一種枯草芽孢桿菌與解淀粉芽孢桿菌的區(qū)分方法
【專利摘要】一種枯草芽孢桿菌與解淀粉芽孢桿菌的區(qū)分方法，它涉及一種相近芽孢桿菌的區(qū)分方法。方法：一、獲取待鑒定芽孢桿菌CheA基因；二、與已知枯草芽孢桿菌與解淀粉芽孢桿菌模式菌株的CheA基因進(jìn)行同源性比較，同源性低于80％的為異種芽孢桿菌。本發(fā)明方法通過CheA基因區(qū)分枯草芽孢桿菌與解淀粉芽孢桿菌，方法簡單、準(zhǔn)確。
【專利說明】
-種枯草芽抱桿菌與解淀粉芽抱桿菌的區(qū)分方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種相近芽抱桿菌的區(qū)分方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 1970年Colwell提出的多相分類(Polyphasic taxonomy)方法是區(qū)分微生物領(lǐng)域 各級(jí)分類單元的最有效的手段，也更客觀反應(yīng)生物間自然系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的分類方法。該分 類方法數(shù)據(jù)和信息有3種類型類:分別是表型、基因型和系統(tǒng)發(fā)育型。表型信息包括:培養(yǎng)形 態(tài)、生理生化指標(biāo)、細(xì)胞壁化學(xué)組成和憐酸類脂、釀、全細(xì)胞脂肪酸等細(xì)胞化學(xué)的分析，還有 全細(xì)胞可溶性蛋白電泳及核糖體蛋白圖譜共8類;基因型信息來自于對細(xì)胞核酸分子的分 析，GC含量測定、核酸雜交、限制性片段長度多態(tài)性、隨機(jī)擴(kuò)增DNA片段多態(tài)性的分析等;而 系統(tǒng)發(fā)育信息責(zé)是采用一些特定的基因片段作作為分析對象，運(yùn)些基因就是系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記 (Phylogenetic Markers)。用編碼蛋白質(zhì)基因作為系統(tǒng)發(fā)育基因越來越得到行業(yè)內(nèi)的認(rèn) 同，系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記是表示遺傳關(guān)系的標(biāo)識(shí)，應(yīng)用不同的標(biāo)記再結(jié)合其它分類信息可W將細(xì) 菌的遺傳關(guān)系及分類單元確定到種、屬、科等不同的等級(jí)。
[0003] 芽抱桿菌(Bacillus. SP)是革蘭氏陽性菌的一種，因?yàn)檠勘U菌屬的菌株具有易 于培養(yǎng)和儲(chǔ)存的諸多優(yōu)點(diǎn)，比其他微生物菌種更適用于生物防治領(lǐng)域研究。特別是枯草芽 抱桿菌和解淀粉芽抱桿菌已經(jīng)被證明可產(chǎn)生促進(jìn)植物生長作用的赤霉素和嗎I噪乙酸，胞外 植酸酶物質(zhì)，幾下質(zhì)酶和抗真菌多膚，應(yīng)用于農(nóng)作物可顯著提高作物產(chǎn)量。
[0004] 枯草芽抱桿菌和解淀粉芽抱桿菌屬于形態(tài)特征相似的芽抱桿菌屬，具有很近的親 緣關(guān)系，致使很早W前人們將解淀粉芽抱桿菌稱為枯草芽抱桿菌的亞種，在1967年Welker 等人研究，確定解淀粉芽抱桿菌是獨(dú)立的有效物種之一。正是因?yàn)榭莶菅勘U菌與解淀粉 芽抱桿菌為近緣菌種，僅僅通過生理生化反應(yīng)和leSrRNA技術(shù)，甚至包括應(yīng)用梅里埃的API 菌種鑒定條都不能有效區(qū)分，因此傳統(tǒng)的菌株分類方法受到了挑戰(zhàn)，急需更具分辨力的技 術(shù)來進(jìn)行枯草芽抱桿菌和解淀粉芽抱桿菌的分類鑒定工作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明為了解決現(xiàn)有菌株分類方法難W分辨枯草芽抱桿菌和解淀粉芽抱桿菌的 問題，而提供的一種枯草芽抱桿菌與解淀粉芽抱桿菌的區(qū)分方法。
[0006] 本發(fā)明枯草芽抱桿菌與解淀粉芽抱桿菌的區(qū)分方法按W下步驟進(jìn)行：
[0007] 一、獲取待鑒定芽抱桿菌化eA基因；
[000引二、與已知枯草芽抱桿菌與解淀粉芽抱桿菌模式菌株的畑eA基因進(jìn)行同源性比 較，同源性低于80%的為異種芽抱桿菌。
[0009] 本發(fā)明方法通過化eA基因區(qū)分枯草芽抱桿菌與解淀粉芽抱桿菌，方法簡單、準(zhǔn)確。
[0010] 化eA基因廣泛存在于芽抱桿菌體內(nèi)，并W單拷貝的形式存在于芽抱桿菌活體內(nèi)。 化eA基因具備一定的長度，而且被精確測序。
[0011] 本發(fā)明W化eA基因?yàn)橄到y(tǒng)發(fā)育基因標(biāo)識(shí)，具有非常優(yōu)良的辨識(shí)度，能夠準(zhǔn)確的區(qū) 分枯草芽抱桿菌和解淀粉芽抱桿菌。
【附圖說明】
[0012]圖1是實(shí)施例1模式菌株比對點(diǎn)陣分析圖。
[OOK]圖視實(shí)施例1模式菌株比對結(jié)果圖。
[0014] 圖3是根據(jù)Bacillus subtilis subsp.subtilis 8化.168的QieA基因構(gòu)建的系統(tǒng) 發(fā)育樹。
