一種氰醇裂解酶、其制備方法及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種氰醇裂解酶、其制備方法及應(yīng)用。具體地，獲得一種突變的氰醇裂解酶，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所述突變的氰醇裂解酶的催化活性是野生型的氰醇裂解酶的200％以上。
【專利說明】
一種氰醇裂解酶、其制備方法及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種氰醇裂解酶及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 氰醇裂解酶是一種在化工生產(chǎn)中非常有用的工業(yè)用酶，其天然活性是催化氰醇的 裂解并釋放出氫氰酸。氰醇裂解酶可以催化逆反應(yīng)，即HCN與醛酮的加成，得到具有光學(xué)活 性的a-氰醇產(chǎn)物。
[0003] 天然的S-氰醇裂解酶存在于橡膠、木薯和高粱等少數(shù)幾種植物組織中，豐度 低，純化難度大。1995年，Wajant采用五步純化法從木薯中分離得到了木薯氰醇裂解酶 MeHNL(Plant Sci.，1995, 108, 1) ;White等人采用三步法從木薯葉中提取了 MeHNL，采用 鹽析和透析的方式得到了酶液，但是應(yīng)用于化學(xué)催化的立體選擇性不高（Plant Physiol 1998,116,1219)。來源于木薯（Manihot esculenta)的氰醇裂解酶（MeHNL)是一種 S-氰 醇裂解酶，已有文獻(xiàn)報(bào)道將MeHNL用于催化S-型手性氰醇的化學(xué)合成，ee值〉99%，具有 重要的應(yīng)用價(jià)值，例如S-間苯氧基苯甲醛氰醇是新型菊酯類農(nóng)藥的通用中間體。1993年， Wajant等人報(bào)道了編碼MeHNL的cDNA序列和蛋白序列。
[0004] 采用微生物作為宿主菌是快速大量的得到氰醇裂解酶的有效方法。Effenberger 等人1996年在大腸桿菌中報(bào)道了 MeHNL在大腸桿菌中的重組表達(dá)，但是蛋白多為包涵體， 可溶性蛋白含量較低（Angew 1996,35,437)。陳樹華等2001年將MeHNL基因克隆到質(zhì)粒 pPic9K，實(shí)現(xiàn)了在酵母菌中的表達(dá)（生物工程學(xué)報(bào)，2001，17 (1)，78)，但是酶活仍然不夠 高，難以達(dá)到實(shí)際應(yīng)用的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種氰醇裂解酶、其制備方法及應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種突變的氰醇裂解酶，所述突變的氰醇裂解酶在野 生型的氰醇裂解酶的對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0. : 1的第60位谷氨酸（E)、第128位色氨酸（W)、第 220位異亮氨酸（I)發(fā)生突變。
[0007] 在另一優(yōu)選例中，所述氰醇裂解酶為木薯氰醇裂解酶（MeHNL)。
[0008] 在另一優(yōu)選例中，所述第60位谷氨酸（E)突變?yōu)楦拾彼幔℅);和/或
[0009] 第128位色氨酸（W)突變?yōu)楸彼幔ˋ);和/或
[0010] 第220位異亮氨酸（I)突變?yōu)榱涟彼幔↙)。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述突變的氰醇裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID N0. : 5所示。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述突變的氰醇裂解酶的催化活性為同等條件下相應(yīng)的野生型 氰醇裂解酶催化活性的150%~350%，優(yōu)選地為180%~220%。
[0013] 本發(fā)明的第二方面，提供了一種多核苷酸分子，所述多核苷酸選自下組：
[0014] (a)編碼如SEQ ID N0. : 5所示多肽的多核苷酸；
[0015] (b)序列如SEQ ID N0. :2或7所示的多核苷酸；
[0016] (c)核苷酸序列與SEQ ID NO. : 2或7所示序列的同源性彡95% (較佳地彡98%)， 且編碼SEQ ID N0. : 1或5所示多肽的多核苷酸；
[0017] (d)與（a)-(c)任一所述的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
[0018] 本發(fā)明的第三方面，提供了一種載體，所述載體含有本發(fā)明第二方面所述的核酸 分子。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述載體為PET28。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述載體還包括色氨酸啟動(dòng)子Trp2 ;優(yōu)選地所述色氨酸啟動(dòng)子 Trp2的核苷酸序列如SEQ ID N0. :6所示
