苯基-均苯四甲酰亞胺))膜。其他合適的聚合物包括聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET,例如Dupont Mylar )、聚碳酸酯、聚丙烯和聚乙烯。該膜結(jié)合在模制部分的底部并覆蓋該孔眼。該膜包含許多更小的孔眼，每個(gè)孔包含一個(gè)或多個(gè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，膜片板的每個(gè)孔的底部包括單一一個(gè)通孔孔眼，該孔眼的至少一個(gè)尺寸(通常為該通孔的直徑)小于細(xì)胞的尺寸(例如約I至10微米)。通常，該通孔的最小直徑接近2微米。在另一實(shí)施方案中，膜片板的每個(gè)孔包括多個(gè)通孔孔眼(每個(gè)孔中，孔眼的典型數(shù)目為64個(gè))。這是PPC配置，即圖IB所示的實(shí)施方案。在某些情況下，膜片板被密封連接或以其它方式安裝至氣室，使得每個(gè)孔底部的孔眼將孔和氣室腔連通?？捎蓮椥詨|圈和將膜片板壓到墊圈上的框架(例如金屬框架)來提供密封。安裝電極板后，用細(xì)胞內(nèi)緩沖液填充氣室。在孔中裝入細(xì)胞外緩沖液。如上所述，氣室還包括一個(gè)或多個(gè)連接至電氣零基準(zhǔn)(例如電接地)的銀/氯化銀(Ag/AgCl)電極。圖4C至4E示出了適用于圖4B所示膜片板401的電極板的實(shí)施方案。如圖4C所示，電極板411包括基板419 (例如印刷電路板基板)、電極417陣列、以及相關(guān)聯(lián)的移液器通孔413陣列。對于對應(yīng)的膜片板中的每個(gè)獨(dú)立的孔，存在相關(guān)聯(lián)的電極417、以及相關(guān)聯(lián)的通孔413。因此，電極417和通孔413的大小和間隔針對膜片板而定。在具體實(shí)施方案中，電極間隔排列，從而為384孔配置的SBS柔性板的每個(gè)孔提供一個(gè)電極。在其它實(shí)施方案中，電極間隔排列，從而為類似的96孔或1536孔柔性板的每個(gè)孔提供一個(gè)電極。
將通孔413布置為允許單獨(dú)的移液器進(jìn)入膜片板401的每個(gè)孔。另外，在圖示的例子中，通孔413相對于電極417定位，使得每個(gè)孔中同時(shí)存在一個(gè)移液器吸嘴和一個(gè)電極417。在一些實(shí)施方案中，基板419為印刷電路板(PCB)，其上附接(例如焊接)有電極陣列。在具體實(shí)施方案中，每個(gè)電極被成形為例如圓柱狀，其直徑大致為1mm，并且由銀或某種鍍銀的其它金屬(例如鋼)制備而成。每個(gè)電極由電絕緣涂料(例如Teflon )覆蓋，除了該電極的最近端部分(底部)以外，該部分在涂敷過程中通過遮掩而保持未被覆蓋。電極的頂部被焊接至基板中，未被Teflon覆蓋的底部(大致Imm長)用氯化銀涂敷。如上所述，基板還包括移液器開口 413的陣列，每個(gè)洞與每個(gè)電極之間有一定距離(例如，大約2_)。某些適用于本發(fā)明的電極板的實(shí)施方案的例子在美國專利申請No. 11/222, 576 (也可參見PCT公開PCT/US2005/032044)中有進(jìn)一步的描述，前面已經(jīng)通過引用的方式將其內(nèi)容并入本文中。在圖4D所示的實(shí)施方案中，電極板411是具有外部區(qū)域451的較大結(jié)構(gòu)的一部 分，該外部區(qū)域可以是電極陣列占據(jù)的區(qū)域之外的框架、并且包括電連接453，例如用于連接各個(gè)電極和底座中的監(jiān)測控制電路的鍍金墊。圖4D是電極板和框架結(jié)構(gòu)的底視圖，其示出了通孔413和電極417。在一些情況下，電連接453是銷或彈簧，例如彈簧負(fù)載的彈簧探針式電子連接器。在這種情況下，當(dāng)安裝在裝置中時(shí)，彈簧負(fù)載的彈簧探針式電子連接器與測試區(qū)附近的平臺上的觸點(diǎn)接合，從而在放大器和/或電壓控制電路(安裝到裝置的底座)以及電極板的傳感電極之間提供電連接。在可供替代的實(shí)施方案中，彈簧探針式電子連接器被設(shè)置在儀器的底座上，并且適配墊被設(shè)置在電極板上。