專利名稱：互動藥物的篩選的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
該發(fā)明采用系統(tǒng)的、高通量的手段旨在發(fā)現(xiàn)互動組合的治療藥物。該發(fā)明將有助于進(jìn)一步確定互動療法治療疾病的新機(jī)理。
背景技術(shù)：
在過去的10年中，雖然藥物研發(fā)經(jīng)費(fèi)不斷增加，但實質(zhì)上藥物開發(fā)的產(chǎn)出卻在實質(zhì)性下降。我們認(rèn)為其中一個限制因素是目前生物技術(shù)和制藥工業(yè)上盛行的“單一藥物單一靶點的中心法則”。傳統(tǒng)藥物的設(shè)計是根據(jù)疾病體系中單一獨(dú)立的靶點進(jìn)行設(shè)計的，這是制藥工業(yè)中一個主要限制因素，因為疾病的發(fā)生往往是多樣性的，所以基于多位點、多因子的處理方式更易根治疾病。因此，基于多因素系統(tǒng)篩選新的互動藥物的方法已迫在眉睫。多種藥品在其他藥物的互動配合下，不但劑量可以降低而且會更加有效。這種互動藥物的思想再一次喚起人們關(guān)注天然產(chǎn)物的興趣。許多市場銷售的傳統(tǒng)藥物(包括中藥)在過去很長的歷史中證明具有高效和安全的療效，但是大部分的精力花費(fèi)在純化得到單分子，其藥物活性卻因為輔助因子分開而通常會喪失。非?？赡艿脑蚴嵌嘟M分在起作用而不是單組分。本專利申請的一個目的在于開發(fā)符合系統(tǒng)生物學(xué)思維模式，與定向靶向藥物互補(bǔ)的藥物發(fā)明的研究方法。這些來源于天然產(chǎn)物的互動藥物將增強(qiáng)現(xiàn)存藥物的療效，且有助于我們更好了解治療疾病的多種途徑。
現(xiàn)今尋找新的疾病相關(guān)的蛋白分子靶點推動著生物學(xué)研究和許多新藥開發(fā)，而不再是過去的“盲目亂試僥幸命中”的技術(shù)。運(yùn)用該模式，特定蛋白可以在體外、細(xì)胞和整個組織器官水平上被研究，用以評價是否可作為特定藥靶來治療某一特定疾病。過去“單一藥物單一靶點的中心法則”曾經(jīng)鑒定得到了許多針對特定蛋白的有效化學(xué)分子，這些化合物為生物學(xué)研究和藥物開發(fā)提供了有價值的試劑。例如最近FDA批準(zhǔn)的藥物——Avastin，就是根據(jù)結(jié)合和抑制腫瘤血管新生中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)設(shè)計得到的重組人源化抗體。
但是，在現(xiàn)實生理狀態(tài)下，疾病是受多基因控制的。因此同時控制疾病發(fā)生過程中的多途徑才能達(dá)到有效的治療，從而治愈疾病。系統(tǒng)生物學(xué)研究成果表明人的細(xì)胞和組織是復(fù)雜的、具有豐富的集中和發(fā)散的信號通路的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。例如根據(jù)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的多功能性，可以在信號通路中多個位點同時干涉。
更主要的一點是來源于天然產(chǎn)物的藥物發(fā)明模式。20世紀(jì)中正是由于使用微生物和植物次級代謝產(chǎn)物才使人類壽命延長1倍，減輕疾病痛苦并且革新藥物。很長一段時間，天然產(chǎn)物的比重是占目前市場上藥物的主要部分。這很大程度上歸功于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和臨床治療特異性。不幸的是正當(dāng)新的分析測試方法已經(jīng)建立和天然產(chǎn)物小分子化合物在檢測、鑒定和純化方面都有顯著進(jìn)展的時候，制藥公司紛紛遠(yuǎn)離天然產(chǎn)物的藥物發(fā)明模式。90年代早期組合化學(xué)公司曾嘗試用大量新的分子填補(bǔ)該空白，不幸的是采用化學(xué)的方法并不能創(chuàng)新出足夠多的變化或者制藥上有活性的分子。很顯然未來制藥工業(yè)的成功建立在多種技術(shù)互補(bǔ)基礎(chǔ)上如天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)、高通量篩選、遺傳學(xué)、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、組合生物合成以及組合化學(xué)。
就像生物體系具有豐富的集中和發(fā)散的多信號通路的網(wǎng)絡(luò)特點一樣，疾病癥狀也是由不同基因和通路的突變和干涉的逐步積累的結(jié)果。隨著生物技術(shù)的進(jìn)步以及生命體分子機(jī)理的闡明，多組分療法也已經(jīng)提上日程，制藥研發(fā)公司已經(jīng)開始轉(zhuǎn)向組合療法。Genentech公司將治療結(jié)腸癌的Avastin和靜脈內(nèi)氟尿嘧啶化學(xué)療法相結(jié)合治療結(jié)腸癌，并于2004年2月27日獲得美國FDA批準(zhǔn)；輝瑞公司將降膽固醇試劑atorvastatin和抗高血壓藥amlodipine besilate組合而成的復(fù)合物CADUET集中于一個藥丸，可以同時治療高血壓和高膽固醇，并于2004年2月2號獲得FDA批準(zhǔn)，該藥宣稱是第一個實現(xiàn)一個藥丸能同時治療兩種不同癥狀，因為其同時治療兩種不同的病，內(nèi)科醫(yī)生可以幫助病人減少其發(fā)展為心臟血管疾病的危險。臨床試驗的1600個病人中，大約有57％的病人血液和膽固醇達(dá)到其年齡段的正常值；近來，禮來公司也同樣轉(zhuǎn)向互動藥物，其產(chǎn)品Symbyax作為第一個治療抑郁癥的藥物已于2004年1月進(jìn)入美國市場，該藥物由Zyprexa和Prozac組成，其中Prozac幾年以前已經(jīng)失去專利保護(hù)權(quán)；另一個復(fù)合藥物在墨西哥已經(jīng)上市，即將進(jìn)入美國市場，該復(fù)合藥物不僅是由兩個藥物組成而且是由兩個不同的公司共同開發(fā)的，即Merck和Schering-Plough聯(lián)合開發(fā)新的藥物Vytorin，該藥物由2006年存在專利過期競爭的Merck高價銷售的降膽固醇藥物statin和Merck的腸胃藥組成。新產(chǎn)品Zetia顯著增強(qiáng)了降低膽固醇的活性。
配伍組合藥物并不是一個全新概念。來源于臨床上藥物精細(xì)組合的多組分療法，雖然有時妙手偶得、或經(jīng)推理設(shè)計而產(chǎn)生，但是歷史上已經(jīng)在醫(yī)藥許多領(lǐng)域如癌癥、傳染病、中樞神經(jīng)疾病，HIV雞尾酒療法等有成功的先例。根據(jù)Cutting Edge Information最新研究顯示，到2007年醫(yī)藥行業(yè)有800億美元的專利藥物將面臨期滿和無專利競爭壓力狀況，而尋找合適的組合藥物可能會成為新的武器來迎接挑戰(zhàn)。自1938年美國FDA正式實施功能以來，大約有5000單一藥物被證實安全且有效，并已獲得被FDA批準(zhǔn)進(jìn)入市場的(除非其是一個已有藥物的先導(dǎo)化合物)。
針對已知的藥物，該專利發(fā)明平臺加速了對新藥和新化合物的研發(fā)。制藥公司也可以利用此專利為即將期滿的專利注入新的生命。更重要的是該平臺允許制藥公司挽救藥物開發(fā)過程中因其毒性、耐藥性、臨床生物利用度等問題而被淘汰的藥物。允許制藥公司從現(xiàn)存的、有效的、臨床前開發(fā)的藥物中，重新進(jìn)行藥物篩選，進(jìn)行全面開發(fā)從而市場化。
