一種微生物碳氮磷硫元素功能基因的高通量檢測引物及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種微生物碳氮磷硫元素功能基因的高通量檢測引物及檢測方法。所述引物序列如SEQ ID NO:1?142所示，其中SEQ ID NO:1和2為一對上下游引物，SEQ ID NO:3和4為一對上下游引物，以此類推，SEQ ID NO:141?142為一對上下游引物。應用該辦法的引物、試劑盒或芯片用于微生物碳氮磷硫元素功能基因的高通量定量檢測，可實現多種微生物碳氮磷硫功能基因的同步化檢測、使不同基因得以在同一擴增條件下進行檢測，提高檢測效率；檢測精度高，可以檢測低至0.001％的目的基因；保留了熒光定量PCR檢測的高靈敏度和準確度，同時具有芯片檢測的高通量反應的優(yōu)點，降低了檢測成本，結合其他理化數據或微生物指標，可以分析當前生境下的碳氮磷硫元素循環(huán)的情況及其影響因素。
【專利說明】
-種微生物碳氮磯硫元素功能基因的高通量檢測引物及檢測 方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明設及生物技術領域，尤其設及一種微生物碳氮憐硫元素功能基因的高通量 檢測引物及檢測方法。
【背景技術】
[0002] 微生物是自然界碳氮憐硫元素循環(huán)的主要驅動力，通過定量檢測微生物碳氮憐硫 的功能基因，可W綜合分析不同生境下碳氮憐硫循環(huán)的整體水平及其影響因素，為環(huán)境健 康和影響評價提供基因水平上的有力證據
[0003] 然而，目前很少有設及微生物碳氮憐硫功能基因的特異性引物設計，一方面源于 科學界對微生物驅動碳氮憐硫元素循環(huán)認識的缺乏，另一方面源于同一功能基因在不同微 生物中表現出多態(tài)性，增加了引物設計的難度。現公開的功能基因引物專利都是用來檢測 功能細菌的，例如檢測氨氧化古菌(CN201510185444)和聚憐菌(CN201310042881)，它們分 別對氨氮氨單加氧酶A基因和聚合憐酸鹽激酶基因設計特異性引物，并用傳統(tǒng)的實時巧光 定量PCR方法進行定量檢測。盡管該方法具有高靈敏度和準確度，但由于不同的特異性引物 自身長度、堿基比例、擴增片段的大小不同，進行PCR反應時所需的退火溫度、延伸時間、擴 增程序也不同，例如，用于氨氧化古菌檢測的PCR擴增程序為95°C變性453、54°(：退火1111^、 72°C延伸Imin，而用于聚憐菌的檢測的PCR擴增程序為95°C變性40s、A°C退火lmin、72°C延 伸2min(其中A與它設計的5個特異性引物有關，分別為61、58、61、66和63°〇，因而難^設計 多種不同的功能基因，并使其在同一條件下進行擴增檢測。隨著越來越多的微生物功能需 要研究，就需要有可W同時檢測多種微生物功能基因的方法。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供微生物碳氮憐硫元素功能基因的高通量定量檢測引物，可 用于同步、平行和高效檢測的高通量定量檢測微生物碳氮憐硫元素功能基因的方法。
[0005] 為實現上述目的，本發(fā)明提供一種微生物碳氮憐硫元素功能基因的高通量定量檢 測引物，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO: 1-142所示，其中SEQ ID NO: 1和2為一對 上下游引物，SEQ ID N0:3和4為一對上下游引物，W此類推，SEQ ID NO: 141-142為一對上 下游引物。
[0006] 另外一方面，本發(fā)明還提供一種一種微生物碳氮憐硫元素功能基因的高通量定量 檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含有權利要求1的引物。