[0021] 本發(fā)明的第四方面，提供了一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有本發(fā)明第三方面所 述的載體或染色體整合有本發(fā)明第二方面所述的核酸分子。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞、或真核細(xì)胞。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述原核細(xì)胞為大腸桿菌。
[0024] 本發(fā)明的第五方面，提供了一種制備本發(fā)明第一方面所述的突變的氰醇裂解酶的 方法，其特征在于，包括步驟：
[0025] (i)在適合的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明第四方面所述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)出所述的突 變的氰醇裂解酶；和
[0026] (ii)分離所述的突變的氰醇裂解酶。
[0027] 本發(fā)明的第六方面，提供了一種酶制劑，所述酶制劑包含本發(fā)明第一方面所述突 變的氰醇裂解酶。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述酶制劑還包括選自下組的一種或多種組分：檸檬酸，蘋果 酸，和丁二酸。
[0029] 本發(fā)明的第七方面，提供了本發(fā)明第一方面所述的突變的氰醇裂解酶、如本發(fā)明 第六方面所述的酶制劑的用途，用于制備具有光學(xué)活性的S-氰醇產(chǎn)物。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述用途還包括催化HCN與醛酮的加成反應(yīng)。
[0031] 本發(fā)明的第八方面，提供了一種制備S-氰醇的方法，包括步驟：
[0032] (1)將本發(fā)明第一方面所述的突變的氰醇裂解酶與反應(yīng)底物接觸，進(jìn)行催化反應(yīng)， 從而生成所述S-氰醇；
[0033] (2)分離并純化所述S-氰醇產(chǎn)物。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（1)中，所述反應(yīng)底物包括間苯氧基苯甲醛，和/或丙 酮氰醇。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（1)中，催化反應(yīng)的溫度為0-20°C。
[0036] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0037] 圖1A顯示了實(shí)施例1中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖譜。
[0038] 圖1B顯示了本發(fā)明突變的氰醇裂解酶的凝膠電泳圖譜。
[0039] 圖2顯示催化活性測(cè)定曲線。
[0040] 圖3顯示了本發(fā)催化反應(yīng)的HPLC檢測(cè)結(jié)果。
[0041] 圖4顯示了本發(fā)明所構(gòu)建的質(zhì)粒圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0042] 本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究，意外地獲得一種突變的氰醇裂解酶，實(shí)驗(yàn)結(jié)果 表明，所述突變的氰醇裂解酶的催化活性是野生型的氰醇裂解酶的200%以上。本發(fā)明還提 供了所述突變的氰醇裂解酶的用途。
[0043] 具體地，本發(fā)明對(duì)MeHNL的序列針對(duì)大腸桿菌進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，并根據(jù)定向進(jìn) 化的方法在MeHNL的DNA序列中引入隨機(jī)突變，篩選突變體文庫得到最優(yōu)序列，發(fā)現(xiàn)對(duì)其中 的60位突變?yōu)镚，128位氨基酸突變?yōu)锳，220位突變?yōu)長(zhǎng)。并將該序列克隆到了大腸桿菌質(zhì) 粒，啟動(dòng)子為色氨酸啟動(dòng)子Trp2,轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸桿菌，進(jìn)行高密度發(fā)酵。采用這種方式得到 的MeHNL，比酶活高達(dá)300u/mL，高于已知的異源表達(dá)的氰醇裂解酶，且發(fā)酵周期短，不需要 誘導(dǎo)劑，成本低。
[0044] 在描述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于所述的具體方法和實(shí)驗(yàn)條件，因?yàn)檫@ 類方法和條件可以變動(dòng)。還應(yīng)當(dāng)理解本文所用的術(shù)語其目的僅在于描述具體實(shí)施方案，并 且不意圖是限制性的，本發(fā)明的范圍將僅由所附的權(quán)利要求書限制。