[0015] 圖4是根據(jù)Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum st;r.FZB42的QieA基 因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 本發(fā)明技術(shù)方案不局限于W下所列舉【具體實(shí)施方式】，還包括各【具體實(shí)施方式】間的 任意組合。
【具體實(shí)施方式】 [0017] 一:本實(shí)施方式枯草芽抱桿菌與解淀粉芽抱桿菌的區(qū)分方法按W下 步驟進(jìn)行：
[0018] 一、獲取待鑒定芽抱桿菌化eA基因；
[0019] 二、與已知枯草芽抱桿菌與解淀粉芽抱桿菌模式菌株的畑eA基因進(jìn)行同源性比 較，同源性低于80%的為異種芽抱桿菌。
【具體實(shí)施方式】 [0020] 二：本實(shí)施方式與一的不同點(diǎn)是：步驟二中選 Bacillus subtilis subsp.subtilis str. 168作為已知枯草芽胞桿菌的模式菌株；選 Bacillus amyloliquefaciens subsp.plan1:a;rum st;r.FZB42作為已知解淀粉芽抱桿菌的 模式菌株。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一相同。
[0021] Bacillus subtilis subsp.subtilis 8化.168全基因組登陸號(hào)為GI:728882887; Bacillus amyloliquefaciens subsp .plantarum str.FZB42，全基因組登錄號(hào)為GI: 154350369。
[0022] 實(shí)施例1
[002；3]本實(shí)施例采用BLASTN 2.2.30 +比對模式菌株（Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168和Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum str.FZB42) 基因組的16SrRNA、Gyr A、GyrB、CheA和GroEL基因之間的同源性。
[0024] 本實(shí)施模式菌株比對點(diǎn)陣分析(Dot Matrix View)圖如圖1所示。模式菌株基因之 間同源性測試結(jié)果如表1所示。模式菌株比對分析結(jié)果如圖2所示。
[0025] 表 1 rm,"
[0027]圖 1 和圖2顯示Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168與Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum str.FZB42之間有區(qū)別，80%的核酸具同源性，另外 20%的序列在兩種菌株中存在明顯差異，進(jìn)一步證明枯草芽抱桿菌和解淀粉芽抱桿菌應(yīng)分 屬不同的種。
[0028] 經(jīng)過比對枯草芽抱桿菌與解淀粉芽抱桿菌兩個(gè)模式菌株的五條基因（leSrRNA、 GyrA、GyrB、CheA和GroEL)中CheA基因的同源性最低為77%，適合用于區(qū)別、鑒定枯草芽抱 桿菌與解淀粉芽抱桿菌。而枯草芽抱桿菌與解淀粉芽抱桿菌的leSrRNA同源性最高達(dá)到 99%，無法對兩種菌加 W區(qū)分。
[0029] 實(shí)施例2
[0030] W美國國立生物技術(shù)信息中屯、網(wǎng)站GenBanK數(shù)據(jù)庫中存儲(chǔ)的枯草芽抱桿菌與解淀 粉芽抱桿菌菌株為對照菌株進(jìn)行驗(yàn)證。
[0031 ]采用I3LASTN2.2.30+在線軟件分別比較Bacillussubtilissubsp.subtilis 8化.168與GenBank數(shù)據(jù)庫中Bacillus amyloliquefaciens基因的同源性，W及Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum str.FZB42與GenBank數(shù)據(jù)庫中Bacillus subtilis 的同源性。比對基因?yàn)?個(gè)，16SrRNA、Gyr A、GyrB、CheA和GroEL。
[0032] 比對結(jié)果：
[0033] l、Bacillus subtilis subsp.subtilis s1:;r. 168與GenBank數(shù)據(jù)庫中Bacillus amyloliquefaciens的 16sRNA序列同源性均在99% W上。Bacillus amyloliquefaciens subsp. plan1:a;rum str.FZB42與GenBank數(shù)據(jù)庫中Baci 1 lus subti 1 is的 16sRNA序列同源性 均在99% W上。
[0034] 2、Bacillus subtilis subsp.subtilis s1:;r. 168與GenBank數(shù)據(jù)庫中Bacillus amyloliquefaciens的GyrA基因序列同源性在81 %~87%，GyrB基因同源性在79%~82%， Gro化基因同源性在93 %~98 %，CheA基因同源性在68 %~77 %。