[0007] 另外一方面，本發(fā)明還提供一種一種微生物碳氮憐硫元素功能基因的高通量定量 檢測忍片，其特征在于，所述忍片含有所述引物或所述試劑盒中的引物。
[000引另外一方面，本發(fā)明還提供一種用于微生物碳氮憐硫元素功能基因的高通量定量 檢測方法，其特征在于，步驟為，
[0009] 提取DNA樣品；
[0010] PCR擴增:采用所述引物或所述試劑盒中的引物或所述忍片進行PCR擴增;所述對 照引物為沈Q ID NO :143-144;
[0011]
[0012]
[OOU] 其中，CN為基因豐度，RA為相對豐度，CNcnps為碳氮憐硫功能基因的豐度，CNi6s為 16S rRNA的豐度；
[0014] 進一步，所述PCR擴增的程序為，95°C預變性5min; 95°C，30s，40個循環(huán);62°C，30s 退火，72°C，30s延伸，最后從72°C開始升溫至97°C，升溫速率為4°C/s，W每0.4°C -個測量 點對引物的溶解曲線進行測定。
[001引表1引物相關倍島表
[0016]




[0021]
[0022] DM樣品的制備
[0023] 本方法適用于各類環(huán)境樣本的DM。使用區(qū)城〇扣乂《±壤0魁提取試劑盒(MP生物醫(yī) 藥，美國）提取±壤樣品DNA，每個樣品需0.5-1.0邑±壤，其余類型環(huán)境樣本請采用對應的提 取試劑盒按說明書進行提取。DNA質量用化no化op ND-2000分光光度計(賽默科技，美國）測 定的OD260/280值來確定，數值在1.6-1.9之間表示0麻可用。0麻濃度使用〇113〇1!下!〇山'"雙鏈 DNA試劑盒(普洛麥格，美國）進行測定，一次功能基因定量至少需要有10微升30ng/化的DNA 樣品。
[0024] 忍片的制備
[0025] 本方法采用多樣品納米分配器(WaferGen生物系統(tǒng)，美國）對引物和DNA樣品在 Smad^ip納米忍片(Waf erGen生物系統(tǒng)，美國）上進行分配，其中忍片共有72 X 72個納米 孔，可支持5184個巧光定量PCR反應。本方法采用80個引物X64個樣品的方案進行巧光定量 PCR檢測。需要準備的材料為20皿ol/L的牛血清白蛋白水溶液、2塊Nunc?384無酶孔板(賽 默科技，美國）、技oche?Li曲t切cler 480DNA SYBR Green I Mix(羅氏制藥，美國）、去除核 酸的PCR級高純水(羅氏制藥，美國）和Wafe巧巧?忍片試劑盒。
[00%] 引物分配前，預先制備PCR反應液1(混合69化化ight切cler 480DNA SYBR Green I Mix和41化L高純水），之后按照圖1所示，在384孔板中前6列的相應位置分別加入12.1化 PCR反應液I和3.化L引物混合液。同樣地，DNA樣品分配前，預先制備PCR反應液II (混合61化 LLi曲t切cler 480DNA SYBR Green I Mix、122化牛血清白蛋白水溶液和24化L高純水），之 后按照圖2所示，在384孔板中前4列的相應位置分別加入12.9化PCR反應液II和3.化L DNA 樣品，一個忍片反應最多可支持64個DNA樣品。
[0027] 開始分配時，選擇mRNA表達分析模式，選擇MyDesign下的80個引物和64個樣品分 配方案，并進行樣品分配。分配過程為自動化操作過程。引物和樣品分配后都需要將忍片離 屯、，第一次離屯、為3300轉/minx 5min，第二次離屯、為3300轉/minx 15min。離屯、完的忍片貼 膜后等待PCR檢測。
[002引高通量巧光定量PCR檢測