[0045] 除非另外定義，否則本文中所用的全部技術(shù)與科學(xué)術(shù)語均具有如本發(fā)明所屬領(lǐng)域 的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。如本文所用，在提到具體列舉的數(shù)值中使用時(shí)，術(shù)語 "約"意指該值可以從列舉的值變動(dòng)不多于1 %。例如，如本文所用，表述"約100"包括99 和101和之間的全部值（例如，99. 1、99. 2、99. 3、99. 4等）。
[0046] 雖然在本發(fā)明的實(shí)施或測(cè)試中可以使用與本發(fā)明中所述相似或等價(jià)的任何方法 和材料，本文在此處例舉優(yōu)選的方法和材料。
[0047] 氰醇裂解酶
[0048] 氰醇裂解酶（Hydroxynitrile lyase)主要來源于橡膠、木薯和高粱等少數(shù)幾種植 物組織。主要包括：木薯氰醇裂解酶（MeHNL)、漆樹氰醇裂解酶（HbHNL)、杏仁氰醇裂解酶 (PaHNL) 〇
[0049] 在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述氰醇裂解酶為木薯氰醇裂解酶。
[0050] 在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，優(yōu)選地木薯氰醇裂解酶野生型序列如下：
[0053] 在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述突變的氰醇裂解酶的序列如下：
[0054]
[0055] 氰醇裂解酶基因序列優(yōu)化
[0056] 在本發(fā)明中，提供了優(yōu)化的、特別適合在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的氰醇裂解酶蛋白 的核酸編碼序列。
[0057] 本發(fā)明人選用大腸桿菌偏好密碼子，在不改變其氨基酸序列的前提下對(duì)氰醇裂解 酶的DNA序列進(jìn)行了優(yōu)化。然而，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，僅依據(jù)密碼子頻率獲得的優(yōu)化序列并不完 全適合在大腸桿菌中表達(dá)。因此本發(fā)明人進(jìn)行了二次優(yōu)化，其中包括消除不利于表達(dá)的二 級(jí)結(jié)構(gòu)（如發(fā)夾結(jié)構(gòu)），改變基因中A+T組成、改變G+C含量等。
[0058] 經(jīng)過大量測(cè)試和篩選，本發(fā)明人在眾多優(yōu)化序列中獲得了一個(gè)特別優(yōu)化的氰醇裂 解酶編碼序列。所述優(yōu)化的氰醇裂解酶的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，
[0060] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，編碼本發(fā)明的突變型的氰醇裂解酶的多核苷酸 序列如下：
[0063] 載體和宿主細(xì)胞
[0064] 本發(fā)明還提供了一種包含本發(fā)明的優(yōu)化的氰醇裂解酶基因的載體，以及含所述載 體的宿主細(xì)胞。
[0065] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述述載體具有在大腸桿菌（更佳地在大腸桿菌 BL21(DE3)菌株）中表達(dá)的能力。
[0066] 本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以使用的常規(guī)方法獲得本發(fā)明的優(yōu)化的氰醇裂解酶基 因序列，例如全人工合成或PCR法合成。一種優(yōu)選的合成法為不對(duì)稱PCR法。不對(duì)稱PCR 法是用不等量的一對(duì)引物，PCR擴(kuò)增后產(chǎn)生大量的單鏈DNA(SSDNA)。這對(duì)引物分別稱為非 限制引物與限制性引物，其比例一般為50-100 : 1。在PCR反應(yīng)的最初10-15個(gè)循環(huán)中，其 擴(kuò)增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA，但當(dāng)限制性引物（低濃度引物）消耗完后，非限制性引物（高濃 度引物）引導(dǎo)的PCR就會(huì)產(chǎn)生大量的單鏈DNA。用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā) 明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過凝膠電泳分離和純 化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。
[0067] 本發(fā)明的多核苷酸序列可以通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)，表達(dá)或生產(chǎn)目的蛋白，包 括步驟：
[0068] (1)用編碼本發(fā)明蛋白的多核苷酸（或變異體），或用含有該多核苷酸的重組表達(dá) 載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞，較佳地大腸桿菌細(xì)胞；