不管電極板上的觸點(diǎn)的結(jié)構(gòu)如何，每個(gè)觸點(diǎn)453均通過基板上的示蹤線(未示出)連接至其對應(yīng)的傳感電極。在所示實(shí)施方案中，該組件的外部區(qū)域451為框架(例如金屬框架)的基底部分，其為所得組件提供剛性。另外，該框架可包括便于儀器夾住該電極板的特征。圖4E顯示出這樣的框架和電極板組件461 (從上方觀察)，其包括框架463，該框架又包括手柄465，從而便于手動安裝和拆卸該電極板。將電極板與框架一起安裝(例如夾持)到儀器上，使得電極與膜片板接合。例如，當(dāng)框架和電極板組件被放置在測試表面的配合面上時(shí)，所述電極板的電極插入膜片板的相應(yīng)孔中，從而在孔中的液體和電極(通常為每個(gè)孔一個(gè)電極)之間提供電連接。該框架下側(cè)的外部區(qū)域上的觸點(diǎn)陣列同時(shí)與底座上對應(yīng)的觸點(diǎn)對齊并形成電連接。可在配合部件上提供這些對應(yīng)的觸點(diǎn)(例如平臺或底座上位于測試區(qū)兩側(cè)的區(qū)域)。如所指出的那樣，所述儀器還包括電流傳感放大器，優(yōu)選的是，膜片板的每個(gè)孔配有一個(gè)放大器。該儀器的觸點(diǎn)被連接至電流放大器的輸入端，使得當(dāng)該電極板被安裝在儀器上時(shí)，該電極板的電極將每個(gè)孔中的液體與放大器輸入端連接。圖5A示出了膜片板401中的單個(gè)孔501的對角線橫截面。它還示出了電極板，其具有布置在孔501中的相關(guān)電極417。另外，它示出了移液器503，其延伸穿過電極板411上的通孔413并進(jìn)入孔501中。孔501包括開口或頂部513和底部515?？拷椎撞?15有一個(gè)具有特定輪廓的區(qū)域，該區(qū)域包括細(xì)胞腔室509和電極袋511。在示出的實(shí)施方案中，細(xì)胞腔室509延伸到孔501的最底部，而電極袋511沒有延伸至最底部。細(xì)胞腔室509和電極袋511在它們各自的底部附近通過液體彼此連接。
細(xì)胞腔室509以所述孔的底部片材或薄膜515作為自己的底部。在細(xì)胞腔室509內(nèi)且通過底部薄膜515，存在有孔眼510，在檢驗(yàn)期間所研究的細(xì)胞被封接至該孔眼。在平行膜片鉗設(shè)計(jì)中，在細(xì)胞腔室509的底部中存在多個(gè)孔眼510。如圖所示，在由相對平坦的大體水平的區(qū)域521所限定的中部架子處，細(xì)胞腔室509向著孔501的上部打開。在區(qū)域521的正下方，細(xì)胞腔室509由移液器導(dǎo)流件519限定，在所述實(shí)施方案中，移液器導(dǎo)流件是大體圓錐形或漏斗形的移液器聯(lián)接特征件，其被設(shè)計(jì)成用于將移液器吸嘴505引導(dǎo)或定位于靠近孔眼510的位置中。通過將伸進(jìn)來的移液器的吸嘴定位于細(xì)胞腔室中，移液器導(dǎo)流件可保證移 液器吸嘴和孔眼510上的細(xì)胞之間形成一致和直接的液體連通。通常，移液器導(dǎo)流件519與電極板基板中的對應(yīng)開口(移液器通孔)基本上同軸。如上所述，該儀器可以包括具有多個(gè)移液器(諸如拋棄型塑料移液器)的自動化移液器頭部。該移液裝置頭部使移液器與電極板中的開口對齊，從而允許移液器通過這些開口并進(jìn)入膜片板的孔內(nèi)。當(dāng)使用該自動化移液裝置將移液器插入孔中時(shí)，移液器導(dǎo)流件接住該移液器，將移液器的吸嘴對準(zhǔn)。多通道移液器通常表現(xiàn)出移液器(特別是拋棄型塑料移液器)吸嘴具有某種程度的位置誤差(傾斜)，這至少是由于移液器吸嘴的尺寸不精確而導(dǎo)致的。在移液器導(dǎo)流件不存在時(shí)，該傾斜會導(dǎo)致移液器的吸嘴口和位于不同孔內(nèi)的細(xì)胞之間的距離是可變的，這會導(dǎo)致不期望的液體交換的可變性。移液器導(dǎo)流件將移液器吸嘴定位在孔中間，從而降低了該可變性。如所指出的那樣，孔501的底部包括朝著該孔上部區(qū)域的兩個(gè)開口，一個(gè)用作移液器導(dǎo)流件，而另一個(gè)用作電極袋(圖5A中右側(cè))。細(xì)胞腔室和電極袋在該孔的最底部(膜片細(xì)胞所在的位置)促進(jìn)液體交換。