系統(tǒng)生物學(xué)的方法可用來鑒定新的蛋白靶點和治療干涉的新途徑。許多市場化的傳統(tǒng)藥物可受益于該發(fā)明，傳統(tǒng)醫(yī)藥藥方大藥典中，傳統(tǒng)醫(yī)藥中的活性成分可以通過該發(fā)明中系統(tǒng)生物學(xué)的方法得到鑒定。該技術(shù)將會證實傳統(tǒng)醫(yī)藥的藥理，以上平臺也有助于自然界中藥物開發(fā)。20世紀(jì)中正是由于使用微生物和植物次級代謝產(chǎn)物才使人類壽命延長1倍，減輕疾病痛苦并且革新藥物。很長一段時間，天然產(chǎn)物的比重是占目前市場上藥物的主要部分。這很大程度上歸功于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和臨床治療特異性。不幸的是正當(dāng)新的分析測試方法已經(jīng)建立和天然產(chǎn)物小分子化合物在檢測、鑒定和純化方面都有顯著進(jìn)展的時候，制藥公司紛紛遠(yuǎn)離天然產(chǎn)物的藥物發(fā)明模式。90年代早期組合化學(xué)公司曾嘗試用大量新的分子填補(bǔ)該空白，不幸的是采用化學(xué)的方法并不能創(chuàng)新出足夠多的變化或者制藥上有活性的分子。很顯然未來制藥工業(yè)的成功建立在多種技術(shù)互補(bǔ)基礎(chǔ)上如天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)、高通量篩選、遺傳學(xué)、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、組合生物合成以及組合化學(xué)。
生物學(xué)和制藥上多點治療的潛能被認(rèn)識已經(jīng)有很久的歷史。早在1928年，Loewe觀察到并定量了化合物組合可達(dá)到超出預(yù)料的效果，該效果不同于單一組分的活性。在互動作用、疊加作用、拮抗作用等概念應(yīng)運(yùn)而生，特別是在藥理學(xué)、毒理學(xué)領(lǐng)域中。而且傳染病人和癌癥病人受益于共同用藥的化學(xué)療法。臨床實驗已經(jīng)證明在生理上使用配伍藥物具有提高治療效果的作用。雖然臨床上藥物混合已經(jīng)是一個很清楚的治療策略，而且已經(jīng)知道很多藥物配合能起到增效的作用，但是在臨床上用藥敏感不能擴(kuò)大藥物配比濃度適用范圍，只能在很小的范圍內(nèi)進(jìn)行藥量調(diào)整，很難測定藥物最佳配比濃度，同時臨床實驗也限制了藥物范圍，阻止其成藥可能性。因此，基于多因素原則建立藥物篩選的方法迫在眉睫。
CombinatoRx Inc.用2,000多種可獲得的藥物化合物，配伍形成2,000,000種組合形式進(jìn)行藥物篩選。近來報道一種安定藥和抗原蟲藥的組合藥物可以抑制小鼠腫瘤生長而它們單獨(dú)作用不表現(xiàn)抗腫瘤活性。這是個說明用單藥作用單靶位的用藥模式很難發(fā)現(xiàn)有這樣顯著療效生動的例子來。
除去這次成功，CombinatoRx Inc.的技術(shù)也有嚴(yán)重的限制。首先，他們的化合物庫只是來源于大約2000種藥物，因此他們的化學(xué)物多樣性受到限制，它們的靶位蛋白也有限，目前所有的藥物只作用120個靶位，而銷量最大的100種藥只作用43個靶位，而基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)為我們揭示了更多的疾病相關(guān)靶位；其次，他們的藥物配伍是盲目的和有缺陷的，他們的目的在于非顯著的組合但是現(xiàn)存藥物的作用機(jī)制優(yōu)勢卻未得到充分發(fā)揮，因此他們不得不做出許多初始決定并假設(shè)猜測，這些都會對科研方向和最終的結(jié)果產(chǎn)生影響；第三，兩個藥物的兩個變化因素很難達(dá)到良好的治療效果并且有很大潛在副作用的危險；最后，互動協(xié)同作用并不是他們最關(guān)注的。
本專利在以上基礎(chǔ)上更進(jìn)一步，充分利用現(xiàn)存藥物濃度，在低劑量上篩選尋找那些互動伙伴，用以補(bǔ)償、加強(qiáng)藥物效果。本專利應(yīng)用更加廣泛的藥物庫，具有無限的化合物多樣性；本專利充分利用已知藥物的分子作用機(jī)制而不是尋找非明顯的組合藥物；本專利不是采用現(xiàn)有的治療藥物的報道使用劑量，而是采用獨(dú)特的軟件和算法計算出亞最適劑量濃度，同時還應(yīng)用來指導(dǎo)劑型的調(diào)整；本專利采用了低濃度的藥物劑量，可以降低藥物的副作用，同時我們只關(guān)注互動表型。
發(fā)明總結(jié)本發(fā)明提供了在降低藥物副作用及其他不良特性的同時，加強(qiáng)已有藥物藥效的方法和藥物配方。本發(fā)明以抗真菌藥物——酮康唑作為一個例子，提供了能特異提高其藥效的方法和藥物配方，尤其在本發(fā)明中提供了高通量鑒定藥物的方法，并獲得了一個藥物。
互動是由于致敏、增強(qiáng)潛力或相互誘導(dǎo)。互動的混合藥物還具有其他優(yōu)勢，當(dāng)僅用以一個蛋白作為靶位的現(xiàn)有藥物時，需要較高的劑量才能起作用，還常常產(chǎn)生副作用，同時耐藥性問題也非常棘手；而“多藥多靶位途徑”可以降低每種藥物的劑量。本發(fā)明提供了一個篩選新的混合藥物的策略，這種混合藥物能增強(qiáng)現(xiàn)有“保命良藥”的藥效。
互動藥物的方法在抗癌和抗感染兩個方面進(jìn)行了嘗試?；旌退幬锘衔锉粦?yīng)用于雙組分藥物或多組分的篩選，結(jié)合有效地實驗策略和分析方法確定成分之間是否發(fā)生互動作用。確定一個混合物的所有配對組分的檢測系統(tǒng)首先，定義每個化合物在檢測體系中單獨(dú)作用時的活性；然后將這些化合物的所有配對組成分兩組(活性物質(zhì)和非活性物質(zhì))進(jìn)行測定。結(jié)合自動化篩選和信息系統(tǒng)，分別測定活性和非活性化合物，能夠有效地和完全地篩選全部配對組分。首先，對非活性化合物以單藥的形式進(jìn)行分組檢測(4個化合物一組)；然后，根據(jù)感興趣的活性，檢測活性組的特異配對組分，由于這些化合物中許多本身無活性，既然由兩個非活性物質(zhì)組成的活性組合是很罕見的，那么分組篩選會效率更高，不會因為活性重疊而造成混淆。本身具有可檢測活性的化合物(活性化合物)在單個濃度下，分組評價更加困難；最好是檢測一系列濃度去評價其活性轉(zhuǎn)變或其固有活性的增強(qiáng)。檢測每個活性化合物與所有其他化合物(包括活性的和非活性的)的相互關(guān)系，在劑量矩陣中每個化合物選用至少5個濃度(包括0)。
從天然產(chǎn)物中找到的酮康唑互動化合物白僵菌素(Beauvericin)為此概念提供了例證。在包括市售藥物的20,000多種被篩選的化合物中，白僵菌素活性最好，且被分離，詳述如下。這個采用所述的互動混合藥物是從天然產(chǎn)物中得到抗真菌藥物的例子，僅僅證明了從藥物或藥物候選物中篩選和鑒定互動混合藥物的方法的強(qiáng)大作用，但此發(fā)明在方向上和形式上不局限于此例。此篩選和鑒定方法可用于鑒定任何人類、植物或動物疾病的藥物候選物，鑒定已知藥物的互動作用，篩選來自文庫和其他來源的候選物。
圖表詳細(xì)描述

圖1、如圖1所示，此發(fā)明的技術(shù)平臺試圖為藥物開發(fā)渠道提供幫助，從而拯救那些專利將要過期的藥物或者由于安全問題而被廢棄的藥物。對于藥物A，通過算法能夠迅速算出一個遠(yuǎn)低于現(xiàn)有治療劑量的有效劑量。這種情況結(jié)合強(qiáng)有力的高通量篩選使尋找互動混合藥物成為可能，這些混合藥物能夠恢復(fù)或提高已知藥物A的藥效?；旌纤幬锟梢詠碜杂谝阎幬飵臁⒈惶蕴葘?dǎo)藥物、天然產(chǎn)物和合成化合物庫。
圖2、F101604與低劑量酮康唑的互動效果(X是抑制90％細(xì)胞生長的治療濃度)。樣品在頂上被標(biāo)記，均有至少三次重復(fù)。上格是在潮濕的培養(yǎng)箱中，35℃過夜培養(yǎng)的檢測板。中間格是用新鮮的MHB培養(yǎng)基再生的上格樣品。對上格樣品進(jìn)行熒光檢測，Ex為544nm，Em為590nm，并且在底格換算成生長抑制百分率。N陰性顏色對照，DMSO。P陽性顏色對照，Amphotericin B。
圖3、為了展示酮康唑/F101604組合對人類細(xì)胞沒有毒性，采用HepG2細(xì)胞作為替代系統(tǒng)，模擬其在人體中潛在的治療副作用。在96孔板中，每一個孔接種同樣數(shù)量的HepG2細(xì)胞。在CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24小時，檢測基于細(xì)胞活力的顏色。
圖4、為了達(dá)到更好去重復(fù)的目的，建立了一個結(jié)合了微生物遺傳多樣性和代謝多樣性的整合數(shù)據(jù)庫。
圖5、在與酮康唑互動篩選中得到的白僵菌素的化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定。
發(fā)明的詳細(xì)描述定義“藥物”FDA及其他國家的同等權(quán)威將“藥物”定義為有商業(yè)用途的藥。“藥物候選物”是指還沒有批準(zhǔn)的，但是具有能夠成為藥物的特征或跡象的化合物或蛋白質(zhì)。