[0069] (2)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞；
[0070] (3)從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
[0071] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含本發(fā)明蛋白的編碼DNA序列和合適 的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體，優(yōu)選市售的載體：PET28。這些方法包括體外重組DNA 技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟 動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。 此外，表達(dá)載體優(yōu)選包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的 表型性狀。
[0072] 本發(fā)明還提供的重組載體，其包含本發(fā)明的經(jīng)過優(yōu)化的MeHNL DNA序列。在優(yōu)選 的實(shí)施方式中，所述重組載體的啟動(dòng)子下游包含多克隆位點(diǎn)或至少一個(gè)酶切位點(diǎn)。需要表 達(dá)目的基因時(shí)，將目的基因連接入適合的多克隆位點(diǎn)或酶切位點(diǎn)，從而可操作地連接目的 基因與啟動(dòng)子。
[0073] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述重組載體在5'到3'方向上包括：?jiǎn)?dòng)子，目的基 因和終止子。如果需要，所述重組載體還可以包括以下元件：蛋白純化標(biāo)簽；3'多聚核苷 酸化信號(hào)；非翻譯核酸序列；轉(zhuǎn)運(yùn)和靶向核酸序列；選擇標(biāo)記（抗生素抗性基因、熒光蛋白 等）；增強(qiáng)子；或操作子。
[0074] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述重組載體包括色氨酸啟動(dòng)子Trp2,優(yōu)選 地，其序列如下：
[0076] 用于制備重組載體的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。表達(dá)載體可以是細(xì)菌 質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒或其他載體。總之，只要其能夠 在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以被米用。
[0077] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以采用熟知的方法構(gòu)建含有本發(fā)明啟動(dòng)子和/或目的基 因序列的載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。
[0078] 本發(fā)明的表達(dá)載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使宿主轉(zhuǎn)錄目的RNA或表 達(dá)目的蛋白質(zhì)。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌、黃色短桿菌、鏈霉菌 屬、農(nóng)桿菌：或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如植物細(xì)胞。本領(lǐng)域一般 技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體和宿主細(xì)胞。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技 術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物（如大腸桿菌）時(shí)，可以用CaCV法處理， 也可用電穿孔法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法：磷酸鈣共沉淀法， 常規(guī)機(jī)械方法（如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等）。轉(zhuǎn)化植物也可使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化或基 因槍轉(zhuǎn)化等方法，例如葉盤法、幼胚轉(zhuǎn)化法、花芽浸泡法等。對(duì)于轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器 官可以用常規(guī)方法再生成植株，從而獲得轉(zhuǎn)基因的植物。
[0079] 術(shù)語"可操作連接"是指將準(zhǔn)備轉(zhuǎn)錄表達(dá)的目的基因以一種本領(lǐng)域的常規(guī)方式連 接到它的控制序列以被表達(dá)。
[0080] 工程菌的培養(yǎng)和目的蛋白發(fā)酵生產(chǎn)