在某些實(shí)施方案中，移液器導(dǎo)流件519與移液器吸嘴505形成緊密的(或基本上緊密的)密封。這為移液器排出的液體提供了清楚限定的流動路徑。具體而言，當(dāng)將流體從移液器吸嘴分配到孔中時(shí)，流體流過細(xì)胞腔室509，由此直接施加于細(xì)胞。然后，該流體流入電極袋511中并離開而進(jìn)入孔的上部。在膜片鉗實(shí)驗(yàn)從一個(gè)階段轉(zhuǎn)換到下一個(gè)階段時(shí)，這種設(shè)計(jì)便于置換孔中用過的或舊的液體。例如，當(dāng)在檢驗(yàn)過程中的對照階段和測試階段之間轉(zhuǎn)換時(shí)，該設(shè)計(jì)允許用新鮮的不含配體的細(xì)胞外緩沖液或洗滌液置換含配體的溶液。通常，穿過移液器導(dǎo)流件進(jìn)入細(xì)胞腔室的液體置換細(xì)胞(或多個(gè)細(xì)胞)周圍的液體。從移液器輸送液體至細(xì)胞腔室的過程會沖去舊的液體、以及可能還有一些過量的新液體，其流過電極袋然后流入孔的上部。因此，移液器導(dǎo)流件、細(xì)胞腔室和電極袋在孔中產(chǎn)生流動通道。液體流過該通道導(dǎo)致細(xì)胞(或多個(gè)細(xì)胞)附近發(fā)生高效且快速的液體交換。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞腔室、電極袋和它們之間的液體連接部的大小和形狀限定了微流體流動通道。在各種實(shí)施方案中，移液裝置頭部可將液體分配到孔中和/或從膜片板的孔中吸出液體(例如，通過當(dāng)使移液器在孔501內(nèi)部升高時(shí)產(chǎn)生真空的方式)。如圖5A那樣，圖5B也示出了孔501以及電極板電極417和移液器503。然而，在此圖中，移液器503已經(jīng)被升高至孔501的中部。在升高移液器503的同時(shí)或緊隨其后，開啟一個(gè)裝置，以從孔501的上部區(qū)域抽取或以其他方式吸取一些液體，從而允許進(jìn)一步清洗該檢驗(yàn)中所考慮的細(xì)胞(或多個(gè)細(xì)胞)。在某些實(shí)施方案中，該裝置為傳統(tǒng)的液體抽吸裝置，例如與移液器相聯(lián)的一組移動的注射器柱塞。注意，將移液器吸嘴升高至其從該孔的頂部吸取液體的位置處，即，積累了過量的或“臟的”液體的位置處，由此在細(xì)胞腔室底部留下“干凈”的液體。該升高/抽吸過程與之前的將洗滌液或新的試劑溶液輸送到孔中的操作相結(jié)合時(shí)，提供了特別有效和高效的用新鮮溶液置換已用過溶液的方式。圖5C是孔501的頂視圖，取自與圖4B的整個(gè)膜片板相似的視角。如圖5C所示，孔501包括細(xì)胞腔室509和位于孔501的左下區(qū)域的孔眼510，并且還包括位于細(xì)胞腔室右上方的電極袋511。此外，如所指出的那樣，細(xì)胞腔室509和電極袋511相交，并且液體連通。也就是說，從上面觀察時(shí)，電極袋和細(xì)胞腔室接觸或重疊。電極袋511和細(xì)胞腔室509之間的中心至中心的距離為線段561所示。在某些實(shí)施方案中，該距離在約I和4毫米之間，更具體地在約I. 5和3毫米之間，通常為約2毫米。該電極袋和細(xì)胞腔室之間的液體連接部的橫截面面積可以是例如約O. I至10平方毫米，或更具體地為約I至2平方毫米。在某些具體實(shí)施方案中，該孔具有開放的上部區(qū)域，也就是說，孔的上部區(qū)域不含腔室、擋板或其它內(nèi)部特征。然而，孔的下部區(qū)域具有特定的輪廓以包括某些特征，通常至少為細(xì)胞腔室。通常，該孔中具有特定輪廓的下部區(qū)域還包括電極袋、以及位于電極袋與細(xì) 胞腔室之間的液體連接部，該連接部被設(shè)置在靠近電極袋和細(xì)胞腔室的底部的位置處。雖然本文提供的附圖示出了由孔的外壁所限定的形狀(從上方觀察時(shí))大體為正方形，但并非必須如此。在某些實(shí)施方案中，該形狀大體上為矩形、圓形、橢圓形等。總體而言，電極袋的大小和形狀被制成能夠容納傳感電極，并具有相對于容納該電極所需的容積而言略有過剩的容積。在某些實(shí)施方案中，所述的袋大體上是圓筒形的形狀，但也可以是多邊形、橢圓形、卵形等。該形狀總體上與傳感電極的形狀相匹配。在各種實(shí)施方案中，所述袋的高度(在垂直方向上)可以至多為約5_，通常在約I和3mm之間。