[0035] 除了Bacillus subtilis strain Bs-916、Baci 1 lus subtilis strain ATCC 19217、Bacillus subtilis strain B-1 和Bacillus subtilis strain ATCC 13952之外， Bacillus amyloliquefaciens FZB42與GenBank數(shù)據(jù)庫中Bacillus subtilis的GyrA基因 序列同源性在81%~83%，GyrB基因同源性在78%~82%，Gro化基因同源性在92%~ 99%，畑eA基因同源性在70%~77% oBacillus amyloliquefaciens FZB42與Bacillus subtilis strain Bs-916、Bacillus subtilis strain ATCC 19217和Bacillus subtilis strain B-1 的GyrA、GyrB、CheA和GroEL基因序列同源性均達(dá)到99% ;Bacillus amyloliquefaciens FZB42與Bacillus subtilis strain ATCC 13952的GyrA、GyrB、CheA 和GroEL基因序列同源性達(dá)到了95%~96%。分析認(rèn)為Bacillus subtilis strain Bs- 916、Bacillus subtilis strain ATCC 19217、Bacillus subtilis strain B-1和 Bacillus subtilis strain ATCC 13952菌種分類有誤，運(yùn)也說明原有枯草芽抱桿菌與解 淀粉芽抱桿菌區(qū)分和分類不準(zhǔn)確。
[0036] 經(jīng)過實(shí)施例1和2的比對獲知枯草芽抱桿菌與解淀粉芽抱桿菌的leSrRNA基因不能 用于區(qū)分兩種芽抱桿菌，而兩種芽抱桿菌的Gro化基因同源性也相對較高，因此leSrRNA基 因和Gro化基因都無法對枯草芽抱桿菌和解淀粉芽抱桿菌做出區(qū)分。兩種芽抱桿菌的GyrA 和Gy巧基因同源性雖然在78%~82%左右，但是考慮兩種模式菌株基因組同源性為80%， 并不適合作為枯草芽抱桿菌和解淀粉芽抱桿菌的區(qū)別。
[0037] 兩種芽抱桿菌的化eA基因同源性低，能夠準(zhǔn)確的加 W區(qū)分。分別根據(jù)枯草芽抱桿 菌化eA基因和解淀粉芽抱桿菌化eA基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3和圖4所示。上述結(jié)果 顯示，用Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 和 Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum str.FZB42的CheA基因在不限定物種的前提下進(jìn)行BLAST分析比對分析 并繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，NCBI數(shù)據(jù)庫中枯草芽抱桿菌168的化eA基因相似性均達(dá)到92% W上，尤 其是完成基因組測序的枯草芽抱桿菌相似性可達(dá)到95%，多數(shù)菌株相似性為100%，與解淀 粉芽抱桿菌最高相似性為76%，最低為70%。解淀粉芽抱桿菌FZB42的化eA基因與數(shù)據(jù)庫中 解淀粉芽抱桿菌相似性均達(dá)到95 % W上，與枯草芽抱桿菌相似性為71 %~78 %。兩種模式 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹也可W看到，分別W兩條化eA基因分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，解淀粉芽抱桿 菌和枯草芽抱桿菌分屬于不同分支，且芽抱桿菌屬內(nèi)的短小芽抱桿菌（Bacillus pumilis)、地衣芽抱桿菌（Bacillus licheniformis)、莫哈韋芽抱桿菌（Baci 1 lus mo javensis)、萎縮芽抱桿菌（Bacillus atrophaeus)、凝結(jié)芽抱桿菌（Bacillus coagulans)和巨大芽胞桿菌(Bacillus megaterium)均處于獨(dú)立分支范圍，可見QieA基因 在芽抱桿菌屬內(nèi)具有非常高的辨識(shí)度。通過W上結(jié)果可W證明應(yīng)用化eA基因完全能夠區(qū)分 枯草芽抱桿菌和解淀粉芽抱桿菌。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種枯草芽孢桿菌與解淀粉芽孢桿菌的區(qū)分方法，其特征在于該方法按以下步驟進(jìn) 行： 一、 獲取待鑒定芽孢桿菌CheA基因； 二、 與已知枯草芽孢桿菌與解淀粉芽孢桿菌模式菌株的CheA基因進(jìn)行同源性比較，同 源性低于80%的為異種芽孢桿菌。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種枯草芽孢桿菌與解淀粉芽孢桿菌的區(qū)分方法，其特征在 于步驟二中選Bacillus subtilis subsp.subtilis str. 168作為已知枯草芽胞桿菌的模 式菌株；選Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum str.FZB42作為已知解淀粉芽 孢桿菌的模式菌株。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK106048072SQ201610685753
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月18日
【發(fā)明人】趙曉宇, 王佳龍, 于沖, 沙長青, 孟利強(qiáng)
【申請人】黑龍江省科學(xué)院微生物研究所