[0081] 在獲得工程細(xì)胞后，便可在適合的條件下培養(yǎng)工程細(xì)胞，表達(dá)本發(fā)明的基因序列 所編碼的蛋白。根據(jù)宿主細(xì)胞的不同，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基，在適 于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法 (如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo)）誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。工程細(xì)胞可以是快 速利用甲醇型（Mut +)或慢速利用甲醇型（Muts)。
[0082] 在本發(fā)明中，可采用常規(guī)的發(fā)酵條件。代表性的條件包括（但并不限于）：
[0083] (a)就溫度而言，氰醇裂解酶的發(fā)酵及誘導(dǎo)溫度保持在25_35°C ;
[0084] (b)就誘導(dǎo)期的pH值而言，誘導(dǎo)期pH控制在3-9 ;
[0085] (c)就溶氧（D0)而言，D0控制在20-90%，溶氧的維持可以用氧氣/空氣混合氣 體的通入來解決；
[0086] (d)就補(bǔ)料而言，補(bǔ)料種類宜包括甘油、甲醇、葡萄糖等碳源，可單獨(dú)補(bǔ)料或混合補(bǔ) 料；
[0087] (e)就誘導(dǎo)期IPTG濃度而言，常規(guī)誘導(dǎo)濃度都可用于本發(fā)明，通常iptg濃度控制 在 0? 1-1. 5mM ;
[0088] (f)就誘導(dǎo)時(shí)間而言，沒有特別限制，通常為2-20小時(shí)，較佳地為5-15小時(shí)。
[0089] 本發(fā)明的目的蛋白氰醇裂解酶存在大腸桿菌細(xì)胞胞內(nèi)，通過離心機(jī)收集宿主細(xì) 胞，然后通過高壓、機(jī)器力、酶解細(xì)胞被或其他細(xì)胞破碎方法破碎宿主細(xì)胞，釋放重組蛋白， 優(yōu)選的是高壓法。宿主細(xì)胞裂解液可通過鹽析、超濾等方法進(jìn)行初步純化后再進(jìn)行層析純 化，也可直接進(jìn)行層析純化。
[0090] 層析技術(shù)包括陽離子交換層析、陰離子交換層析、凝膠過濾層析、疏水層析、親和 層析等技術(shù)。常用的層析方法包括：
[0091] 1?陰離子交換層析：
[0092] 陰離子交換層析介質(zhì)包括（但不限于）：Q_Sepharose、DEAE-Sepharose。如果發(fā) 酵樣品的鹽濃度較高，影響與離子交換介質(zhì)的結(jié)合，則在進(jìn)行離子交換層析前需降低鹽濃 度。樣品可以用稀釋、超濾、透析、凝膠過濾層析等手段進(jìn)行平衡緩沖液的更換，直至與對(duì)應(yīng) 的離子交換柱平衡液系統(tǒng)相似，然后上樣，進(jìn)行鹽濃度或pH的梯度洗脫。
[0093] 2?疏水層析：
[0094] 疏水層析介質(zhì)包括（但不限于）：Phenyl_Sepharose、Butyl-Sepharose、 Octyle-Sepharose。樣品通過添加NaCl、（NH 4)2S04等方式提高鹽濃度，然后上樣，通過降低 鹽濃度方法洗脫。通過疏水層析除去疏水性有較大差異的雜蛋白。
[0095] 3.凝膠過濾層析
[0096] 疏水層析介質(zhì)包括（但不限于）：Sephacryl、Superdex、Sephadex類。通過凝膠 過濾層析更換緩沖體系，或進(jìn)一步精純。
[0097] 4?親和層析
[0098] 親和層析介質(zhì)包括（但不限于）：HiTrap? Heparin HP Columns。
[0099] 制備酶制劑組合物
[0100] 本發(fā)明還提供了一種酶制劑組合物，該酶制劑組合物中包含本發(fā)明的氰醇裂解 酶。
[0101] 本發(fā)明的酶制劑組合物還可以包含：檸檬酸、和/或乙酸。
[0102] S-氰醇的制備方法
[0103] 本發(fā)明還提供了一種S-氰醇的制備方法，所述方法包括步驟：
[0104] (1)將本發(fā)明的突變的氰醇裂解酶與反應(yīng)底物接觸，進(jìn)行催化反應(yīng)，從而生成所述 S-氰醇；
[0105] (2)分離并純化所述S-氰醇產(chǎn)物。
[0106] 在本發(fā)明優(yōu)選地實(shí)施方式中，所述步驟（1)中，所述反應(yīng)底物為間苯氧基苯甲醛、 和丙酮氰醇（或，氰氫酸）。
[0107] 在本發(fā)明優(yōu)選地實(shí)施方式中，所述步驟（1)中，催化反應(yīng)的溫度為0-20°C。
[0108] 本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：
[0109] (1)本發(fā)明的突變的氰醇裂解酶，催化反應(yīng)活性遠(yuǎn)高于野生型的氰醇裂解酶，是野 生型的兩倍左右；
[0110] (2)編碼本發(fā)明的突變的氰醇裂解酶的多核苷酸序列，在大腸桿菌中表達(dá)量高，表 達(dá)穩(wěn)定，能夠顯著降低制備氰醇裂解酶的成本。