在某些情況下，所述袋的主寬度或直徑可在約O. 25和5mm之間，并且通常在約I和3mm之間。如上所述，細(xì)胞腔室可經(jīng)由移液器導(dǎo)流件而向著孔的上部打開。細(xì)胞腔室的總垂直深度，包括移液器導(dǎo)流件(如果存在的話)在內(nèi)，通常至少約為2_，在具體的實(shí)施方案中介于約O. 5和5mm之間。在典型例子中，細(xì)胞腔室的主直徑或?qū)挾仍诩sO. 5和5mm之間，更具體地在約I和2mm之間。細(xì)胞腔室的形狀可以是例如圓形、正方形、矩形、橢圓形、三角形、或其它多邊形。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞腔室的寬度或直徑由圖5C中箭頭563表示。除了移液器導(dǎo)流件之外，細(xì)胞腔室的形狀和尺寸沿其縱向通常不會有明顯變化。不管是否使用移液器導(dǎo)流件，都可以這樣構(gòu)建細(xì)胞腔室，使得當(dāng)移液器吸嘴與所述的腔室接合時(shí)，該吸嘴與該腔室底部的孔眼之間的距離在約O. 5_或更近的范圍內(nèi)。這有助于用移液器排出的洗滌液或緩沖溶液清洗細(xì)胞。在某些情況下，細(xì)胞腔室占據(jù)的垂直距離在所述孔的總高度的約10%和50%之間。另外，細(xì)胞腔室占據(jù)的體積可在所述孔的總體積的約O. 5%和5%之間。在具體的例子中，細(xì)胞腔室的總體積在約500至2000納升之間。當(dāng)存在移液器導(dǎo)流件時(shí)，通常其具有與移液器吸嘴配合的形狀和大??；即，當(dāng)移液器位于最終的低位時(shí)，導(dǎo)流件的大小和形狀使得其與移液器吸嘴周向接合。因此，導(dǎo)流件通常具有錐形部分，例如圓錐形或棱錐形。然而，在某些實(shí)施方案中，它也可以具有平直的形狀，例如，沒有逐漸變細(xì)的圓筒形或矩形。就功能而言，由于移液器導(dǎo)流件的形狀和大小，因此在正常操作過程中，其可防止從移液器吸嘴分配出的液體的大部分向上流動而流出移液器導(dǎo)流件。當(dāng)所述的孔在細(xì)胞腔室和電極袋之間還具有液體連接部時(shí)，位于移液器導(dǎo)流件中的移液器吸嘴分配出的液體首先流入細(xì)胞腔室，然后在離開并進(jìn)入所述孔的上部區(qū)域之前通過電極袋。在某些實(shí)施方案中，該移液器導(dǎo)流件的長度在約O. I和5_之間，并且在更具體的實(shí)施方案中其長度在約I和2毫米之間。在某些設(shè)計(jì)中，移液器導(dǎo)流件的直徑或?qū)挾鹊妮^低范圍可在約O. I和3毫米之間。更具體地，該直徑或?qū)挾瓤稍诩sO. 5和2_之間。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，提供了使用多孔系統(tǒng)進(jìn)行平行膜片鉗實(shí)驗(yàn)的各種方法和方案。這些方案中的某些對配體門控離子通道和電壓門控離子通道使用不同的工藝序列。一些工藝序列允許在單個(gè)孔中對該孔所容納的同一細(xì)胞或是細(xì)胞群既進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn)又進(jìn)行檢測實(shí)驗(yàn)。以下將結(jié)合圖6A至6D來描述一些非限制性的工藝序列。有時(shí)，將結(jié)合膜片板或上述其它裝置對這些方法進(jìn)行說明。然而，應(yīng)當(dāng)理解，除非另外指明，否則這些方法所代表的本發(fā)明并不限于上述特定的裝置。供參考，圖6A示出了對如下過程的概括性高級描述，該過程將通過使用上述的任意裝置或本文中未具體描述的其它裝置來完成。如圖6A所示，該過程開始為操作603，其中，系統(tǒng)向多孔板(例如本文所述的膜片板)的各個(gè)孔中弓I入緩沖液。該緩沖液可以為例如 細(xì)胞外緩沖液?？赏ㄟ^以下方式引入緩沖液，例如移動移液器頭部(例如圖3所示的移液器頭部313)至緩沖液儲池，將緩沖液吸入到位于移液器頭部中的各個(gè)移液器中，將裝有緩沖液的頭部移至膜片板上方，降低移液器頭部從而使各個(gè)移液器進(jìn)入膜片板的孔中，最后，將所述緩沖液從各個(gè)移液器輸送至膜片板的各孔中。