“互動作用”是指兩個或更多試劑組合的效果遠(yuǎn)大于這些試劑單獨(dú)作用的總和，也就是1+1＞2?！隘B加作用”的意思是1+1＝2?！稗卓棺饔谩钡囊馑际?+1＜2。
“苗頭”意思是互動藥物候選物與已知藥物的亞最適劑量共同作用時，產(chǎn)生的活性為最大活性的70％-100％，當(dāng)其以檢測濃度單獨(dú)使用時活性很小。表1是典型的“苗頭”命中率。
“輔助藥物”一個或幾個化合物可以與低劑量的已知藥物發(fā)生互動作用來達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。
最低抑菌濃度(MIC)是指一個藥物達(dá)到抑制超過99％菌體的最低劑量。
表1在同一篩選中互動、疊加和拮抗樣品的典型“苗頭”命中率
強(qiáng)有力的系統(tǒng)的篩選和鑒定互動藥物的方法此發(fā)明是一個系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)新一代化合物的方法，以及能夠表示與低濃度的已知藥物的互動作用的算法(計算方法)。它起始于一個已知藥物或是一個由于毒性、溶解性、藥效或耐藥性等問題而被淘汰的先導(dǎo)藥物X。這個藥物可以是任何治療領(lǐng)域的藥物，例如癌癥、感染疾病、炎癥、糖尿病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等。然后構(gòu)建天然產(chǎn)物庫或者合成化合物庫(純化的或混和的)，包括核酸和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)。第三，建立功能檢測，包括生物化學(xué)、細(xì)胞、動物模型及臨床治療水平的檢測，然后確定藥物X亞最適劑量(最高活性的10％-40％)。在此條件下，采用高通量的方法，將庫中的化合物以濃度梯度進(jìn)行篩選，可得到0.1％-1％的“苗頭”命中率?；铀幬铩懊珙^”是指互動藥物候選物與已知藥物的亞最適劑量共同作用時，產(chǎn)生的活性為最高活性的70％-100％，當(dāng)其以檢測濃度單獨(dú)使用時活性很小。最后，中標(biāo)的混合藥物被純化和鑒定?；旌退幬锟赡苁羌兊暮铣煞肿踊騺碜曰旌匣衔飵臁⑻烊划a(chǎn)物庫或其他合成化合物庫。
此發(fā)明提供了一個篩選能夠促進(jìn)低劑量已知藥物的藥效的化合物的方法，包括(a)提供一個或者多個已知藥物或被淘汰的先導(dǎo)藥物；(b)建立天然產(chǎn)物和合成化合物的化合物庫；(c)建立功能分析方法，確定已知藥物或被淘汰的先導(dǎo)藥物的亞最適劑量；(d)用c步驟中的方法在不同的濃度梯度下篩選b步驟中的化合物庫；(e)對在化合物庫中能夠促進(jìn)已知藥物藥效的化合物進(jìn)行鑒定。就是說此發(fā)明提供了一個方法，但是并不局限于對化合物的近一步純化和鑒定。
此化合物庫包括但是并不局限于核酸或蛋白質(zhì)類的大分子。此發(fā)明中的方法可以使互動藥物先導(dǎo)化合物的中標(biāo)率達(dá)到0.1％-1％；并且能使混合藥物能夠在低濃度下使已知藥物的藥效提高10％-40％。
此發(fā)明的方法是基于生物化學(xué)結(jié)合檢測或酶活檢測的，這個檢測可以是細(xì)胞或者動物模型的生物學(xué)檢測。此發(fā)明中的方法在篩選步驟(d)中能夠?qū)崿F(xiàn)自動化操作；在鑒定步驟(e)中，能夠使用報告基因分析、cytoblot分析或顯微鏡檢分析等方法。
此發(fā)明步驟(c)的亞最適劑量是通過軟件和算法得到的，它被用來指導(dǎo)程序化操作。此發(fā)明中已知藥物的濃度降低到了能夠使用于篩選互動伴侶和先導(dǎo)化合物的細(xì)胞致敏的亞最適劑量。
此發(fā)明中篩選出來的化合物是未知的，并通過具體方法進(jìn)行鑒定。此發(fā)明得到的組成，包括通過上述方法鑒定出來的化合物，已知藥物或被淘汰先導(dǎo)藥物和可接受的藥劑載體。此發(fā)明中已知藥物的亞最適劑量是由上述方法確定的。此發(fā)明中組成，包括由上述方法決定的已知藥物或被淘汰的先導(dǎo)藥物的亞最適劑量和一個可接受的藥劑載體。
此發(fā)明中的環(huán)六酚縮肽白僵菌素(SZC-101)被鑒定為酮康唑的互動藥物。環(huán)六酚縮肽白僵菌素(SZC-101)作為酮康唑的互動藥物通過LC-MS-MS和NMR被鑒定，其結(jié)構(gòu)已確定。
此發(fā)明提供了一個藥物組成，包括上述組成和可接受的藥劑載體。此方明中的“可接受的藥劑載體”可以是任何標(biāo)準(zhǔn)的制藥載體。合適的載體包括但不限于任何標(biāo)準(zhǔn)制藥載體，例如磷酸緩沖鹽溶液和各種溶解試劑。對于片劑、顆粒劑和膠囊可以添加其他的載體。經(jīng)典的載體包括輔料淀粉、牛奶、糖；一定形態(tài)的粘塊、凝膠、硬脂酸；硬脂酸鎂或硬脂酸鈣等鹽類，滑石，植物油，橡膠，甘油及其他已知輔料，這些載體可以包括調(diào)味劑和顏色添加劑或其他配料。組成中的這些載體通過已知的常規(guī)方法來確定。
此發(fā)明采用具體的鑒定蛋白的方法或其他疾病相關(guān)的途經(jīng)確定化合物的使用。這個方法使我們對互動機(jī)制更加了解(1)用系統(tǒng)的生物方法，包括DNA或蛋白質(zhì)芯片，比對添加互動藥物和不添加互動藥物時的生物遺傳標(biāo)記、基因、蛋白質(zhì)的變化；(2)在存在或不存在低濃度藥物(例如酮康唑)的情況下，用siRNA技術(shù)，轉(zhuǎn)化一個真菌致病菌的siRNA文庫至待測真菌中。在酮康唑存在的情況下，受影響的基因被沉默。從上述檢測中得到的互動化合物能夠作為工具去研究某種蛋白質(zhì)和途徑，從而有利于對某種疾病的理解。SiRNA和其他方法可以用于研究互動機(jī)制。
運(yùn)算法則充分了解現(xiàn)存藥物的作用原理，并將已知藥物治療劑量顯著降低到最低有效劑量敏化和激化細(xì)胞用于互動篩選，這些對篩選互動伴侶試劑是必要的。這個發(fā)明揭示了一個運(yùn)算方法和一個高通量篩選方法?？梢詻Q定新藥研發(fā)篩選方法成功的兩個關(guān)鍵因素第一個因素是降低一個已知藥物用藥量；第二個因素是一個或多個合適的互動伴侶，它可以恢復(fù)或提升了已知藥物療效。用于篩選的化合物庫來自天然產(chǎn)物庫或合成化合物庫(純的或組合的)，包括核酸、蛋白質(zhì)等大分子化合物。這個化合物庫的化學(xué)多樣性事實上是無限的。高通量篩選方法是一個系統(tǒng)的、客觀不帶偏見的方法。
一系列在篩選中量化互動效果的運(yùn)算法則已被采用。比如，中值效果和等熱輻射分析有效地確定了一些組合，在這些組合中，一個藥物加強(qiáng)了另一個藥物的藥效。但這些模型并不適用于另一些組合，這些組合中一個藥物僅僅增強(qiáng)了另一個藥物的內(nèi)在活性。在臨床的和代謝動力學(xué)上，有效的組合相互作用可能改變藥效或者提高內(nèi)在活性。
三個標(biāo)準(zhǔn)參照模型被應(yīng)用于確定互動作用。HAS模型(最高單藥模型)是在混合物中，每一個成分在同樣濃度下能夠產(chǎn)生更大的效果。而Bliss互動模型，有時被稱為棋盤定量模型，可以預(yù)測由兩個成分的效應(yīng)A和效應(yīng)B產(chǎn)生的組合效應(yīng)CC＝A+B-A*B。在這里，每個抑制結(jié)果作為部分抑制的效果用0-1之間的數(shù)字表達(dá)。這些基于效果的互動模型不需假設(shè)對于劑量-反應(yīng)曲線的功能模型，所以不需要此篩選體系范圍之外的劑量-反應(yīng)信息。第三個模型，Loewe疊加模型，是通過組合指數(shù)來測定的，它是一種基于劑量的模型，并且僅僅應(yīng)用于單個組分的活性水平。我們基于對上述三種模型的討論，衍生出一個專有的運(yùn)算法則。它通過互動模型顯示出的較大抑制活性選出單個組分化合物，然后繼續(xù)研究。這些化合物通過更高密度的384孔板的重復(fù)性試驗以及其他的體內(nèi)和體外的試驗來驗證。
專有的運(yùn)算法則是一種上述3種算法的改良。首先，要找出兩種或更多的能提高藥理學(xué)性質(zhì)的活性組分。疊加藥物中一個組分對另一個組分的互動效應(yīng)過去容易被忽視。疊加藥物是指1+1＝2。而互動藥物是指1+1＞＞2。而專有算法可以應(yīng)用于拯救一些具有副作用的潛在藥物候選物，通過與其他組分結(jié)合，減小副作用，可以使現(xiàn)有藥物公司正在日益縮小的藥物研發(fā)庫存得到復(fù)蘇。
