轉(zhuǎn)錄單位及其在表達(dá)載體中的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及由包含下列組分的多核苷酸構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄單位：hCMVie病毒的增強(qiáng)子，所述增強(qiáng)子具有核苷酸序列SEQ?ID?NO:1，或與序列SEQ?ID?NO:1呈現(xiàn)出至少70％的序列同一性并且實(shí)質(zhì)上擁有轉(zhuǎn)錄激活特性的核苷酸；和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶9(CDK9)的啟動(dòng)子區(qū)，所述啟動(dòng)子區(qū)具有核苷酸序列SEQ?ID?NO:2，或與序列SEQ?ID?NO:2呈現(xiàn)出至少70％的序列同一性并且實(shí)質(zhì)上擁有啟動(dòng)子活性的核苷酸。
【專利說明】轉(zhuǎn)錄單位及其在表達(dá)載體中的用途
[0001]本發(fā)明涉及新的轉(zhuǎn)錄單位，其能夠在表達(dá)載體中使用。
[0002]迄今為止，重組蛋白質(zhì)的表達(dá)依然是用于生產(chǎn)治療性蛋白質(zhì)(例如，藥理學(xué)抗體)的主要方法之一。
[0003]通常，將編碼重組蛋白質(zhì)的核酸引入到表達(dá)載體中，所述表達(dá)載體包含允許這些目的分子的轉(zhuǎn)錄和翻譯的遺傳元件。
[0004]本發(fā)明的目的之一是提供使得能夠產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄單位，所述重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)率的增益并不與特定抗原靶的抗體相關(guān)并因而與給定的重組蛋白質(zhì)相關(guān)，也不與培
養(yǎng)基相關(guān)。
[0005]本發(fā)明的目的之一是提供通用的轉(zhuǎn)錄單位，其使得能夠提供相比于用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，大鼠YB2/0細(xì)胞系等，或CHO細(xì)胞系等)的傳統(tǒng)表達(dá)載體而言更好的目的蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯的能力。
[0006]本發(fā)明的其他目的之一是提供使得能夠限制表達(dá)載體大小的轉(zhuǎn)錄單位，以便限制克隆的問題、在表 達(dá)細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)染效率的問題或者可導(dǎo)致遺傳不穩(wěn)定性和目的基因消失的在表達(dá)載體與受者細(xì)胞系基因組之間的干擾的問題。
[0007]最后，其他目的之一是提供沒有病毒啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄單位，以便限制潛在的衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)。
[0008]本發(fā)明涉及用于構(gòu)建表達(dá)載體的轉(zhuǎn)錄單位。
[0009]根據(jù)總的方面，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)錄單位，其由包含下列調(diào)控元件的多核苷酸構(gòu)成:
[0010](i)-hCMVie病毒的增強(qiáng)子(E2)，所述增強(qiáng)子具有核苷酸序列SEQ ID NO: 1，或
[0011]-與序列SEQID NO:1具有至少70%的序列同一性并且實(shí)質(zhì)上擁有轉(zhuǎn)錄激活特性的核苷酸，和
[0012](ii)_細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶9(CDK9)的啟動(dòng)子區(qū)，所述啟動(dòng)子區(qū)具有核苷酸序列 SEQ ID NO: 2，或
[0013]-與序列SEQID NO:2具有至少70%的序列同一性并且實(shí)質(zhì)上擁有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子活性的核苷酸。
[0014]本發(fā)明的范圍內(nèi)，“調(diào)控元件”是指使得能夠控制編碼目的蛋白的核酸的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的非編碼遺傳元件。