在使用電極板或類似的具有移液器通孔的模板的實(shí)施方案中，降低移液器頭部的步驟使移液器通過通孔進(jìn)入孔中。一旦進(jìn)入孔中，移液器可接觸移液器導(dǎo)流件，如圖5A所示的那樣。在緩沖液被加入到各個(gè)孔后，該過程繼續(xù)進(jìn)行操作605，其中，向位于各個(gè)孔下方的氣室施加吸力，以清除可能被夾帶在膜片板的孔底部的孔眼邊緣處的任何空氣。操作605是可選的，并且在某些設(shè)備設(shè)計(jì)中可能不是必須的。在該工藝序列中的下一個(gè)步驟中，將膜片板下方的氣室用其自己的緩沖液填充。參見操作607。注意，氣室通常完全充滿緩沖液，從而使緩沖液接觸膜片板的底部表面。例如，向氣室提供的緩沖液可以是細(xì)胞內(nèi)緩沖液，其應(yīng)該與通常在操作603中引入孔內(nèi)的那類細(xì)胞外緩沖液相反。盡管不是必須，但是通常選擇細(xì)胞外緩沖液的組成以模擬細(xì)胞在體內(nèi)時(shí)的細(xì)胞外環(huán)境。選擇細(xì)胞內(nèi)緩沖液的組成以模擬細(xì)胞內(nèi)部的情況。例如，細(xì)胞外緩沖液可包含鈉離子、氯離子和鈣離子。細(xì)胞內(nèi)緩沖液可以具有類似的組成，但具有相對較高濃度的鉀離子和相對較低濃度的鈉離子和鈣離子。在氣室完全充滿緩沖液后，該過程接下來包括將細(xì)胞輸送到各個(gè)孔中。該操作如操作609所示，并且可以通過如下方式來進(jìn)行例如，借助于移液器頭部將細(xì)胞從細(xì)胞儲池自動輸送到各個(gè)孔中。在細(xì)胞被輸送到膜片板的各個(gè)孔后，細(xì)胞被封接到它們對應(yīng)的孔的底部上的孔眼。這可以通過在孔和氣室之間建立壓力差來完成。該操作如流程圖的方框611中所述。接著，在該工藝序列中，通過合適的裝置將孔眼中的細(xì)胞膜片穿孔。在某些實(shí)施方案中，這是通過采用相對較高的電壓對細(xì)胞進(jìn)行“電壓脈沖刺激”而實(shí)現(xiàn)的。在其它實(shí)施方案中，如上所述，通過將穿孔化合物引入氣室來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜片的穿孔。穿孔化合物在孔眼中的膜片上引入了一定程度的穿孔。典型的穿孔化合物是親脂性化合物，包括某些抗生素例如兩性霉素。當(dāng)穿孔結(jié)束時(shí)，該裝置即可用于進(jìn)行膜片鉗檢驗(yàn)。圖6B和6C的流程圖描述了使用該裝置及其配置進(jìn)行各種檢驗(yàn)的細(xì)節(jié)。在圖6A中，這些檢驗(yàn)概括性地由方框615表示。在檢驗(yàn)完成后，該過程可任選地包括丟棄所述移液器和/或膜片板，這兩者都有可能被檢驗(yàn)中所使用的特定細(xì)胞或化合物污染。參見方框617?？晒┻x擇的是，也可以將移液器洗滌并重復(fù)使用，有時(shí)候這是優(yōu)選的，原因是移液器可能價(jià)格昂貴。如所指出的那樣，某些操作可以通過移液器頭部的自動移動來進(jìn)行。因此，根據(jù)某些實(shí)施方案，圖6A所示過程中的操作603、609、615和617通過自動移動或移液器來進(jìn)行。在具體的實(shí)施方案中，操作603包括移液器頭部313在區(qū)站329和測試區(qū)315之間的移動。參見圖4A。類似地，操作609包括在區(qū)站319和315之間的移動，操作617包括在區(qū)站323和315之間的移動。操作615(在下文中將更詳細(xì)地描述該操作)可以包括在緩沖液站329、化合物站325、化合物站327、洗滌站321中的兩個(gè)或更多個(gè)與測試區(qū)315之間的移動。圖6B為示出了當(dāng)檢驗(yàn)615采用電壓門控離子通道時(shí)，執(zhí)行圖6A所示檢驗(yàn)615的流程圖。如圖所示，圖6B的過程開始于操作621，其中，儀器控制系統(tǒng)在傳感電極和參比電極之間施加第一電壓，以激活電壓門控離子通道。在不施加測試化合物或待研究的其它刺激的條件下進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)。其目的在于獲得所關(guān)注的電壓門控離子通道工作時(shí)的對照讀數(shù)。當(dāng)儀器在操作621中施加第一電壓時(shí)，該系統(tǒng)同時(shí)測量傳感電極的電流，如操作623所示。