[00巧]高通量巧光定量PCR檢測器為Smad^ip實時PCR系統(tǒng)(WaferGen生物系統(tǒng)，美國）。 PCR程序為95°C預變性5min，40個循環(huán)的變性(95°C X30s)、退火(62°CX30s)和延伸（72°C X30s)，最后從72°C開始升溫至97°C，W每0.4°C-個測量點對引物的溶解曲線進行測定。 PCR程序完成后，軟件將自動分析并導出數據。
[0030] 有益效果
[0031] 1)本發(fā)明實現了多種微生物碳氮憐硫功能基因的同步化檢測；
[0032] 2)調整和優(yōu)化了引物的結構和產物的大小，使不同基因得W在同一擴增條件下進 行檢測，提局檢測效率；
[0033] 3)可W檢測低至0.001 %的目的基因，檢測精度高；
[0034] 4)保留了巧光定量PCR檢測的高靈敏度和準確度，同時具有忍片檢測的高通量反 應的優(yōu)點，降低了檢測成本；
[0035] 5)結合其他理化數據或微生物指標，可W分析當前生境下的碳氮憐硫元素循環(huán)的 情況及其影響因素。
【附圖說明】
[0036] 圖1是忍片制備中引物和對照在384孔板中的分配方案圖。
[0037] 圖2是忍片制備中DNA樣品在384孔板中的分配方案圖。
[0038] 圖3是實施例1中的DNA樣品和對照在384孔板中的分配方案圖。
【具體實施方式】
[0039] 下面詳細描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終 相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附 圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實施例 中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明 書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可W通過市購獲得的常規(guī)產品。
[0040] 實施例1:
[0041] 現^±壤樣本為實施例，對本發(fā)明的高通量檢測方法做進一步闡述
[0042] 1、±壤樣本描述
[0043] ±壤樣本來源于中國科學院封丘農業(yè)-生態(tài)試驗站27年長期施肥±壤，共7種不同 的施肥方式:不施肥(CK)、施氮鐘肥(NK)、施氮憐肥(NP)、施憐鐘肥(PK)、施氮憐鐘肥(NPK)、 施有機肥(CM)和施有機肥和氮憐鐘肥各半的混合肥（1/20MN)，其中有機肥為玉米桿、豆餅 和棉巧餅的混合物，混合重量比例為100 :40:45。每個處理每年的氮肥施用量為150kg/ha (CK和PK除外），憐肥施用量為75kg/ha(CK和NK除外），鐘肥施用量為150kg/ha(CK和NP除 外）。±壤采樣時的當季作物為玉米。采樣方式為相同處理內隨機取5個不同位置的表層± (0-15cm)，將其均勻混合后作為一個樣品，每個處理取4個樣品，共28個樣品。
[0044] 2、樣本DNA提取
[0045] 取每個±壤樣本0.5g，川Fas…NA化±壤0論提取試劑盒提取±壤0歴，分別用 化no化op ND-2000分光光度計和QuariliFlou愧雙鏈DNA試劑盒對提取的DNA質量和濃度進 行檢巧U(表2)，可W看出，所有DNA的0D260/280均處于1.6-1.9之間，濃度大于30ngAiL，每個 樣品提取10化L DNA溶液，滿足后續(xù)定量實驗要求。
[0046] 表2 DNA質量和濃度檢測表
[nru7l
[004引
[0049] 3、忍片準備