[0015]“轉(zhuǎn)錄單位”是指包含對(duì)于目的核酸轉(zhuǎn)錄成RNA來說必需的調(diào)控元件的多核苷酸。使得能夠從與所述轉(zhuǎn)錄單位相連接的目的基因開始來合成mRNA的RNA聚合酶，以及將正地或負(fù)地調(diào)節(jié)向mRNA的轉(zhuǎn)錄的激活性或抑制性轉(zhuǎn)錄因子，可以結(jié)合在這樣的轉(zhuǎn)錄單位上。
[0016]“啟動(dòng)子區(qū)”是指這樣的DNA區(qū)域，其包含使得能夠起始特定目的基因的轉(zhuǎn)錄的特定DNA序列。
[0017]在本發(fā)明的范圍內(nèi)，術(shù)語“啟動(dòng)子區(qū)”和“啟動(dòng)子”可以相互代替。
[0018]啟動(dòng)子區(qū)包含這樣的DNA區(qū)帶，在所述DNA區(qū)帶上，在起動(dòng)RNA合成之前，最初結(jié)合有RNA聚合酶。
[0019]啟動(dòng)子通?？拷?二十左右至一百個(gè)核苷酸)待控制的目的核酸，并且位于基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)動(dòng)位點(diǎn)上游。啟動(dòng)子的存在對(duì)于特定基因的轉(zhuǎn)錄來說是必不可少的。
[0020]由序列SEQ ID N0:2所示的CDK9基因的啟動(dòng)子是富含GC且沒有TATA盒的啟動(dòng)子。
[0021]包含在根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄單位中的“與序列SEQ ID NO:2具有至少70%的序列同一性并且實(shí)質(zhì)上擁有啟動(dòng)子活性的核苷酸”是擁有與由序列SEQ ID NO:2所示的CDK9基因的啟動(dòng)子區(qū)實(shí)質(zhì)上相同的起始基因轉(zhuǎn)錄的能力的核苷酸。
[0022]CDK9基因的啟動(dòng)子區(qū)起始基因轉(zhuǎn)錄的能力可以根據(jù)由Liu等人(Gene252, 51-59(2000))所描述的方法來進(jìn)行測定。
[0023]“增強(qiáng)子”是指這樣的DNA區(qū)段，其可以結(jié)合蛋白質(zhì)例如轉(zhuǎn)錄因子以刺激基因轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子并不必需靠近待控制的目的基因，并且可以位于5’處或3’處，或者甚至在待控制的基因當(dāng)中或在內(nèi)含子中。
[0024]在表達(dá)載體中增強(qiáng)子的存在使得能夠增加基因的轉(zhuǎn)錄水平。
[0025]“與序列SEQ ID NO:1具有至少70%的序列同一性并且實(shí)質(zhì)上擁有轉(zhuǎn)錄激活特性的核苷酸”是擁有與由序列SEQ ID NO:1所示的hCMVie病毒的增強(qiáng)子(在下文中也稱為E2)實(shí)質(zhì)上相同的刺激基因轉(zhuǎn)錄的能力的核苷酸。
[0026]基因轉(zhuǎn)錄激活特性可以通過使用報(bào)道基因(例如，螢光素酶)來進(jìn)行測定。
[0027]多個(gè)增強(qiáng)子可以共存于根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄單位中；這使得能夠進(jìn)一步刺激基因轉(zhuǎn)錄。
[0028]因此，根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄單位可以包含:
[0029]-hCMVie病毒的增強(qiáng)子(E2),所述增強(qiáng)子具有核苷酸序列SEQ IDN0:1,或與序列SEQ ID NO:1具有至少70%的序列同一性并且實(shí)質(zhì)上擁有轉(zhuǎn)錄激活特性的核苷酸，和
[0030]-至少另一個(gè)選自SV40增強(qiáng)子和Eμ增強(qiáng)子的增強(qiáng)子。
[0031]在前面和在此后，兩個(gè)核酸序列之間的同一性百分比可以根據(jù)下式來進(jìn)行計(jì)算:
[0032]
【權(quán)利要求】