該電流為該檢驗(yàn)提供了對照讀數(shù)的測量結(jié)果。接著，在操作624中，可任選地除去所施加的電壓。此后，將測試化合物或待研究的其它刺激施加于膜片板的各個(gè)孔中。參見方框625?？梢酝ㄟ^使用移液器頭部進(jìn)行的自動輸送來實(shí)施該操作。在許多檢驗(yàn)中，不同的化合物被施加到膜片板的不同孔中。在操作625中所用的化合物可被孵育一段時(shí)間，以確保在所述檢驗(yàn)中它們的影響被細(xì)胞表現(xiàn)出來。無論是否提供這樣的孵育期，并且如果提供的話，提供多久，該過程均繼續(xù)跨電極再次施加電壓，以再次引發(fā)電壓門控離子通道的打開。參見方框627。該電壓可以與操作621中施加的電壓相同，但并非必須相同。向電極施加電壓后，與該設(shè)備相聯(lián)的電路再次測量傳感電極的電流。此時(shí)，電流值提供檢測值，可以將其與各個(gè)孔中細(xì)胞的對照值進(jìn)行比較。這時(shí)，操作615 (圖6A)完成，并且該過程繼續(xù)進(jìn)行可選的如上所述的丟棄膜片板和移液器的操作。圖6C描述了執(zhí)行檢驗(yàn)615的不同方式，其中檢驗(yàn)配體門控離子通道。如圖6C所示，該檢驗(yàn)開始于操作641，其中，對設(shè)備中的電極施加第一電壓。此步驟是可選的，這是由 于大多數(shù)配體門控離子通道不是通過電壓激活，而是通過配體激活的。如果施加電壓，它的值可以不同于激活電壓門控離子通道(例如在圖6B所示的過程中)所施加的值?？蛇x步驟641完成后，該過程繼續(xù)向膜片板的各個(gè)孔中施加所需的配體。參見方框643。該操作可以用如上所述的自動移液器頭部來進(jìn)行。注意，膜片板中的每個(gè)孔將被施予相同的配體，因?yàn)樗鼈冎械拿恳粋€(gè)均采用具有相同配體門控離子通道的細(xì)胞。向孔中施加配體后，該設(shè)備立刻測量傳感電極的電流，從而為每個(gè)孔提供對照測量值。如圖6C中的方框645所示。重要的是立即測量電流，這是由于如在圖2的討論中指出的那樣，配體門控離子通道對配體迅速變得脫敏化并且“關(guān)閉”，甚至在配體持續(xù)存在的情況下也是這樣。注意，上述類型的裝置在單個(gè)孔中同時(shí)使用移液器吸嘴和電極，因而允許立即測量電流。在操作645中進(jìn)行對照測量后，該過程繼續(xù)進(jìn)行操作647，其中，使用緩沖液或其它洗滌液清洗膜片板的各個(gè)孔。該工藝步驟也可以通過移液器自動輸送洗滌液來完成。洗滌過程的一個(gè)具體例子如圖6D所示。在洗滌完成后，該過程可能包括等待規(guī)定的時(shí)間，使細(xì)胞再次敏感化，這樣，接下來引入的配體將再次引發(fā)離子通道的活化。對于某些配體門控離子通道，這需要等待幾分鐘。在此等待的過程中或之后，該儀器向膜片板的各個(gè)孔中施加測試化合物或其它刺激。同樣，所述化合物或其它刺激可以通過移液器自動輸送來提供。參見方框651。通常，向膜片板的不同孔施加不同的刺激。任選地，在進(jìn)行檢測測量之前，將細(xì)胞用所述化合物或其它刺激孵育一段時(shí)間。當(dāng)細(xì)胞可用于檢測測量時(shí)，該過程繼續(xù)進(jìn)行操作653，其中，配體被施加到膜片板的每個(gè)孔中。如前所述，可通過各移液器的自動輸送來提供配體。并且，如前所述，在配體被輸送到大多數(shù)或所有的孔后，該過程繼續(xù)進(jìn)行的操作是立即測量傳感電極的電流。參見操作655。該電流測量提供了與操作645中獲得的對照數(shù)據(jù)進(jìn)行比較的檢測數(shù)據(jù)。在獲得檢測數(shù)據(jù)并且經(jīng)過合適的處理(如果必要的話)之后，圖6A流程圖的操作615完成，并且整個(gè)過程如上所述繼續(xù)進(jìn)行。應(yīng)當(dāng)明確，藥物篩選，特別是篩選對LGIC的影響，往往需要重復(fù)進(jìn)行化合物添加 和洗脫的循環(huán)。按照某些實(shí)施方案，如圖6D所示完成洗脫。最初，用緩沖液填充移液器(操作661)，然后將其引入孔內(nèi)并定位于細(xì)胞腔室中。參見操作663。然后將該溶液分配到腔室底部，用洗滌液置換腔室中的舊液體(操作665)。