其次，這個發(fā)明的方法是為生產(chǎn)符合生產(chǎn)商和消費(fèi)者的共同利益的低成本藥物而設(shè)計的，購買力是重要原則之一。隨著化合物庫的增長，對互動藥物知識的了解也以指數(shù)增加，從而減少新藥研發(fā)的成本和時間。FDA對重要的生物技術(shù)藥物的研發(fā)規(guī)定有新進(jìn)展，因此從已被批準(zhǔn)的化合物中產(chǎn)生的新化合物，可以依賴最初研發(fā)這個化合物的公司的數(shù)據(jù)，從而提供了一個節(jié)省成本和迅速研發(fā)這類新藥的途徑。
為了證明這個概念，一個有效的吡咯類抗真菌藥物酮康唑和一個來自天然產(chǎn)物庫的天然產(chǎn)物粗提物F101604被用來作為一個例證。其中一個主要先導(dǎo)化合物成分已被鑒定。來自其他天然產(chǎn)物或者合成產(chǎn)物庫的先導(dǎo)化合物也已被鑒定。我們收集了已知藥物庫中大約有3,000種被證明安全有效并且獲得FDA市場前認(rèn)證的單分子藥物被用于測試。因為從這個庫中的命中率也許不夠，所以我們建立了自己的天然產(chǎn)物庫。我們已經(jīng)建立了的通過微生物多樣性構(gòu)建天然產(chǎn)物庫的方法，這種方法從以下三方面最大多樣化微生物天然產(chǎn)物庫(1)從多樣的生態(tài)系統(tǒng)中選擇和分離樣品，并根據(jù)其形態(tài)學(xué)和16s rRNA特性分離不同種類的微生物；(2)通過操控微生物的生理特性來激活微生物天然產(chǎn)物的產(chǎn)生；(3)改變的菌株的遺傳性狀來產(chǎn)生非自然的微生物天然產(chǎn)物。
通過運(yùn)用這三種方法，天然產(chǎn)物庫的多樣性可以最大化。因此，發(fā)現(xiàn)一個新化合物的機(jī)會也隨之增加。一個結(jié)合了的微生物遺傳多樣性和代謝多樣性的三維數(shù)據(jù)庫已經(jīng)建立(圖4)。一旦篩選出有效物質(zhì)，可以很容易的追溯其來源。這個數(shù)據(jù)庫幫助我們?nèi)コ呀?jīng)報道的有效藥物，并使我們的研究重點放在天然產(chǎn)物新的結(jié)構(gòu)和新的活性上。
我們以抗真菌藥物作為例證，原因如下真菌已成為第四大醫(yī)療血液傳染疾病，美國每年大約有90,000例嚴(yán)重感染病例，其中近40％的患者有生命危險；由于侵入性真菌感染和大量廣譜抗生素的使用導(dǎo)致免疫缺陷病人的數(shù)量逐年增加，所以對高效抗真菌藥物的需求也逐年增長。
另外，真菌感染已經(jīng)作為臨床死亡一個獨(dú)立因素。因為真菌對現(xiàn)存藥物抗藥性不斷提高，現(xiàn)存有效抗真菌藥物種類較少，正在研發(fā)的藥物也非常有限，所以現(xiàn)在迫切的需要研究抗真菌藥物的新方法。微生物復(fù)雜的生化調(diào)控體系為發(fā)現(xiàn)嶄新抗感染藥物提供了開門匙，嶄新的抗感染藥物能選擇性削弱微生物細(xì)胞，不危害人類細(xì)胞。比較基因組學(xué)恰恰提供了大量只存在于真菌中的必需基因。
許多研究組和公司利用這些基因產(chǎn)生的蛋白作為特殊的靶點來篩選新型藥物。然而微生物經(jīng)歷38億年的進(jìn)化，已經(jīng)產(chǎn)生了因必需基因被破壞后的備用代謝機(jī)制，并且具有了應(yīng)對多種因生境變化帶來危害的能力，不幸的是，它們持續(xù)的進(jìn)化正在超出現(xiàn)存抗感染藥物的能力范圍。
抗真菌試劑市場是增長最迅速的市場之一，世界每年大約有50億美元的銷售額，其中用于系統(tǒng)治療真菌疾病的費(fèi)用大約30億美元。目前超過100家的公司正致力于抗真菌藥物的研發(fā)。大部分現(xiàn)存的抗真菌試劑僅能抑制真菌并不能根本地消除真菌，這還導(dǎo)致了真菌產(chǎn)生耐藥性。治療耐藥性真菌費(fèi)用比治療敏感性真菌高且更加困難。那些對真菌具有致死作用的藥物，往往具有很高的毒性，經(jīng)常導(dǎo)致對腎、肺的破壞及一系列的其他副作用，這些毒副作用往往影響治療的延續(xù)性。另外，大部分作為治療系統(tǒng)真菌感染的藥物，口服生物利用率低、效果差。因此，我們迫切的需要發(fā)現(xiàn)新的化合物來解決這些逐步出現(xiàn)的問題。
理想的抗真菌藥物應(yīng)具備如下特征具有口服和靜脈注射兩種用藥方式；具有涵蓋酵母狀和絲狀真菌的廣泛的抗菌譜；在體外具有殺死真菌的活性；表現(xiàn)良好的藥物代謝分布，最小限度的藥物相互作用；對抗藥性穩(wěn)定；具有很好的組織穿透性(包括中樞神經(jīng)系統(tǒng))；副作用小，成本低。不幸的是，目前為止通用的抗真菌治療方式還沒有一種能滿足上述大部分特點。例如Amphotericin B(兩性霉素B)兩性霉素B是多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，1956年被發(fā)現(xiàn)，是當(dāng)時唯一能治療系統(tǒng)真菌感染有效的藥物，所以一度被認(rèn)為抗真菌治療的黃金標(biāo)準(zhǔn)。它作用方式，主要是選擇性的結(jié)合真菌細(xì)胞壁的特有組分麥角固醇，從而改變了細(xì)胞壁的成分，抑制了細(xì)胞壁形成，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。兩性霉素B具有很廣泛的抗真菌效果，但是不得不注意兩性霉素B還具有很強(qiáng)的毒性，能產(chǎn)生一系列副作用，其中腎毒性是最嚴(yán)重的副作用，必須采取間斷性治療。高燒、胃病、嘔吐、貧血、肌痛等副作用癥兆發(fā)生在50％的采用兩性霉素B進(jìn)行治療的病人身上?，F(xiàn)在以脂質(zhì)類物質(zhì)為介質(zhì)的用藥方式能降低兩性霉素B一定的毒副作用，但是這種用藥方式提高了治療成本，限制了應(yīng)用。
Azole(吡咯類)fluconazole(氟康唑)、itraconazole(伊曲康唑)、ketoconazole(酮康唑)吡咯類藥物通過抑制細(xì)胞色素P450將landosterol轉(zhuǎn)化為麥角固醇，從而抑制了真菌細(xì)胞壁固醇和其他壁脂質(zhì)的合成，最終導(dǎo)致細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破壞細(xì)胞死亡。每種吡咯類藥物都有各自不同的抗菌譜。例如，氟康唑?qū)η诡愓婢鸁o效，對假絲酵母類真菌有一定效果，對隱球菌屬具有很好治療效果；伊曲康唑雖然在不同病人和與其他藥物聯(lián)合使用時藥效變化較大，但是它具有廣泛的抗菌譜，涵蓋了其他吡咯類藥物抗菌范圍，而且副作用最小。酮康唑臨床對肝毒副作用很大，但是它是最有效的治療慢性的及頑固的地方性真菌感染的藥物。
Allylamines(丙烯胺類藥物)這類藥物的主要成員就是terbinafine(特比萘芬)，這類藥物通過抑制鯊烯環(huán)氧酶起作用。鯊烯環(huán)氧酶是合成麥角固醇途徑中另一個重要的酶，所以這類藥物同吡咯類藥物作用具有相關(guān)性。這類化合物具有很好的親脂性，能在皮膚、指甲和脂肪層積累。特比萘芬有口服和霜劑兩種用藥方式。特比萘芬口服藥物是在1991年在英國研制出來，1996年在美國進(jìn)行臨床應(yīng)用。
Flucytosine(氟胞嘧啶)氟胞嘧啶是一種嘧啶類似物，影響在真菌中DNA的合成。氟胞嘧啶的活性譜有限，而且單獨(dú)使用容易產(chǎn)生抗藥性，因此它經(jīng)常和兩性霉素B配合使用。這種聯(lián)合用藥對臨床上其他藥物難以治療的髓膜炎念珠菌具有顯著效果。氟胞嘧啶具有毒性，經(jīng)常會引起粘膜炎和骨髓抑制，這些病對于已經(jīng)免疫缺陷的病人來說是非常危險的，非常容易受到感染。
其他的抗真菌藥物還包括制霉菌素、乙酸卡泊芬凈、伏立康唑，但都有各自的局限性。