1.轉(zhuǎn)錄單位，其由包含下列調(diào)控元件的多核苷酸構(gòu)成: -hCMVie病毒的增強(qiáng)子，所述增強(qiáng)子具有核苷酸序列SEQ ID NO: 1，或與序列SEQ IDNO:1呈現(xiàn)出至少70%的序列同一性并且實(shí)質(zhì)上擁有轉(zhuǎn)錄激活特性的核苷酸， -細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶9 (CDK9)的啟動(dòng)子區(qū)，所述啟動(dòng)子區(qū)具有核苷酸序列SEQ IDNO:2，或與序列SEQ ID NO:2呈現(xiàn)出至少70%的序列同一性并且實(shí)質(zhì)上擁有啟動(dòng)子活性的核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)錄單位，其中所述多核苷酸還包含位于所述啟動(dòng)子區(qū)下游且位于翻譯起始位點(diǎn)上游的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含至少一個(gè)選自下列的5’非翻譯區(qū)(5，UTR): -具有核苷酸序列SEQ ID NO:3的HTLV-1病毒的長末端重復(fù)(LTR)的R區(qū)，或與序列SEQ ID NO:3呈現(xiàn)出至少70%的序列同一性的核苷酸， -具有核苷酸序列SEQ ID NO:4的NF-K B阻抑因子(NRF)基因的5’ UTR區(qū)，或與序列SEQ ID N0:4呈現(xiàn)出至少70%的序列同一性的核苷酸， -具有核苷酸序列SEQ ID NO: 5的真核起始因子4GI (eIF4GI)基因的5’UTR區(qū)，或與序列SEQ ID NO:5呈現(xiàn)出至少70%的序列同一性的核苷酸， 與上述序列SEQ ID NO:3、4、5擁有至少70 %的序列同一性的上述核苷酸實(shí)質(zhì)上具有mRNA穩(wěn)定化和促進(jìn)翻譯的特性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)錄單位，其中所述多核苷酸還包含位于所述啟動(dòng)子區(qū)下游且位于翻譯起始位點(diǎn)上游的內(nèi)含子，所述內(nèi)含子選自下列: -具有核苷酸序列SEQ ID NO: 10的延伸因子la (EFla)基因的內(nèi)含子，或與序列SEQID NO: 10呈現(xiàn)出至少70%的序列同一性的核苷酸， -具有核苷酸序列SEQ ID NO: 11的鼠類ROSA內(nèi)含子，或與序列SEQ ID NO: 11呈現(xiàn)出至少70%的序列同一'丨生的核苷酸， -具有核苷酸序列SEQ ID NO: 12的HTLV-1病毒的5’LTR內(nèi)含子，或與序列SEQ ID NO: 12呈現(xiàn)出至少70%的序列同一性的核苷酸， -具有核苷酸序列SEQ ID NO: 13的pCI_neo內(nèi)含子，或與序列SEQ ID NO: 13呈現(xiàn)出至少70%的序列同一'丨生的核苷酸， -具有核苷酸序列SEQ ID NO:53的遍在蛋白基因的內(nèi)含子，或與序列SEQ ID N0:53呈現(xiàn)出至少70%的序列同一性的核苷酸， -具有核苷酸序列SEQ ID NO: 54的人ROSA內(nèi)含子，或與序列SEQ ID NO: 54呈現(xiàn)出至少70%的序列同一'丨生的核苷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的轉(zhuǎn)錄單位，其中所述多核苷酸還包含內(nèi)含子，所述內(nèi)含子選自下列: -具有核苷酸序列SEQ ID NO: 10的延伸因子I a (EFl a )基因的內(nèi)含子，或與序列SEQID NO: 10呈現(xiàn)出至少70%的序列同一性的核苷酸， -具有核苷酸序列SEQ ID NO: 11的鼠類ROSA內(nèi)含子，或與序列SEQ ID NO: 11呈現(xiàn)出至少70%的序列同一'丨生的核苷酸， -具有核苷酸序列SEQ ID NO: 12的HTLV-1病毒的5’LTR內(nèi)含子，或與序列SEQ ID NO: 12呈現(xiàn)出至少70%的序列同一性的核苷酸，-具有核苷酸序列SEQ ID NO: 13的pCI_neo內(nèi)含子，或與序列SEQ ID NO: 13呈現(xiàn)出至少70%的序列同一'丨生的核苷酸， -具有核苷酸序列SEQ ID NO: 53的遍在蛋白內(nèi)含子，或與序列SEQ ID NO: 53呈現(xiàn)出至少70%的序列同一'丨生的核苷酸， -具有核苷酸序列SEQ ID NO: 54的人ROSA內(nèi)含子，或與序列SEQ ID NO: 54呈現(xiàn)出至少70%的序列同一'丨生的核苷酸， 所述內(nèi)含子位于所述5’ UTR區(qū)下游且位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)錄單 