過量的溶液溢流進(jìn)入孔的電極袋以上的部分中。移液器可將其攜帶到孔中的緩沖液的大部分或全部都分配出來。在移液器清空其內(nèi)容物后，移液裝置頭部被升高幾毫米(例如約2至10_)，從而使移液器的吸嘴離開移液器導(dǎo)流件，并處于孔內(nèi)導(dǎo)流件以上(參見圖5B)但低于孔內(nèi)液體的上部高度的位置處。參見操作667。此時(shí)，所述移液裝置頭部的動作相反，移液器從孔的頂部抽吸液體，從而在含有細(xì)胞膜片的腔室底部中留下干凈的緩沖液。也就是說，移液器的位置允許它從孔的上部區(qū)域吸取液體到該移液器中。通常，分配緩沖液或其他溶液后約O至10秒內(nèi)，將移液器吸嘴從細(xì)胞腔室中抬起。注意，在某些情況下，根本不需要等待。抽取的液體是舊液體和洗滌液的混合物。然后，將來自移液器的液體倒入廢料中，任選地洗滌/置換移液器，并重復(fù)進(jìn)行洗脫循環(huán)(通過移液器導(dǎo)流件將洗滌液分配到細(xì)胞腔室中，隨后升高所述移液器，并從孔內(nèi)移液器導(dǎo)流件以上的部分吸取混合液體)，重復(fù)的次數(shù)使得足以達(dá)到所需的洗滌程度。為了說明和描述的目的，已經(jīng)提供了以上對本發(fā)明具體實(shí)施方案的描述。它們并非旨在窮舉或?qū)⒈景l(fā)明限定到所披露的精確形式，顯然，根據(jù)上述教導(dǎo)，許多修改和變化都是可能的。實(shí)施方案的選擇和描述是為了最好地解釋本發(fā)明的原理及其實(shí)際應(yīng)用，從而使本領(lǐng)域其他技術(shù)人員能夠最好地利用本發(fā)明、以及結(jié)合了適于預(yù)期特定用途的各種修改的各種實(shí)施方案。本發(fā)明的范圍旨在由隨附的權(quán)利要求書和它們的等價(jià)方式所限定。
權(quán)利要求
1.一種包括多個(gè)孔的多孔板，其中所述多孔板的至少一個(gè)孔包括這樣的底部，所述底部包括 (a)細(xì)胞腔室，所述細(xì)胞腔室的大小和形狀被制成能夠容納移液器吸嘴，以及 (b)電極袋，所述電極袋的大小和形狀被制成能夠容納傳感電極， 其中所述細(xì)胞腔室和所述電極袋被布置為允許同時(shí)容納所述移液器吸嘴和所述傳感電極。
2.權(quán)利要求I所述的多孔板，其中所述細(xì)胞腔室在該細(xì)胞腔室的底部表面中包括至少一個(gè)細(xì)胞封接孔眼。
3.權(quán)利要求I所述的多孔板，其中所述細(xì)胞腔室包括移液器導(dǎo)流件，該移液器導(dǎo)流件具有與所述移液器吸嘴配合的形狀和大小，以免從該移液器吸嘴分配出的液體的大部分向上流動而流出所述移液器導(dǎo)流件。
4.權(quán)利要求3所述的多孔板，進(jìn)一步包括位于所述細(xì)胞腔室和所述電極袋之間的液體連接部，由此，從所述移液器吸嘴分配出的液體首先流入該細(xì)胞腔室，然后在流出而進(jìn)入所述孔的上部區(qū)域之前穿過所述電極袋。
5.一種膜片鉗裝置，該膜片鉗裝置包括 (a)電極板，該電極板包括多個(gè)傳感電極以及多個(gè)相關(guān)聯(lián)的通孔，該通孔的大小和位置被制成能容納由移液器頭部伸出的移液器吸嘴；以及 (b)多孔板，該多孔板包括多個(gè)孔，每個(gè)孔被布置成與所述電極板的一個(gè)電極和一個(gè)通孔對準(zhǔn)，其中所述多孔板的至少一個(gè)孔包括大小和形狀被制成能夠容納其移液器吸嘴的細(xì)胞腔室。
6.權(quán)利要求5所述的膜片鉗裝置，其中所述電極板包括多個(gè)觸點(diǎn)，所述觸點(diǎn)用于在所述傳感電極和所連的傳感和記錄電子設(shè)備之間提供電連接。
7.權(quán)利要求5所述的膜片鉗裝置，其中所述多孔板的每個(gè)孔包括用于封接該孔中的膜片的孔眼，并且所述的至少一個(gè)孔還包括大小和形狀被制成能夠容納一個(gè)傳感電極的電極袋，以及其中所述細(xì)胞腔室和所述電極袋被布置為允許同時(shí)容納所述移液器吸嘴和所述傳感電極。
8.權(quán)利要求5所述的膜片鉗裝置，其中所述細(xì)胞腔室包括移液器導(dǎo)流件，該移液器導(dǎo)流件具有與伸入所述至少一個(gè)孔中的移液器吸嘴配合的形狀和大小。