多組分治療，源自臨床經(jīng)過長期積累的用藥方式，經(jīng)過一些隨機(jī)的藥物搭配起到良好的治療效果，在藥物領(lǐng)域也有成功的歷史，比如，在癌癥、傳染性疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂和HIV雞尾酒療法等。我們致力于尋找下一代具有互動效果的由低用量已知藥物組合而成的藥物。低藥物用量不僅解決了藥物溶解的問題和一些其他性質(zhì)方面的問題，同時能將藥物安全使用劑量降到安全范圍內(nèi)。研發(fā)步驟包括(a)建立一個已知藥物或棄用藥物的化合物庫；(b)建立一個包括天然產(chǎn)物和合成的純化或混合的化合物庫，包括大分子物質(zhì)，如蛋白質(zhì)核酸；(c)建立一個方法用于測定和計算用于互動藥物的亞最佳使用劑量；(d)在此基礎(chǔ)上，篩選上述化合物庫，按照0.1％-1％的檢出率選出具有互動效果的化合物；(e)檢測或計算被測組分的配比(通常藥物聯(lián)合使用能發(fā)揮出70％-100％的最大活性，而單獨(dú)使用時在該低濃度下只能有非常微弱的活性效果)；(f)純化和確認(rèn)組合藥物的組分。組合藥物可以是超過兩個組分。
互動藥物替代了傳統(tǒng)的利用提高用藥濃度來提高藥物活性，它通過降低藥物使用濃度，篩選能互動增效的輔助藥物，提高了藥物的應(yīng)用潛能。而互動藥物的每個組分在低濃度單獨(dú)使用時可能不表現(xiàn)任何活性。為了證明上述概念，我們從天然產(chǎn)物庫中篩選出了能與酮康唑(一種吡咯類抗真菌藥物)互動增效的抗真菌的天然產(chǎn)物粗提物F101604，并且其中一個主要的先導(dǎo)化合物已經(jīng)確認(rèn)并分離純化出來。
因此，本專利發(fā)展出一種發(fā)現(xiàn)藥物的新方法，這種方法符合系統(tǒng)的生物學(xué)思維模式，彌補(bǔ)了以靶點為基礎(chǔ)的藥物篩選方法。這些具有互動效果的聯(lián)合藥物增強(qiáng)現(xiàn)存藥物的療效，且有助于我們更好了解治療疾病的多種途徑。我們已經(jīng)給出了一個由新的天然產(chǎn)物配合低濃度酮康唑獲得更好的抗真菌效果的發(fā)現(xiàn)實例。
通過下面的例子能更好的理解這項發(fā)明。實例中每項特殊的方法和結(jié)果后面都配有詳細(xì)的說明以供理解。
例子1自90年代中期引入高效抗逆轉(zhuǎn)錄酶病毒療法(HAART)以來，HIV抗真菌藥物市場發(fā)生了巨大的變化。在高效抗逆轉(zhuǎn)錄酶病毒療法出現(xiàn)之前，AIDS和HIV相關(guān)疾病的機(jī)會感染以驚人的速度增長，頻繁的反復(fù)發(fā)作的真菌感染很常見，這就需要進(jìn)行長期的預(yù)防性治療，使得醫(yī)生們對抗真菌藥物的耐藥性有了廣泛的關(guān)注，假絲酵母對吡咯類藥物的耐藥性不斷增強(qiáng)，引起了HIV專家和研究人員的極大關(guān)注。他們認(rèn)為，這個問題解決的關(guān)鍵是未能滿足對HIV病人真菌治療的需要。免疫力下降的病人容易重復(fù)感染，需要長期治療，從而導(dǎo)致對吡咯類藥物的耐受。由于HAART療法的出現(xiàn)，HIV感染的病人免疫力重建能力得到增強(qiáng)，機(jī)會感染已經(jīng)下降了60-80％。然而，對HAART療法的抗性的出現(xiàn)也是不可避免的。目前，那些通過一次HAART治療無法治愈的病人，也可以通過進(jìn)行第二、三和四次治療成功治愈。
然而，對于HAART治療的抗性是常見的。臨床醫(yī)師估計，到一定時候，10-30％的病人會出現(xiàn)對抗逆轉(zhuǎn)錄酶病毒治療的抗性現(xiàn)象，這樣病人就需要改變療法或使用其他藥物。如果抗逆轉(zhuǎn)錄酶病毒藥物的新藥開發(fā)不能持續(xù)補(bǔ)償HAART療法缺陷的話，機(jī)會感染很有可能再次卷土重來。而預(yù)知何時會發(fā)生這種情況是非常困難的，但是在未來的幾十年中，這個問題將是影響HIV市場最重要的因素，進(jìn)而影響到抗真菌藥物市場的需求。而且，如果新的抗真菌藥物有特殊療效而取得更廣泛的應(yīng)用，那將會影響到未來抗真菌藥物市場的份額。另外，真菌感染對于一些非HIV病人也有很高的危險性，例如癌癥病人，器官移植的病人等，假絲酵母的耐藥性是個主要的問題。
這就需要尋找更安全更有效的抗真菌藥物。因為真菌細(xì)胞的藥物靶位與哺乳動物細(xì)胞中的相似，所以一些高效抗真菌藥物，如兩性霉素B和吡咯類藥物(如氟康唑，伊曲康唑和酮康唑)就存在著毒性問題氮唑類藥物抑制14-去甲基羊毛甾醇的合成；在真菌和哺乳動物中細(xì)胞色素P450酶對于膽固醇合成是至關(guān)重要的，氮唑類藥物也是許多細(xì)胞色素P450反應(yīng)的有效抑制劑，因此這些抑制劑是研究哺乳動物的細(xì)胞生物學(xué)有用的工具；兩性霉素B攻擊血漿薄膜中的固醇，對腎臟有害處。另外，近幾年，白色念珠菌對于氮唑類藥物的耐藥性也逐漸增強(qiáng)。白色念珠菌是最重要的人類真菌病原菌。尤其是，白色念珠菌引起免疫缺陷病人的口腔念珠菌病和全身念珠菌病，以及引起婦女的外陰陰道念珠菌病(VVC)。念珠菌病在HIV感染病人中是非常重要的問題，其中84％的病人表現(xiàn)出由假絲酵母菌引起的口咽感染；外陰陰道念珠菌病傳播廣泛，已經(jīng)成為一個嚴(yán)重的問題，據(jù)聯(lián)邦疾病控制中心統(tǒng)計，在美國，大約75％的婦女在她們的一生中至少患過一次外陰陰道念珠菌病，40％患過兩次，約5％的婦女會反復(fù)感染。綜上所述，這些數(shù)據(jù)顯示了白色念珠菌感染在醫(yī)學(xué)和經(jīng)濟(jì)的重要性。
酮康唑普遍被用來治療假絲酵母感染。然而，在臨床用藥的劑量上，它與包括肝炎在內(nèi)的毒副作用有關(guān)。除此之外，耐藥菌伴隨長期治療或預(yù)防性治療出現(xiàn)，導(dǎo)致需要使用高濃度的藥物。
所用的被測試真菌菌株是近平滑假絲酵母ATCC 22019，它是引起免疫缺陷性個體嚴(yán)重機(jī)會感染的人類致病菌。所用的天然樣品是微生物發(fā)酵的粗提物。我們分離到很多來自世界各地多種生態(tài)環(huán)境下的微生物，在不同的生理培養(yǎng)基中被培養(yǎng)，從而產(chǎn)生多樣化的天然產(chǎn)物庫。
液體和固體兩種獲得粗提物的方法被采用。對于液體發(fā)酵的樣品，首先離心將菌體與發(fā)酵液分離，大約40毫升/瓶，將上清液倒入另一個50毫升離心管中；然后在沉淀的菌體中加入20毫升的甲醇，而在上清中加入約2毫升HP20樹脂處理，兩管均置于振蕩器上振蕩1個小時；將處理后的HP20樹脂和菌體表面的甲醇上清液混合，然后過夜?jié)饪s干燥；其后用雙蒸水沖洗HP20樹脂，除去高極性的化合物，再用9∶1丙酮/水洗脫；樣品充分干燥后，用100％DMSO溶解；樣品稀釋20倍后，進(jìn)行篩選。對于固體樣品，首先加40毫升的甲醇浸泡過夜；然后，在上清中加入2毫升HP20樹脂混合，其他步驟與液體樣品的處理一樣。
準(zhǔn)備用于篩選的母板，使用的天然產(chǎn)物是100倍稀釋；測試菌近平滑假絲酵母(ATCC22019)在Mueller-Hinton(MH)肉湯基上進(jìn)行培養(yǎng)；菌液(104/毫升)加入到MH肉湯和Alamar的藍(lán)色染料(生物目錄數(shù)字號DAL1100)的混合液內(nèi)以及伴隨0.01X倍酮康唑(X是抑制90％的真菌細(xì)胞生長的生理學(xué)濃度)的加入和缺失；在96孔測試板中每孔加入0.08毫升。
用96孔進(jìn)樣復(fù)制器取2微升稀釋了20倍的天然提取物到培養(yǎng)好細(xì)胞的96孔板中。按照美國國家臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)(NCCLCS)對所有的實驗進(jìn)行了重復(fù)。試驗板在一定濕度下，35℃過夜培養(yǎng)；熒光檢測Ex 544nm和Em 590nm。當(dāng)天然產(chǎn)物樣品本身沒有抗菌活性的時候，篩選其與酮康唑的互動活性。
天然產(chǎn)物粗提物F101604被確定為有互動效果的活性物質(zhì)。圖1A上面的圖顯示測試板在潮濕的培養(yǎng)箱35℃培養(yǎng)過夜，將等量的近平滑假絲酵母、培養(yǎng)基和Alamar藍(lán)色染料加到每個孔中。上面顯示的是樣品重復(fù)的治療效果。陽性對照(P)含有抗生素兩性霉素B，殺死了所有的細(xì)胞，顏色呈藍(lán)色，其熒光讀數(shù)定義為100％的生長抑制。為了測試真菌病原菌是被殺死還是生長被抑制，取上述測試板中呈陽性結(jié)果的培養(yǎng)液2微升加入到含有Alamar藍(lán)色染料的新鮮MH肉湯培養(yǎng)基中，再一次置于潮濕的培養(yǎng)箱35℃培養(yǎng)過夜。結(jié)果顯示，如圖1上面所示。如果顏色變紅，說明病原菌仍然生存，其模式是抑制；如果顏色變藍(lán)，說明病原菌被殺死，其模式是致死。陰性對照(N)僅加了DMSO，定義為0％的生長抑制。