[0111] (3)采用本發(fā)明的制備突變的氰醇裂解酶，周期短，成本低，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0112] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步詳陳本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明詳細(xì)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數(shù)按重量計(jì)算。以下實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料和試劑如無特別說明均可從市售渠道獲 得。
[0113] 實(shí)施例1突變體的構(gòu)建
[0114] 根據(jù)Wajant報(bào)道的MeHNL的蛋白序列1 (SEQ ID N0. : 1)，根據(jù)大腸桿菌的密碼子 偏好性，合成了 MeHNL DNA序列2(SEQ ID N0. :2)，克隆至質(zhì)粒pET28(購(gòu)自Invitrogene公 司）的Ndel-Hindlll位點(diǎn)。以該質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)引物，見序列3和序列4。使用隨機(jī)誘 變?cè)噭┖?，通過改變MnS0 4濃度來進(jìn)行多個(gè)反應(yīng)，從而將1至3個(gè)點(diǎn)突變引入MeHNL基因， 使MeHNL酶氨基酸序列中1-3個(gè)氨基酸被替換。為擴(kuò)增編碼MeHNL酶，分別以引物SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4作為正向和反向引物。兩個(gè)引物都含有與使用Gateway Technology 通過定點(diǎn)重組克隆獲得的PCR擴(kuò)增MeHNL基因片段相容的位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳 圖譜如圖1所示，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期相符。
[0115] 易錯(cuò)PCR擴(kuò)增使用下述溫度程序：94°C 2min，94°C 30s和68°C lmin的25個(gè)循 環(huán)，接著68°C lOmin。首先將易錯(cuò)PCR片段克隆進(jìn)pDONR載體（購(gòu)自Invitrogene公司）， 制備大規(guī)?？凇攴竈(購(gòu)自11^1廿呢 61^公司）質(zhì)粒文庫，起始超過20,000個(gè)菌落。然后以 pDEST 14為載體，將pENTR入門質(zhì)粒文庫構(gòu)建為表達(dá)文庫。然后將表達(dá)文庫轉(zhuǎn)入化學(xué)感受態(tài) E. coil BL21Star(DE3)(購(gòu)自Invitrogene公司），用于表達(dá)突變的MeHNL基因。
[0116] 轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109 (DE3)，得到的Kana抗性的轉(zhuǎn)化子，接種至LB培養(yǎng)基在37°C 進(jìn)行培養(yǎng)。0D600 = 0. 6-1. 0之間時(shí)，加入IPTG至終濃度0.1 mM，降溫至25-30°C，繼續(xù)培養(yǎng) 16小時(shí)，4000rpm離心收集菌體。
[0117] 酶活測(cè)定：參考 Selmar 報(bào)道的方法（Analytical Biochemistry 166 (1987)， 208-211)，間苯氧基苯甲醛10mM，甲醇20uL，20mM檸檬酸緩沖液（pH5. 0)，丙酮氰醇50mM，粗 酶液10uL。上述反應(yīng)液于25度溫育，上述反應(yīng)液于25度溫育，分別在l-5min測(cè)定250nm 的吸光度變化。每分鐘內(nèi)催化產(chǎn)生lumole間苯氧基苯甲醛所需要的酶量定義為1個(gè)酶活 單位。變化速率最快的即為酶活最高的突變體。
[0118] 檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，為突變體，▲為野生型，?為對(duì)照試驗(yàn)（不加酶）。突變體 酶活 / 野生型酶活=(0.2299-0. 086)八0. 1577-0. 086)*100%= 200.6%。
[0119] 從圖中可以看出突變體的活性要顯著高于野生型的活性，催化活性為野生型的 200%。測(cè)序獲得該高活性的突變型為序列5 (SEQ ID N0. : 5)。
[0120] 本實(shí)施例中所用引物序列如下：
[0121] 正向引物：5' -GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTT CGA AGG AGA TAG AAC CAT GGT GAC CGC CCA TTT C-3, SEQ ID NO. :3 ；
[0122] 反向引物：5' -GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC TTA AGC ATA AGC ACG GCC-3' SEQ ID NO. :4。
[0123] 實(shí)施例2菌種構(gòu)建和高密度發(fā)酵