9.權(quán)利要求5所述的膜片鉗裝置，其中至少一個(gè)孔還包括電極袋、以及位于所述細(xì)胞腔室和所述電極袋之間的液體連接部，由此，從所述移液器吸嘴分配出的液體首先流入該細(xì)胞腔室，然后在流出而進(jìn)入所述孔的上部區(qū)域之前穿過所述電極袋。
10.一種實(shí)施膜片鉗檢驗(yàn)的方法，所述方法包括 (a)提供細(xì)胞，該細(xì)胞被封接至孔的底部上的孔眼； (b)將所述細(xì)胞暴露于第一溶液； (c)在所述細(xì)胞暴露于所述第一溶液的同時(shí)或之后，測量所述細(xì)胞的第一電信號； (d)從插入所述孔中的移液器向所述孔的底部輸送新鮮的溶液； (e)在所述孔內(nèi)升高而不移除所述移液器，并且從所述孔的上部區(qū)域?qū)⒁后w吸入該移液器中；以及 (f)將吸入所述移液器的所述液體從所述孔中移除。
11.權(quán)利要求10所述的方法，還包括在(f)中移除所述液體后，將所述細(xì)胞暴露于第二溶液，并且在所述細(xì)胞暴露于所述第二溶液的同時(shí)或之后，測量該細(xì)胞的第二電信號，其中所述第一電信號提供對照測量，并且所述第二電信號提供檢測測量。
12.權(quán)利要求10所述的方法，其中(c)中測量第一電信號是在將所述第一溶液引入所述孔中之后立刻進(jìn)行的。
13.權(quán)利要求10所述的方法，其中測量所述第一電信號包括檢測來自于所述孔中的傳感電極的電流。
14.權(quán)利要求10所述的方法，其中所述孔包括同時(shí)容納移液器吸嘴和傳感電極的開口頂部，以及具有容納移液器吸嘴的細(xì)胞腔室的底部，傳感電極，以及具有與所述細(xì)胞腔室相連的液體連接部的電極袋，由此，在(b)過程中，所述第一溶液自所述移液器吸嘴分配出來，并且首先流入所述細(xì)胞腔室，然后在流出而進(jìn)入所述孔的上部區(qū)域之前穿過所述電極袋。
15.權(quán)利要求10所述的方法，其中所述細(xì)胞腔室包括移液器導(dǎo)流件，該移液器導(dǎo)流件具有與伸入所述至少一個(gè)孔中的移液器吸嘴配合的形狀和大小，并且該移液器導(dǎo)流件與設(shè)置在所述孔之上的電極板中的相應(yīng)通孔大體上同軸。
16.權(quán)利要求10所述的方法，其中(a)進(jìn)一步包括封接含有至少一個(gè)配體門控離子通道的細(xì)胞，以及將配體輸送至所述孔；并且 其中(b)進(jìn)一步包括測量由所述配體門控離子通道暴露于所述配體而導(dǎo)致的第一電信號。
17.權(quán)利要求10所述的方法，在(e)和(f)之間進(jìn)一步包括向所述膜片施加刺激；以及將所述配體輸送至所述孔中，并在施加所述刺激后測量由所述配體門控離子通道暴露于所述配體而導(dǎo)致的電信號。
18.權(quán)利要求17所述的方法，進(jìn)一步包括允許所述配體門控離子通道再次敏感化。
19.權(quán)利要求17所述的方法，其中施加所述刺激包括施用藥學(xué)活性化合物或生物材料。
20.權(quán)利要求17所述的方法，進(jìn)一步包括在將所述配體輸送至所述孔之后立刻測量所述電信號。
全文摘要
具有特定輪廓的孔設(shè)計(jì)的多孔板可容許對離子通道或離子轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)行多階段高通量的平行測定。多孔板的孔具有底部區(qū)域，該底部區(qū)域的大小和形狀被制成能同時(shí)容納傳感電極和移液器，所述移液器用于輸送例如測試化合物、洗滌液、以及任選的配體。該多孔板可與具有移液器頭部和電極板的儀器相連。該布置方式有助于細(xì)胞和通過移液器提供的液體之間的液態(tài)接觸。也有助于用緩沖液或其它洗滌液洗滌所述孔，從而允許待測細(xì)胞順次暴露于各種試劑或其它刺激。通常，該設(shè)計(jì)允許對單個(gè)孔中的同一細(xì)胞(或多個(gè)細(xì)胞)進(jìn)行對照和測試實(shí)驗(yàn)。
文檔編號G01N27/26GK102884427SQ201180018243
公開日2013年1月16日 申請日期2011年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月9日
發(fā)明者尤里·弗拉基米羅維奇·奧西普丘克, 詹姆斯·理查德·瓦森, 愛德華·D·韋爾東克 申請人:分子裝置有限公司