酮康唑的單獨(dú)作用濃度在0.01X只抑制了20％的生長，作用模式是抑制。單獨(dú)用F101604粗提物檢測，沒檢測到其對酵母病原菌有抑制作用。當(dāng)酮康唑在1X濃度檢測時，抑制了90％的菌生長。然而，酮康唑在0.01X濃度和F101604的混合作用時獲得了95％抑制效果(比酮康唑1X的濃度效果要好)，作用的模式是致死，顯示兩個組份具有互動效果而非疊加效果。
因此，本發(fā)明在于開發(fā)符合系統(tǒng)生物學(xué)的思維模式，與定向靶向藥物互補(bǔ)的研究。這種互動藥物提高了現(xiàn)成藥物的療效，使我們能更好的理解多途徑治療疾病，給出的例子是用新的天然產(chǎn)物配合低濃度的酮康唑獲得更好的抗真菌療效?；又委熖岣吡送颠虻乃幮瑫r降低了其副作用以及藥物抗性問題，這個互動藥物概念的證實，給予許多治療領(lǐng)域藥物研發(fā)技術(shù)平臺以希望和潛力。
例子2藥物組合鑒定本專利將現(xiàn)有已知的藥物與一個或多個藥學(xué)上適當(dāng)?shù)妮d體相結(jié)合，為獸用和人類醫(yī)學(xué)上用藥提供藥物配伍或組合的方法。更重要的是，這種藥物的配伍可以在更低的劑量時發(fā)揮更好的療效，同時減少副作用。載體介質(zhì)必須是藥學(xué)上可用的，而且與配方中的其他組分互不反應(yīng)，對服用者無害。
經(jīng)16s rDNA測序分析，活性物質(zhì)的產(chǎn)生菌株被鑒定為鐮刀霉菌(Fusarium proliferatum)。通過以下的純化步驟，我們從培養(yǎng)液中分離純化了這種天然活性產(chǎn)物1.每個發(fā)酵瓶中加入100毫升丙酮，共有36個發(fā)酵瓶。
2.振蕩以打碎塊狀物并持續(xù)作用至少4小時。
3.從丙酮溶液中過濾除去生物基。
4.用適當(dāng)大小的容器收集所有的生物基并加入2升丙酮提取2小時。
5.過濾并合并二次的丙酮提取物。
6.在真空條件下蒸發(fā)去除丙酮(剩余大約500毫升)7.加入500毫升的蒸餾水8.用MEK(1∶1)溶液萃取上述的1升分離物，重復(fù)萃取一次9.分別將MEK萃取物濃縮至干燥狀態(tài)。
10.儲存于冰箱中。
經(jīng)對鐮刀霉菌培養(yǎng)液混合物的LC-MS-MS和NMR研究分析，活性物質(zhì)被確認(rèn)為一種六元環(huán)狀α肽類物質(zhì)白僵菌素(白僵菌素(Beauvericin(SZC-101))
白僵菌素(Beauvericin)是一種微生物毒素，該類物質(zhì)被定義為“真菌的次級代謝產(chǎn)物，若通過異常途徑攝入，在低濃度時即對脊椎和其他動物存在有毒害作用”。這些化合物通常是非揮發(fā)性的，并且可能儲存于孢子和生長菌絲中或分泌到生長環(huán)境中。許多微生物毒素的毒性作用機(jī)制包括從不同角度干擾細(xì)胞代謝過程，產(chǎn)生神經(jīng)毒性，致癌或致畸作用。其他有毒的真菌代謝物如環(huán)胞霉素，可以對細(xì)胞免疫系統(tǒng)表現(xiàn)較強(qiáng)而獨(dú)特的毒性作用，故被用于免疫抑制劑。
為了表明酮康唑/F101604結(jié)合使用對人類細(xì)胞無毒害作用，我們采用HepG2細(xì)胞作為替代系統(tǒng)來模擬在人體內(nèi)潛在的治療副作用。正如臨床報道的那樣，我們發(fā)現(xiàn)酮康唑在100和50ug/ml濃度下存在毒性，然而F101604和25ug/ml酮康唑都不會對人的肝臟細(xì)胞造成傷害(Fig2)。
我們從遺傳學(xué)和形態(tài)學(xué)方面對真菌菌株F101604進(jìn)行了鑒定，通過活性追蹤的分離純化，從F101604的粗提物中分離得到兩個不同的化合物。在抑制近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis)的生長方面，這兩個化合物都與0.01X酮康唑表現(xiàn)出極大的互動作用。從Sigma。公司定購了商業(yè)化的標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品白僵菌素也證實了這種活性作用。這種協(xié)同用藥的抗真菌活性在文獻(xiàn)中還未見報道。
該活性物質(zhì)的協(xié)同作用是普遍存在還是某一類抗真菌藥物的特例呢？弄清楚這一點非常重要。所以我們將研究分析推廣到其他的常用的抗真菌藥物中，如氟康唑(Fluconazole)，依曲康唑(Itraconazole)，兩性霉素B(Amphotericin B)，氟胞嘧啶(Flucytosine)，科賽斯(Cancidas)，伏立康唑(Voriconazole)和特比萘芬(Terbinafin)。測試結(jié)果顯示似乎白僵菌素對于吡咯類藥物具有特殊的協(xié)同作用。
除了已報道的前期數(shù)據(jù)結(jié)果中用到的近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis ATCC22019)我們還采用了其他病原真菌，包括白色念珠菌(Candida albicans ATCC 90028)，光滑假絲酵母(Candida glabrata ATCC 90030)，克柔假絲酵母(Candida Krusei(Issatchenkiaorientalis)ATCC 6258)，曲霉菌(Aspergillus fumigatus ATCC 46645)，啤酒酵母(Saccaromyces cerevisiae ATCC 2601)，新生隱球菌(Cryptococcus neoformans ATCC14116)。將Beauvericin與酮康唑配伍擴(kuò)大了酮康唑?qū)Ω鞣N病原真菌抗菌譜。
另一個重要方面是測試互動藥物對耐藥性病原真菌的抑制效果。我們使用了臨床耐藥性分離的菌株包括從ATCC和其他生物醫(yī)藥研究所得到的各種野生型和突變型菌株。這些菌株的亮點在于對其耐藥作用機(jī)制人們已經(jīng)有了較為清楚的認(rèn)識，包括細(xì)胞膜上外排機(jī)能泵的基因過量表達(dá)，如多藥耐藥蛋白基因MDR1和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(CDR1 and CDR2)以及目的酶ERG11基因的過表達(dá)或發(fā)生了突變。從前期的數(shù)據(jù)中我們發(fā)現(xiàn)，針對那些已經(jīng)對氟康唑產(chǎn)生了耐藥性的臨床分離菌，采用具有互動作用的藥物配伍能夠極大的改善酮康唑的作用效果。
免疫缺陷病毒(HIV)感染人群中日益表現(xiàn)出的問題是病原性的酵母菌——白色念珠菌(Candida albicans)對唑類藥物的耐藥性。統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明從AIDS患者體內(nèi)分離到的超過33％的分離菌株，其氟康唑的最低抑制濃度至少是標(biāo)準(zhǔn)易感菌的3倍以上。我們從華盛頓大學(xué)的Theodore C.White博士實驗室購買了一株臨床分離的氟康唑耐藥株#17(SZP-17)。我們從F101604的天然產(chǎn)物混合物中分離純化了生物活性物質(zhì)SZC-101，該物質(zhì)與酮康唑在病原真菌抑制方面具有互動作用。通過培養(yǎng)液微量稀釋，酮康唑在有或沒有SZC-101配伍時的抗真菌活性進(jìn)行分析可以確定酮康唑的最低抑制濃度。
表II顯示了添加SZC-101到酮康唑中所表現(xiàn)出的極大的互動作用。正與前人所報道的那樣，SZP-17對酮康唑和氟康唑表現(xiàn)出交叉耐藥性而不耐兩性霉素B(數(shù)據(jù)未給出)。酮康唑與具有互動效應(yīng)的SZC-101一起作用，可對產(chǎn)生臨床耐藥菌SZP-17具有較好的抑制效果。添加2微克/毫升的SZC-101可使酮康唑的活性可增強(qiáng)200倍。表II SZC-101的添加量對酮康唑抑制臨床耐藥菌SZP-17的最低抑制濃度(MIC)的影響(單位微克/毫升)
其他二期測試分析包括檢測藥物的血清結(jié)合活性，對哺乳動物細(xì)胞毒性分析等，分析活性物質(zhì)的各種性質(zhì)對于今后的深入研究非常重要。