[0050] 按本發(fā)明方法，將合成的引物制成引物混合液后如圖1所示加入到384孔板前6列 (預先制備PCR反應液1(混合69化L Li曲t切cler 480DNA SYBR Green I Mix和41化L高純 水），按照圖1所示，在384孔板中前6列的相應位置分別加入12.化L PCR反應液巧日3.化L引 物混合液），之后用多樣品納米分配器將引物分配到一片Samrtchip忍片上，將忍片3300轉/ min離屯、5min。將28個樣品如圖3所示，加入到新的384孔板前4列(預先制備PCR反應液II (混 合610化Light切cler 480DNA SYBR Green I Mix、122化牛血清白蛋白水溶液和24化L高 純水），按照圖2所示，在384孔板中前4列的相應位置分別加入12.9化PCR反應液II和3.化L DNA樣品），此0樣品位置加入與DNA等量的高純水，作為陰性對照。運樣，每個DNA樣品都有2 個計數平行。之后再用多樣品納米分配器將DNA樣品分配到同一 SmadcMp忍片上(開始分 配時，選擇mRNA表達分析模式，選擇MyDesign下的80個引物和64個樣品分配方案，并進行樣 品分配。分配過程為自動化操作過程。）引物和DNA樣品分配后都需要將忍片離屯、，第一次離 屯、為3300轉/minx 5min，第二次離屯、為3300轉/minx 15min。離屯、后的忍片貼膜后等待定 量。
[0051 ] 4、高通量巧光定量和數據處理
[0化2]用Smart化ip實時PCR系統(tǒng)(WaferGen生物系統(tǒng)，美國）對忍片進行高通量定量檢 測，檢測的PCR程序為95°C預變性5min，40個循環(huán)的變性(95°CX30s)、退火(62°CX30s)和 延伸（72°C X 30s)，最后從72°C開始升溫至97 °C，升溫速率為4°C/s，W每0.4°C -個測量點 對引物的溶解曲線進行測定。PCR程序完成后，軟件將自動分析并導出數據。檢測完畢后，導 出的數據按W下條件進行篩選：1)擴增效率需在90%-110%之間；2)循環(huán)臨界值(Ct)必須 小于31 ;3)兩個計數平行樣品同時得到擴增的認定為有效擴增。篩選后的數據計算相對豐 度(RA):
[0化3]
[0化4]
[00對其中，CN為基因豐度，CNcnps為碳氮憐硫功能基因的豐度，CN16S為16S rRNA的豐度。
[0056] 每個施肥處理的碳氮憐硫功能基因相對豐度為4個平行樣品的平均值，結果見表 3。
[0057] 表3碳氮憐硫功能基因的相對豐度（％ )和平均變異系數SV( % )表 [00581


[0061]
[0062] 由于每個基因在微生物中表達量存在很大差異，并且不同環(huán)境來源的微生物種類 也存在很大差異，因而每個基因的相對豐度也存在較大不同。下面就該±壤中不同功能基 因含量差異進行分析，僅供參考。
[0063] acsA表達碳單氧化物水解酶，用于形成乙酷輔酶A合成酶并將C0和也0氧化成C〇2， 是微生物體內的常見基因，本實例中其相對豐度為36.496-45.433 %，氮元素添加對acsA的 表達有益，因此除PK外，其余處理的基因豐度都高于CK"acsE編碼鐵硫蛋白甲基轉移酶，將 甲基四氨葉酸的甲基轉移到鐵硫蛋白上，是細胞內電子傳遞和能量傳遞的關鍵環(huán)節(jié)，應具 有較高表達量，本例中其相對豐度為12.676-15.395 %。gam編碼葡萄糖氧化酶，是微生物葡 萄糖利用的胞外酶，由于葡萄糖是最廣泛存在也是容易被微生物利用的碳源，其豐度值應 較高，本例中其相對豐度為16.924-20.394%，憐肥施用可能對其有降低效果。met表達C1- C4 CoA轉移酶，參與炭基轉移和甲基天冬氨酸循環(huán)，是S簇酸循環(huán)中重要的供能步驟之一， 應具有高表達量，本實例中其相對豐度為53.231-63.333 %，施肥處理能明顯提高該基因的 相對豐度。