應(yīng)用RPA技術(shù)檢測(cè)CaMV 35S啟動(dòng)子和nos終止子的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了含P-35S和T-nos元件轉(zhuǎn)基因作物的RPA篩選檢測(cè)方法。具體公開了一種適用于重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)鑒定含有轉(zhuǎn)基因元件CaMV?35S啟動(dòng)子和nos終止子轉(zhuǎn)基因植物的引物及探針組合，其正向引物序列如SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.4所示，反向引物序列如SEQ?ID?No.2和SEQ?ID?No.5所示，探針序列如SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.6所示。同時(shí)，本發(fā)明還公開了一種鑒定含有這兩種元件轉(zhuǎn)基因作物的方法：提取待測(cè)樣品的DNA作為模板，利用所述的引物進(jìn)行RPA快速擴(kuò)增及實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)，如果得到明顯的擴(kuò)增曲線，則證明所檢樣品DNA中含有轉(zhuǎn)P-35S或T-nos基因成分。
【專利說明】應(yīng)用RPA技術(shù)檢測(cè)CaMV 35S啟動(dòng)子和nos終止子
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及的是用于重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Recombinase Ploymerase Amplification, RPA)快速鑒定轉(zhuǎn)基因植物中 CaMV 35S啟動(dòng)子(P-35S)和/或nos終止子(T-nos)成分，具體涉及相關(guān)的引物和探針組合及其監(jiān)定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前DNA擴(kuò)增是核酸檢測(cè)的主要方法，常用的PCR檢測(cè)需要精密的儀器以及繁瑣的試驗(yàn)程序，難以滿足非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的要求。近年來，核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)得到了長足的發(fā)展，與傳統(tǒng)PCR相比核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)不需要昂貴的PCR儀，可在短時(shí)間內(nèi)快速擴(kuò)增出目的片段，具有簡便，快速，靈敏等優(yōu)點(diǎn)。RPA技術(shù)是模擬生物體內(nèi)DNA復(fù)制、基于重組酶聚合酶介導(dǎo)的擴(kuò)增原理發(fā)展而來，利用重組酶和引物形成微絲在模板DNA上搜索到與之完全互補(bǔ)的序列時(shí)，在單鏈DNA結(jié)合蛋白的幫助下，使模板DNA解鏈，引物與模板DNA開始配對(duì)形成復(fù)制所需自由的3’羥基末端，在DNA聚合酶的作用下進(jìn)行復(fù)制延伸，形成新的DNA互補(bǔ)鏈反應(yīng)產(chǎn)物也是以指數(shù)級(jí)增長。與常規(guī)PCR反應(yīng)不同，RPA反應(yīng)所需引物長度通常為30-35 nt。引物設(shè)計(jì)時(shí)為了避免形成引物內(nèi)部及之間的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其長度的增加也使引物設(shè)計(jì)及選擇難度增加，引物序列的設(shè)計(jì)與選擇對(duì)RPA的結(jié)果至關(guān)重要。在RPA擴(kuò)增體系中加入一個(gè)熒光標(biāo)記的探針便可實(shí)現(xiàn)模板擴(kuò)增的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，該探針中部兩個(gè)T堿基上各標(biāo)記一個(gè)熒光集團(tuán)(FAM和BHQl )，在兩個(gè)集團(tuán)之間有一個(gè)脫堿基位點(diǎn)(dSpacer)，該位點(diǎn)可被一種來自大腸桿菌的核酸外切酶識(shí)別，該酶具有3’-5’外切酶活性，可以使兩個(gè)熒光集團(tuán)分離，從而使熒光信號(hào)與擴(kuò)增產(chǎn)物的累積相同步。結(jié)合一個(gè)便攜式的熒光擴(kuò)增檢測(cè)儀便可在10-20分鐘內(nèi)檢測(cè)到熒光曲線。RPA技術(shù)極大地縮短了檢測(cè)時(shí)間，簡化了反應(yīng)程序，與DNA快速提取技術(shù)相結(jié)合使野外檢測(cè)成為可能，具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0003]目前轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品種類繁多，引起了公眾的廣泛關(guān)注，建立一種快速簡便的室外檢測(cè)方法具有重要意義，可用于市場(chǎng)監(jiān)管和例行監(jiān)測(cè)，為轉(zhuǎn)基因生物安全管理提供技術(shù)支撐。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的核酸檢測(cè)依據(jù)其特異性可分為篩選、基因、構(gòu)建和事件(轉(zhuǎn)化體)特異性檢測(cè)。篩選檢測(cè)是通過對(duì)外源轉(zhuǎn)基因調(diào)控元件的檢測(cè)來判斷產(chǎn)品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分，它是一種最經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)過程，又是進(jìn)行進(jìn)一步轉(zhuǎn)基因身份確認(rèn)檢測(cè)的基礎(chǔ)。煙草花葉病毒35S啟動(dòng)子(P-35S)和胭脂堿合成酶終止子(T-nos)是轉(zhuǎn)基因作物中常見的轉(zhuǎn)基因元件，它們是轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中重要的靶標(biāo)。在已報(bào)道的轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)方法中，主要是利用PCR儀在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行常規(guī)的檢測(cè)，該方法還不能進(jìn)一步滿足轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的快速檢測(cè)。國內(nèi)外目前還沒有利用RPA技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因植物做篩選鑒定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)上述領(lǐng)域的空白，本發(fā)明應(yīng)用了 RPA方法快速、準(zhǔn)確、簡便檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物中的CaMV 35S啟動(dòng)子(P-35S)和/或nos終止子(T_nos)基因的成分。