我們也測試了動物模型上互動用藥方法與單獨(dú)用藥的臨床對比。我們從中分離得到的新化合物可作為一種與DNA(RNA)芯片或蛋白芯片相結(jié)合的分析手段，可用于確認(rèn)新基因和途徑，解碼復(fù)雜遺傳通路控制的疾病過程。繪制微生物細(xì)胞通路圖譜將為更好的治療提供有效的細(xì)胞模型。以下幾個方面給出了互動作用的可能作用模式1)耐藥酶的抑制因子微生物產(chǎn)生的酶可以通過破壞抗生素分子的結(jié)構(gòu)從而使其失活，這是抗性的主要作用機(jī)制。這些酶能被分泌到周圍環(huán)境中，例如，葡萄球菌分泌青霉素酶，這種酶能使青霉素失活；或者被分泌到外周胞質(zhì)間隙，例如，綠膿桿菌分泌頭孢菌素酶，該酶可以降解頭孢他啶。這種耐藥性可以通過抑制降解性酶與特定抗生素結(jié)合而得到克服。這樣，抗生素就能被保護(hù)起來，例如，Augmentin(阿莫西林和克拉維酸)。
2)膜屏障增強(qiáng)因子抗生素不能到達(dá)靶點目標(biāo)原因通常是抗生素難以穿越細(xì)胞壁，不能進(jìn)入周質(zhì)間隙或者細(xì)胞質(zhì)中。因此，能夠提高這些膜屏障滲透性的復(fù)合物就能增強(qiáng)藥物的活性，例如，慶大霉素能提高腸球菌對β內(nèi)酰胺制劑的滲透性。
3)多藥耐藥泵的抑制因子微生物膜上的泵能夠轉(zhuǎn)移或者泵出細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的抗生素。通過抑制這些泵的作用也可以協(xié)同性的增強(qiáng)藥物的活性。許多這種抑制因子已被發(fā)現(xiàn)，但市場上還沒有進(jìn)行銷售。酮康唑與SZC-101配合使用抑制了染料流出體外——這是協(xié)同效應(yīng)的一種作用模式。為了測試SZC-101和酮康唑在SZP-17菌株上的多藥耐藥泵的抑制作用，我們做了染料流逝實驗。首先單獨(dú)或配伍使用2微克/毫升SZC-101和0.04微克/毫升酮康唑?qū)ZP-17培養(yǎng)物進(jìn)行32℃ 30分鐘預(yù)處理，然后用熒光染料若丹明G在32℃處理1小時。沖洗培養(yǎng)物，在沒有藥物存在下讓細(xì)胞恢復(fù)。通過測定真菌細(xì)胞中殘留的熒光性復(fù)合物可知化合物是否可以阻止染料流逝。在染料消逝實驗中，SZC-101和酮康唑單獨(dú)使用時只有很小的作用，而復(fù)合使用時，在染料消逝作用上卻具有極強(qiáng)的作用(數(shù)據(jù)未列出)。這個結(jié)果證明了兩種藥物配伍使用時能有效的作用于膜上的泵，而單獨(dú)使用時則沒有這種效應(yīng)。
4)其他互動作用途徑互動篩選是一種新的用于確定天然產(chǎn)物或合成藥物庫中可以配伍的藥品的方法，它們可能由上面提到的或者是完全新穎的機(jī)制運(yùn)作。
互動篩選提供了幾種化合物的最佳配伍比率。通過以下途徑可更好的測試和理解互動效應(yīng)的機(jī)制1)利用系統(tǒng)生物學(xué)方法，包括DNA或蛋白質(zhì)微芯片的方法，來比較在互動藥物存在與否時遺傳生物標(biāo)記、基因或蛋白質(zhì)發(fā)生了哪些顯著的改變。2)使用小分子RNA干擾技術(shù)，在某個藥(例如酮康唑)低濃度存在與否時，將一個病原真菌的siRNA庫轉(zhuǎn)移到待測真菌中。在低濃度酮康唑存在情況下，效應(yīng)基因遇到特異性的siRNA表達(dá)將會死亡。
現(xiàn)在常用的藥物通過降低其劑量以及與其他化合物配伍可改進(jìn)其療效。由于常用藥有明確的藥物性質(zhì)備案，對其作用模式也有較好的認(rèn)識。所以使FDA更易于評估藥物組合的療效。本專利中具有互動作用的藥物可讓我們更好的了解真菌作用機(jī)制。這能使現(xiàn)有藥物更有效，也有利于我們更好的多途徑治療疾病。
除了在抗感染疾病中的實例驗證了概念，我們還測試了一些與抗癌，心血管病，抗炎癥，和其他紊亂失調(diào)方面有關(guān)的藥物。本專利提供了一種新的方法去確定天然產(chǎn)物或者合成藥物庫中的輔助成分藥物，它們可以由上面提到的或是全新的機(jī)制來發(fā)揮作用。
通過上述的互動藥物篩選來確定某種天然產(chǎn)物是一種殺真菌劑，而這僅僅只是證明了互動藥物篩選的方法在篩選和確定藥物及其互動組分時是非常強(qiáng)大有效的一個例子，但并沒有限制任何別的方法或形式的發(fā)明。在確診任何人類，植物和動物疾病或在其他經(jīng)適當(dāng)分析的情況下，以及確定對于治療某種疾病的藥物互動作用從庫或其他資源里篩選互動組分，這種篩選和確定藥物的方法都是非常有用的。
抗真菌互動藥物的臨床前試驗部分是用免疫缺陷型老鼠和經(jīng)系統(tǒng)傳播的念球菌感染模型。
盡管歷來采用死亡作為研究這種類型試驗的終點，但這個終點判定已不再適合現(xiàn)在的動物研究時代。為了嘗試修改研究方案使之與當(dāng)今時代標(biāo)準(zhǔn)一致，我們采用了由T.E.Hamm所建議使用的方法。(被提議制度上關(guān)心動物，對于嚙齒類動物研究采用規(guī)定指示的致死方法作為實驗終點，美國實驗動物協(xié)會今日議題.1995；3469-71)盡管這些實驗可能導(dǎo)致死亡，但通過利用以下這些途徑，我們會盡最大努力減少動物疼痛和痛苦的持續(xù)時間1)我們派實驗組中訓(xùn)練有素并在識別動物生病的征兆和反常行為方面有豐富經(jīng)驗的成員，每天(包括周末和假期)監(jiān)控動物3次，時間分別在上午9點，中午12點以及下午5點。這種監(jiān)控時間表超過了最初Hamm博士所建議的一日兩次的方法。此外，如果發(fā)現(xiàn)老鼠有疼痛，抑郁或者死亡的跡象，這種監(jiān)控會更加的頻繁。
2)看起來似乎有明顯變化的動物，它們的姿態(tài)(例如，非正常的姿態(tài)或者將頭埋進(jìn)腹部)，皮毛，眼睛和/或者鼻子的分泌物，呼吸或運(yùn)動將與群居下情況大不相同。我們不會給與這些動物止痛劑，因為這可能會出現(xiàn)藥-藥交互作用，并且它對研究結(jié)果的影響也是未知的。取而代之的是，我們會在離動物居住處很遠(yuǎn)的地方對其進(jìn)行頸部脫臼，使它暴露在CO2環(huán)境下，無痛苦的死去。
死亡率這個術(shù)語將用于作為這個研究的終點；然而，需要明確理解的一點是，我們將盡最大努力減小動物的疼痛和痛苦，而且，如果觀察到動物將自然地屈服于感染時，我們會在這之前對其實行安樂死以達(dá)到減少它們痛苦的目的。
a.動物從單個合法賣主獲得的無特定病原，雌性ICR級小鼠，重量大約在23-27克之間，在實驗整個過程中使用。在做活體實驗前的一個星期，這些動物將會用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，以適應(yīng)實驗需要。
b.抗真菌類藥藥劑將從SynerZ醫(yī)藥品公司在數(shù)量上得到充分的補(bǔ)給，以完成實驗大綱的需要。此外，SynerZ公司會在貫穿研究過程中，在解決維持研究的連貫性所做準(zhǔn)備之前，提供穩(wěn)定的，分散的及公式化的數(shù)據(jù)。我們將直接從廠商處獲得抗真菌類藥物的標(biāo)準(zhǔn)對照——fluconazole?？拐婢悘?fù)合物將以腹膜內(nèi)注射形式來給藥。
c.菌種研究所用菌種為單一的白色假絲酵母(ATCC 36082)或者由SynerZ公司提供的臨床藥抗菌種。
d.易感性測試測試有機(jī)體所用的所有復(fù)合物的最小抑制濃度將參照SynerZ公司所提供的固定標(biāo)準(zhǔn)NCCLS微稀釋技術(shù)。
e.急毒實驗給藥和藥物評估我們用合適手段準(zhǔn)備一連串測試復(fù)合物的兩部稀釋，這樣，在0.2毫升體積稀釋下，將產(chǎn)生跨越廣泛范圍濃度的劑量。每個測試復(fù)合物將用5種劑量來進(jìn)行評估。這5個測試用的劑量的選擇將通過與SynerZ公司的進(jìn)一步協(xié)商所決定。
i.每個測試復(fù)合物(與低劑量標(biāo)準(zhǔn)對照fluconazole復(fù)合)用5種劑量，每個劑量用5只小鼠，5個復(fù)合物(共125只小鼠)。
ii.測試復(fù)合物用腹膜內(nèi)注射給藥。
iii.對照組(5只小鼠)接受與積極治療組相同給藥途徑的手段，0.2毫升治療劑和fluconazole的非最佳理想劑量。