amyX、exc和pox分別編碼普魯蘭酶、幾下質酶和酪氧化酶，有很強的底物特異性， 只針對普魯蘭糖、幾下質和多酪類難降解有機物有效，其豐度與±壤中特異性底物濃度的 多少有關，因此可能具有較低的基因豐度，本例中它們的豐度僅分別為0.002-0.007%、 0.002-0.003 %和0.043-0.067 % 〇mcrA編碼甲基輔酶A還原酶，是厭氧條件下生成甲燒的關 鍵基因，僅存在于特定的甲燒產生菌上，與所處的厭氧環(huán)境密切相關，因而表達量因±壤的 采樣位置而異，本例中其表達量為0.002-0.015%，運與采樣時取±為表層±有關。ureC基 因是微生物降解有機氮的關鍵基因，能夠降解尿素形成氨和二氧化碳，而尿素是農業(yè)施肥 常用的氮肥，其相對豐度值在農業(yè)±壤上應較高，本例中其相對豐度為18.633-21.475%。 hzo編碼聯氨氧化酶，hzsA和hzsB均為聯氨合成酶基因，=者均用于調控±壤的厭氧氨氧化 過程，只有厭氧環(huán)境下的特定菌群具備該基因，因此表達量較低，本例中=者的表達量分別 為0.001-0.002%、0.001-0.002%和0.017-0.024% ehao基因編碼徑胺氧化還原酶，主導徑 胺形成亞硝酸或者化0的過程，而nosZl和nosZ2均用于表達氧化亞氮還原酶，主導者化0還原 成化的過程，它們是氮元素循環(huán)硝化與反硝化過程的關鍵基因，應具有較高的表達水平，在 本例中它們的相對豐度分別為 13.928-18.175%、11.971-14.247 %和 13.412-15.524%。 PPX表達外切聚憐酸酶，用于調控胞內多聚憐酸降解，形成單憐酸鹽廣泛用于其它生理生化 反應，是細胞內憐元素供應的中樞環(huán)節(jié)，應具有高表達水平，本實例中其相對豐度為 44.742-53.041 %，施肥處理能明顯提高該基因的相對豐度。地oD和地nK被廣泛用于檢測堿 性憐酸酶(斷裂C-0鍵)和C-P裂解酶(斷裂C-P鍵），分別用于胞外有機憐降解利用和胞內C-P 信號分子的合成與降解，是常見的憐循環(huán)基因，應具有較高的表達水平，在本例中它們的表 達量分別為11.624-13.091 %和16.903-19.731 %，施肥過程能顯著提高它們的相對豐度。 cphy是半脫氨酸植酸酶的編碼基因，常見于海洋菌分泌的植酸酶，在±壤中含量較低，在本 例中其表達量僅為0.005-0.008% DapsA是硫酸鹽同化菌的特征基因，±壤硫循環(huán)無機硫活 化的關鍵基因，應具有較高的表達水平，本例中其相對豐度為21.424-26.942%，施肥處理 能明顯提高該基因的相對豐度。
[0064] 其余基因的表達量均在1-10%之間，是功能基因相對豐度的常見范圍。
[0065] 現舉例說明，如何判斷不同處理間的實驗結果。
[0066] 通過與不施肥(CK)處理進行對比，可W得到施加相應肥料后±壤微生物相關基因 含量的變化，現W CK和0M為例進行說明。相比于不施肥對照組（CK)，除f rdA、amyX、mcrA、 ni巧和cphy之外，施加有機肥(OM)對其余所有基因都有顯著的提高。有報道表明，有機肥能 夠增加±壤有機質含量，給±壤微生物帶來豐富的物質和能量來源，提高±壤微生物多樣 性和活力。因此，施加有機肥能全面提高微生物對±壤碳氮憐硫循環(huán)的促進作用。
[0067] 將不同施肥組進行比較，可W得到相應元素添加對功能基因含量的影響，現WPK 和NPK為例進行說明。將PK和NPK處理作對比，可W分析氮肥施加對功能基因的影響?？蒞發(fā) 現，施加氮肥(尿素）后，除rb化、smtA、mct和frdA外，其余固碳及碳循環(huán)基因的相對豐度均 得到顯著性提升，并且大部分碳化合物降解基因（包括gam、abfA、xylA、exg、exoPG、nmp、 Isop、amyX、apu、glx和lig)均得到顯著性增加。