位，其中 -所述啟動(dòng)子區(qū)為⑶K9的啟動(dòng)子區(qū)，所述5’UTR區(qū)為eIF4GI基因的5’UTR區(qū)，并且所述內(nèi)含子為EFla基因的內(nèi)含子，所述轉(zhuǎn)錄單位具有核苷酸序列SEQ ID NO: 33，或者 -所述轉(zhuǎn)錄單位具有與序列SEQ ID N0:33呈現(xiàn)出至少70%的序列同一性并且允許比用與CDK9的啟動(dòng)子區(qū)相聯(lián)合的CMV增強(qiáng)子的組合所獲得的單位體積產(chǎn)量高的目的蛋白的單位體積產(chǎn)量的核苷酸。
6.表達(dá)載體，其包含至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所定義的轉(zhuǎn)錄單位，和至少一個(gè)允許編碼目的蛋白的核苷酸的整合的克隆位點(diǎn)。
7.表達(dá)載體，其包含至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所定義的轉(zhuǎn)錄單位，和至少一個(gè)允許編碼目的蛋白的核苷酸的整合的用于位點(diǎn)專一重組的位點(diǎn)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7的表達(dá)載體，其還包含真核生物抗性基因、細(xì)菌抗性基因、細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)和專門用于基因擴(kuò)增的單位。
9.根據(jù)權(quán)利要求6或7的表達(dá)載體，其中所述目的蛋白選自參與凝血的蛋白質(zhì)或免疫球蛋白、細(xì)胞因子、激素、生長因子或補(bǔ)體因子和任何融合蛋白。
10.宿主細(xì)胞，其包含有在權(quán)利要求6至9中任一項(xiàng)之中所定義的表達(dá)載體。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞為YB2/0細(xì)胞系。
12.根據(jù)權(quán)利要求6的表達(dá)載體用于轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的用途。
13.表達(dá)系統(tǒng)，其包含根據(jù)權(quán)利要求6至9中任一項(xiàng)所定義的表達(dá)載體和根據(jù)權(quán)利要求10或11所定義的宿主細(xì)胞，允許由核苷酸所編碼的目的蛋白的表達(dá)。
14.包含至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)錄單位的表達(dá)載體在根據(jù)權(quán)利要求9的宿主細(xì)胞中用于產(chǎn)生由核苷酸所編碼的目的蛋白的用途，其中所述目的蛋白以比在參照表達(dá)載體中更高的滴度產(chǎn)生，所述參照表達(dá)載體至少包含RSV啟動(dòng)子、pC1-neo內(nèi)含子、多腺苷酸化序列、真核生物抗性基因、細(xì)菌抗性基因、細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)和專門用于基因擴(kuò)增的單位，所述參照載體包含相同的核苷酸序列。
15.在體外產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的方法，其包括下列步驟: -將包含至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)錄單位和編碼目的蛋白的cDNA的表達(dá)載體引入到宿主細(xì)胞中， -選擇和鑒定穩(wěn)定地表達(dá)所述目的蛋白的在前一個(gè)步驟中所獲得的宿主細(xì)胞， -提取和純化所述目的蛋白。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其還包括選擇和鑒定穩(wěn)定地表達(dá)所述目的蛋白的所獲得的宿主細(xì)胞的步驟。
【文檔編號(hào)】C07K16/00GK104024417SQ201280052884
【公開日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2012年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月28日
【發(fā)明者】A·豐泰納, F·庫塔爾 申請(qǐng)人:法國實(shí)驗(yàn)室分餾生物技術(shù)公司