iv.臨床觀察直到研究終點96小時后，動物會被每天觀察3次，看是否有藥物相關(guān)的發(fā)病的信號或者充血現(xiàn)象出現(xiàn)。
v.計算所需小鼠每個測試復(fù)合物的治療組+對照組＝130只小鼠。
f.確認(rèn)研究在感染之前，通過腹膜內(nèi)注射環(huán)磷酰胺4天(150mg/kg)和接種前注射1天(100mg/kg)致使小鼠嗜中性白血球減少。測試有機(jī)體將在沙氏瓊脂糖培養(yǎng)基上次培養(yǎng)，35℃ 24小時。一組小鼠(5個一組)用0.1ml 106CFU/ml，懸浮于溫暖鹽水中的接種體通過側(cè)面尾部脈絡(luò)進(jìn)行感染。由早先的研究所提出的方法，這種接種體可穩(wěn)定再生的感染。在重復(fù)實驗中，最終候選菌種將證實感染。計算所需小鼠(5個小鼠/組×1個接種體×重復(fù)實驗)＝每個菌種10只小鼠。
g.定量效率研究為每個單獨(dú)或者復(fù)合使用的復(fù)合藥物，比較評估治療后感染小鼠腎中的真菌密度的治療功效。在24小時期間，每個復(fù)合物6-8個劑量組將用于每組3個小鼠的研究。對照組小鼠將接受自由輔藥互動作用手段，與治療組相同劑量。一組非治療對照組將在治療開始前和所有治療組治療末期完成后處死，以確定感染建立。在用吸入CO2致死后，小鼠的腎降被切除，在消毒后的0.9％鹽水中鋪成均勻分布的顆粒。將均勻混合物的連續(xù)稀釋液接種于SDA上，35℃孵育24小時后，數(shù)出存活真菌數(shù)。
1.感染培養(yǎng)先前所描述的測試有機(jī)體一夜后，得到接種體懸浮液，取0.1毫升從側(cè)面尾部脈絡(luò)注入到23-27克重小鼠中。
2.給藥劑量選擇決定于基于初步毒性研究所確定的最大忍受劑量。每個的標(biāo)準(zhǔn)對照(fluconazole)和測試復(fù)合物用6-8個治療組來測試。最終劑量組將與發(fā)起人協(xié)商后決定。
3. 24[每個劑量3只小鼠*8個組*1個標(biāo)準(zhǔn)對照(fluconazole)]只小鼠將在接種后2小時由腹膜內(nèi)注射給藥。
4. 120[每個劑量3只小鼠*8個組*5個測試復(fù)合物]只小鼠將在接種后2小時由腹膜內(nèi)注射給藥。
5. 72[(30小時對照+324小時對照)*12套測試組]只小鼠被用作對照。治療組的數(shù)量由及時處理每個實驗的一定體積的樣品能力所決定?；谶@些樹目，每個復(fù)合物的8個治療組分為兩套(每套4個)。
6.總共需要小鼠216只。
h.數(shù)據(jù)分析樣本大小沒有計算急毒實驗用樣本大小的預(yù)先估價，因為這些研究在以前沒有做過，樣品大小用5，是與工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)相協(xié)和的，因為這能為初步評估測試藥物提供足夠的信息。
定量培養(yǎng)部分的樣品是按以下方法來計算的1)典型的抗微生物劑最佳給藥量組通常使真菌密度產(chǎn)生大約減少2-3log，2)為了使觀察平均數(shù)背離真實平均數(shù)不超過1SD，使用兩邊95％獨(dú)立間隔有80％可能性，需要6個數(shù)據(jù)點。用我們提議的方法，每個動物的腎臟組織中將產(chǎn)生兩個數(shù)據(jù)點。
定量培養(yǎng)研究24小時后，通過治療組小鼠腎中真菌密度的改變與開始的對照組小鼠對比，計算功效。組織中的真菌密度改變用log10 CFU的變化來表示，所有治療和非治療的小鼠用描述統(tǒng)計學(xué)報導(dǎo)。每個復(fù)合物包括標(biāo)準(zhǔn)對照構(gòu)造log10CFU對抗菌劑劑量的曲線。數(shù)據(jù)將適合用Emax模型來決定50％有效劑量。單獨(dú)藥劑和復(fù)合藥劑的效力(真菌濃度的改變)將用合適的統(tǒng)計學(xué)測驗來處理。
權(quán)利要求
1.該專利是為篩選能與已知藥物，相互作用并增強(qiáng)其療效，從而降低藥物臨床劑量的化合物而開發(fā)的方法，這項發(fā)明包括(a)先確定幾種現(xiàn)在臨床上使用的或已經(jīng)被淘汰的先導(dǎo)藥物；(b)構(gòu)建多個具有多樣性的天然產(chǎn)物或合成化合物庫；(c)建立一個已知藥物或被淘汰先導(dǎo)藥物亞最適劑量的功能性檢測分析方法；(d)采用c步中所建立的檢測方法，檢測及篩選b步中所構(gòu)建的天然產(chǎn)物或合成化合物庫中各化合物在不同濃度下與已知藥物或被淘汰先導(dǎo)藥物相互作用的活性；(e)確定一種或者更多種具有增強(qiáng)已知藥物療效的化合物。
2.權(quán)利要求1中提出的方法，也包含對所確定的化合物的純化方法。
3.權(quán)利要求1中提出的方法，化合物庫中不僅包括小分子化合物同時也包括大分子化合物，例如蛋白質(zhì)、核酸以及SiRNA庫。
4.權(quán)利要求1中提出的方法，互動先導(dǎo)化合物的檢出命中率是0.1％-1％。
5.權(quán)利要求1中提出的方法，互動藥物指能增強(qiáng)已知藥物在亞最適劑量時的療效，k可達(dá)到最大療效劑量的10％-40％。
6.權(quán)利要求1中提出的方法，檢驗系統(tǒng)包括任何生物化學(xué)結(jié)合試驗，酶學(xué)檢驗等。
7.權(quán)利要求6中提出的方法，檢驗系統(tǒng)可以是基于任何細(xì)胞或動物模型基礎(chǔ)上的生物檢驗。
8.權(quán)利要求6中提出的方法，檢測系統(tǒng)可以應(yīng)用任何疾病模型的臨床試驗。
9.權(quán)利要求1中提出的方法，篩選步驟d可以是應(yīng)用任何人工的或機(jī)械手來完成。
10.權(quán)利要求1中提出的方法，探測系統(tǒng)e可以是通過報告基因分析，cytoblot分析和顯微分析等方法來完成。
11.權(quán)利要求1中提出的方法，步驟(c)中亞最適劑量的確定使用了軟件及其運(yùn)算法則。
12.權(quán)利要求10中提出的方法，亞最適劑量用于指導(dǎo)配伍設(shè)計。
13.權(quán)利要求10中提出的方法，已知藥物的劑量被降低到亞最適劑量時可加強(qiáng)細(xì)胞用于篩選互動伴侶或先導(dǎo)化合物的敏感度。
14.權(quán)利要求1-12中提出的方法，所篩選的化合物系未知或未曾應(yīng)用此方法鑒定而被報道。
15.對權(quán)利要求13中的化合物進(jìn)行確認(rèn)。
16.組成成分包括如何在權(quán)利要求1-12中的方法所確定的化合物、已知藥物或被淘汰的先導(dǎo)藥物及合適的藥劑載體。
17.已知藥物的亞最適濃度的確定需采用權(quán)利要求1-12中的任何方法。
18.組成成分包括采用權(quán)利要求1-12中任何方法所鑒定的亞最適濃度時的已知藥物或被淘汰的先導(dǎo)藥物及合適藥劑載體。
19.環(huán)六酚羧肽Beauvericin(SZC-101)被鑒定為一個酮康唑和其他唑類藥物的互動藥物。
20.藥物組成成分或配伍藥劑劑型包括權(quán)利要求15中的組分。
21.通過權(quán)利要求1-3中的方法所確定的化合物，可用于鑒別與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)及其路徑。
全文摘要
這項發(fā)明為挖掘可以與低劑量已知藥物產(chǎn)生互動作用的新一代化合物或配伍提供了一個有力的系統(tǒng)方法。選用已知的藥物或被淘汰的先導(dǎo)藥物被用作參照物，然后建立一個包括核酸、蛋白質(zhì)等大分子的天然產(chǎn)物或合成化合物(純的或混合的)庫。通過建立包括生物化學(xué)的、基于細(xì)胞、動物模型以及臨床治療在內(nèi)的活性檢測分析方法和確定參照物(10％－40％最大活性的)亞最適劑量，按照0.1％－1％的檢出率進(jìn)行高通量地篩選不同濃度下的天然產(chǎn)物或合成化合物庫。被鑒定為具有互動作用的候選物必須在與已知藥物的亞最適劑量的結(jié)合后能增強(qiáng)已知藥物最大活性70％－100％的活性。最后，被檢測到的具有互動作用的輔助藥物將繼續(xù)被純化和鑒定，最終從天然的或合成的混合物庫中分離純化出單一成分的互動藥物。
文檔編號A61K31/70GK1968685SQ200480034073
公開日2007年5月23日 申請日期2004年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月19日
發(fā)明者張立新 申請人:張立新