[0124] 合成含有序列6(3￡0 10勵(lì).：6)的色氨酸啟動(dòng)子，并連接到？￡了28&的此〇1和制61 位點(diǎn)，然后分別將實(shí)施例1中的序列1和5的編碼多核苷酸連接到前述的Ndel-Xhol位點(diǎn)， 得到含有串聯(lián)色氨酸啟動(dòng)子的大腸桿菌質(zhì)粒pTrp2-MeHNLl和pTrp2-MeHNL5 (質(zhì)粒圖譜如 圖4所示）。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109 (購(gòu)自Invitrogene公司），在Kana抗性平板上得 到相應(yīng)的菌種，接種到LB培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)，用20%甘油保存菌種。
[0125] 將菌種接種于裝有200mL LB培養(yǎng)基的1L搖瓶中，于37 °C，180-220rpm培養(yǎng) 10-16h。將上述培養(yǎng)好的種子按10% (v/v)的比例接種于3L上罐發(fā)酵培養(yǎng)基（M9)中 (葡萄糖4g/L，磷酸氫二鈉12. 8g/L，磷酸二氫鉀3g/L，氯化銨lg/L，硫酸鈉0. 5g/L，氯化鈣 0? 0152g/L，六水氯化鎂 0? 41g/L。），在 25-35°C，300-800rpm，空氣流量 2-6L/min 的條件下 培養(yǎng)。培養(yǎng)6-1011后，以5-2〇1111711的速率流加含60%甘油的補(bǔ)料培養(yǎng)基，持續(xù)至發(fā)酵結(jié)束。 流加補(bǔ)料培養(yǎng)基數(shù)小時(shí)至〇D_達(dá)到80-100時(shí)，放罐，5000rpm離心收集菌體。菌體裂解后 測(cè)定酶活，分別為73U/mg粗蛋白和143U/g粗蛋白。凝膠電泳檢測(cè)與預(yù)期相符。
[0126] 實(shí)施例3MeHNL的固定化（交聯(lián)酶聚集體，CLEA)
[0127] 分別取含有序列1和序列5的大腸桿菌50g濕菌體，重懸于200mL檸檬酸緩沖 液（50mM，pH 5. 5)，超聲破菌，14000rpm離心30min收取上清液，加入硫酸銨固體至終濃 度60%，冰浴上攪拌15min，14000rpm離心收集沉淀。冰浴攪拌下，將蛋白硫酸銨沉淀加 入10%戊二醛的水溶液，離心收集沉淀，分別得到4. lg(序列1)和4. 5g(序列5)固定化 MeHNL〇
[0128] 實(shí)施例4-5固定化酶的使用（純有機(jī)相）
[0129] 在 100mL MTBE (methyl tert-butyl ether，甲基叔丁基醚）（實(shí)施例 4)，或異丙醚 (實(shí)施例5)中，加入10mL間苯氧基苯甲醛，2.5g MeHNL固定化酶（序列5)，5mL丙酮氰醇， 20°C攪拌反應(yīng)，攪拌速度為400-500rpm。反應(yīng)4小時(shí)取樣用HPLC檢測(cè)反應(yīng)轉(zhuǎn)化率，過濾回 收固定化酶，投入下一批次。重復(fù)使用的情況見表1。
[0130]
[0131]
[0132] 注：A為突變型；WT為野生型。液相色譜檢測(cè)，轉(zhuǎn)化率計(jì)算方式為，轉(zhuǎn)化率=產(chǎn)物 八產(chǎn)物+底物）*1〇〇%。
[0133] 實(shí)施例6-7固定化酶的使用（水+有機(jī)相）
[0134] 在50mL檸檬酸溶液（50mM，pH5)中，加入10mL間苯氧基苯甲醛，5g MeHNL (序列 1)固定化酶，5mL氰氫酸，分別加入50mL MTBE (實(shí)施例6)，或50mL異丙醚（實(shí)施例7)，20°C 攪拌反應(yīng)，攪拌速度為400-500rpm。反應(yīng)4小時(shí)后取樣用HPLC檢測(cè)轉(zhuǎn)化率，結(jié)束反應(yīng)后，過 濾回收固定化酶，投入下一批次。重復(fù)使用的情況見表2。
[0135] 表 2
[0136]
[0138] 根據(jù)實(shí)施例4-7的結(jié)果，本發(fā)明優(yōu)選的反應(yīng)體系為MTBE有機(jī)相；反應(yīng)條件為： CLEA固定化酶為催化劑，MTBE為溶劑，底物為間苯氧基苯甲醛，丙酮氰醇（或，氰氫酸）， 20°C反應(yīng)3-5小時(shí)，攪拌速度為400-500rpm。反應(yīng)體系中間苯氧基苯甲醛濃度為0. 1-1. 2 摩爾/升，丙酮氰醇濃度為〇. 2 - 2摩爾/升），而且丙酮氰醇的濃度是間苯氧基苯甲醛濃 度的1. 5-3倍。
[0139] 實(shí)施例9分析檢測(cè)
[0140] 采用高效液相色譜（HPLC)法監(jiān)測(cè)反應(yīng)：以水和乙腈（45:55)為流動(dòng)相，色譜柱為 0DS-18反相柱，島津LC-15C高效液相色譜，210nm下檢測(cè)紫外吸收；反應(yīng)體系用水和乙腈 (45:55)進(jìn)行稀釋，離心并用尼龍膜過濾后進(jìn)樣檢測(cè)。在本發(fā)明優(yōu)選地反應(yīng)體系中，HPLC檢 測(cè)反應(yīng)進(jìn)程（圖3):反應(yīng)1小時(shí)后，檢測(cè)，17. 3min為間苯氧基苯甲醛，17. 5min為S-構(gòu)型 氰醇.