有報道表明，氮是構成微生物體內參與元素 循環(huán)過程中重要酶的組成成分，氮肥的施加增加了微生物對碳元素的利用和轉化能力，而 碳元素的固定和轉化也為氮元素的循環(huán)過程提供了能量支持，因而施加氮元素有利于促進 ±壤碳循環(huán)過程。然而大多數的氮相關基因卻顯著降低，包括脈酶基因 ureC、氨氧化細菌 amoA2、氨氧化古菌amoB、徑胺氧化還原酶hao、亞硝酸鹽還原酶nxrA、ni;rKl、ni;rK2和ni;rK3、 硝酸鹽還原酶napA和nasAW及氧化亞氮還原酶nosZ2。有報道表明，長期施加氮肥可能使作 物減少根系分泌物的分泌，從而降低對微生物單循環(huán)相關基因的刺激及促進作用；另外，長 期施加氮肥可能使±壤微生物對氮元素產生依賴，從而降低了某些氮利用基因的豐度，從 而減緩了氮元素的微生物循環(huán)效率。因此，從整體上看，長期施加氮肥，對±壤氮元素的循 環(huán)過程可能產生副作用。另外，氮肥施加對無機解憐基因 pqqC和植酸酶基因 bpp都有促進作 用。有報道表明，憐元素由于±壤緩沖和金屬離子的作用而難W被作物利用，而施加氮肥不 僅可W降低抑，還能提高微生物釋放有機酸陰離子的能力，從而競爭性馨合金屬離子，釋放 憐酸鹽，提高上壤速效憐的含量。
[0068] 此外，該忍片方法可W同時檢測到71種碳氮憐硫功能基因的基因豐度，并且能夠 檢測到0.001%水平的功能基因相對豐度，檢測精度高，提高了檢測效率，降低了檢測成本。 從平均變異系數上看，變異范圍在6.1-24.9%之間，整體準確度高。
[0069] 盡管上面已經示出和描述了本發(fā)明的實施例，可W理解的是，上述實施例是示例 性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領域的普通技術人員在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨 的情況下在本發(fā)明的范圍內可W對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。
【主權項】
1. 一種微生物碳氮磷硫元素功能基因的高通量定量檢測引物，其特征在于，所述引物 序列如3￡〇10勵：1-142所示，其中5￡〇10勵：1和2為一對上下游引物，5￡〇10勵:3和4為 一對上下游引物，以此類推至SEQ ID NO: 141-142為一對上下游引物。2. -種微生物碳氮磷硫元素功能基因的高通量定量檢測試劑盒，其特征在于，所述試 劑盒含有權利要求1的引物。3. -種微生物碳氮磷硫元素功能基因的高通量定量檢測芯片，其特征在于，所述芯片 含有權利要求1的引物或權利要求2試劑盒中的引物。4. 一種用于微生物碳氮磷硫元素功能基因的高通量定量檢測方法，其特征在于，步驟 為， 提取DNA樣品； PCR擴增:采用權利要求1的引物或權利要求2試劑盒中的引物或權利要求3的芯片進行 PCR擴增;所述對照引物為SEQ ID NO: 143-144; 結果計算及判斷其中，CN為基因豐度，RA為相對豐度，CNcnps為碳氮磷硫功能基因的豐度，CN16S為16S rRNA的豐度。5. 權利要求4所述用于微生物碳氮磷硫元素功能基因的高通量定量檢測方法，其特征 在于，所述PCR擴增的程序為，95°C預變性5min; 95°C，30s，40個循環(huán);62°C，30s退火，72°C， 30s延伸，最后從72°C開始升溫至97°C，升溫速率為4°C/s，以每0.4°C-個測量點對引物的 溶解曲線進行測定。
【文檔編號】C12Q1/68GK106048041SQ201610537546
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月8日
【發(fā)明人】朱永官, 鄭邦曉, 蘇建強, 李虎, 姚槐應
【申請人】中國科學院城市環(huán)境研究所