[0141] 手性純度采用Agilent 1260液相色譜進(jìn)行分析，檢測(cè)條件為：Chiralpak AD-H 柱，正己燒：乙醇（0. 1% DEA) = 90:10,0. 8mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm。經(jīng)過比對(duì)本發(fā)明制 得的S-構(gòu)型的產(chǎn)物與目標(biāo)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品（購(gòu)自江西科苑生物藥業(yè)有限公司）一致。
[0142] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種突變的氰醇裂解酶，其特征在于，所述突變的氰醇裂解酶在野生型的氰醇裂解 酶的對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO. : 1的第60位谷氨酸（E)、第128位色氨酸（W)、第220位異亮氨酸 (I)發(fā)生突變。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述氰醇裂解酶為木薯氰醇裂解酶 (MeHNL)〇3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第60位谷氨酸（E)突變?yōu)楦拾彼幔℅); 和/或 第128位色氨酸（W)突變?yōu)楸彼幔ˋ);和/或 第220位異亮氨酸（I)突變?yōu)榱涟彼幔↙)。 優(yōu)選地，所述突變的氰醇裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. :5所示。4. 一種多核苷酸分子，其特征在于，所述多核苷酸選自下組： (a) 編碼如SEQ ID NO. : 5所示多肽的多核苷酸； (b) 序列如SEQ ID NO. :2或7所示的多核苷酸； (c) 核苷酸序列與SEQ ID NO. :2或7所示序列的同源性彡95% (較佳地彡98% )，且 編碼SEQ ID NO. : 1或5所示多肽的多核苷酸； (d) 與（a)-(c)任一所述的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。5. -種載體，其特征在于，所述載體含有權(quán)利要求4所述的核酸分子。6. -種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞含有權(quán)利要求5所述的載體或染色體整 合有權(quán)利要求4所述的核酸分子。7. -種制備權(quán)利要求1所述的突變的氰醇裂解酶的方法，其特征在于，包括步驟： (i) 在適合的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)出所述的突變的氰醇 裂解酶；和 (ii) 分離所述的突變的氰醇裂解酶。8. -種酶制劑，其特征在于，所述酶制劑包含權(quán)利要求1所述突變的氰醇裂解酶。9. 如權(quán)利要求1所述的突變的氰醇裂解酶、如權(quán)利要求8所述的酶制劑的用途，其特征 在于，用于制備具有光學(xué)活性的S-氰醇產(chǎn)物。10. -種制備S-氰醇的方法，其特征在于，包括步驟： (1) 將權(quán)利要求1所述的突變的氰醇裂解酶與反應(yīng)底物接觸，進(jìn)行催化反應(yīng)，從而生成 所述S-氰醇； (2) 分離并純化所述S-氰醇產(chǎn)物。
【文檔編號(hào)】C12P13/00GK106032531SQ201510481026
【公開日】2016年10月19日
【申請(qǐng)日】2015年8月7日
【發(fā)明人】田振華, 羅煜, 丁時(shí)誠(chéng), 瞿旭東
【申請(qǐng)人】南京博優(yōu)康遠(yuǎn)生物醫(yī)藥科技有限公司