[0005]本發(fā)明提供的技術(shù)方案是:一種用于通過重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)鑒定植物中含有P-35S和/或T-nos轉(zhuǎn)基因成分的引物及探針組合，鑒定含有P-35S轉(zhuǎn)基因成分的RPA引物和探針組合特征在于:其正向引物序列如SEQ ID N0.1所示，反向引物序列如SEQ IDN0.2所示，探針序列如SEQ ID N0.3所示；鑒定含有T-nos轉(zhuǎn)基因成分的RPA引物和探針組合特征在于:其正向引物序列如SEQ ID N0.4所示,反向引物序列如SEQ ID N0.5所示，探針序列如SEQ ID N0.6所示。
[0006]本發(fā)明還提供一種通過重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)鑒定植物中含有P-35S和/或T-nos轉(zhuǎn)基因成分的試劑盒，該試劑盒包含上述的引物和探針。
[0007]本發(fā)明還提供一種通過重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)鑒定含有P-35S和/或T-nos轉(zhuǎn)基因植物的方法:提取待測(cè)樣品的DNA作為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物進(jìn)行熒光快速檢測(cè)，如果得到明顯的擴(kuò)增曲線，則證明所檢樣品含有P-35S或T-nos轉(zhuǎn)基因成分。實(shí)施步驟為:向RPA擴(kuò)增試劑盒推薦的50μ L擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入引物各2μ L (10 μ mol/L),探針0.5yL (10ymol/L)，模板DNA 50ng。鑒定P-35S擴(kuò)增程序?yàn)?RPA擴(kuò)增檢測(cè)儀(或熒光定量PCR儀)39攝氏度反應(yīng)15分鐘；鑒定T-nos擴(kuò)增程序?yàn)?RPA擴(kuò)增檢測(cè)儀(或熒光定量PCR儀)39攝氏度反應(yīng)25分鐘。
[0008]本發(fā)明方法是根據(jù)外源插入調(diào)控元件的DNA序列設(shè)計(jì)大量RPA特異性引物，從中各篩選出一套可快速有效檢測(cè)出含P-35S和T-nos轉(zhuǎn)基因成分的引物及探針組合。以轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號(hào)為材料建立了含有P-35S和/或T-nos元件轉(zhuǎn)基因作物的RPA檢測(cè)方法(圖1和圖2)。將陽性模板科豐6號(hào)基因組DNA用水稀釋至10000，2000，500，100，50個(gè)拷貝，結(jié)果都有擴(kuò)增曲線(圖3和圖4)，即最低可檢測(cè)50個(gè)拷貝，該方法具有較高的靈敏度。利用兩組引物及探針組合分別進(jìn)行快速擴(kuò)增及實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)，以轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號(hào)和轉(zhuǎn)基因棉花MON 531等8種陽性樣品的基因組DNA為模板可以得到明顯的擴(kuò)增曲線，以非轉(zhuǎn)基因水稻和玉米等4種陰性樣品的基因組DNA為模板擴(kuò)增均沒有擴(kuò)增曲線(表2)。本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)P-35S和T-nos基因作物的RPA熒光篩選檢測(cè)方法。該方法使生物技術(shù)產(chǎn)品在準(zhǔn)確、快速檢測(cè)方面的能力得到提高。
[0009]附圖(表)說明
圖1為P-35S熒光檢測(cè)圖，其中，1:轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號(hào)；2:非轉(zhuǎn)基因水稻；
圖1為T-nos熒光檢測(cè)圖，其中，1:轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號(hào)；2:非轉(zhuǎn)基因水稻；
圖3為P-35S靈敏度試驗(yàn)圖，從I到6模板拷貝數(shù)依次為10000 ；2000 ；500 ；100 ；50 ；0 ； 圖4為T-nos靈敏度試驗(yàn)圖，從I到6模板拷貝數(shù)依次為10000 ；2000 ；500 ；100 ；50 ;0。
[0010]
【具體實(shí)施方式】
[0011]下面通過【具體實(shí)施方式】的詳細(xì)描述來進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但并不是對(duì)本發(fā)明的限制，僅僅作示例說明。
[0012]下面實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等的《分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)中所述條件，或按照儀器或試劑制造廠商所建議的條件。
[0013]首先，引物設(shè)計(jì)和篩選:引物設(shè)計(jì)時(shí)通常需要考慮以下幾個(gè)因素:(I) GC含量在40%-60%；(2)盡量避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)；(3)避免引物出現(xiàn)重復(fù)序列。RPA對(duì)引物長度要求為30-35nt，RPA實(shí)驗(yàn)需要從靶標(biāo)序列兩端設(shè)計(jì)多對(duì)引物進(jìn)行優(yōu)化，篩選，個(gè)別堿基的替換或增減都會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生重要影響。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)外源插入調(diào)控原件P-35S(GenBank N0.A18053)DNA序列設(shè)計(jì)一條探針并在其兩側(cè)設(shè)計(jì)8條上游引物和8條下游引物，根據(jù)T-nos (GenBank N0.V00087) DNA序列設(shè)計(jì)一條探針并在其兩側(cè)設(shè)計(jì)4條上游引物和4條下游引物。以500個(gè)拷貝科豐6號(hào)基因組DNA為模板對(duì)P-35S和T-nos不同引物組合進(jìn)行熒光篩選，最終各篩選出了一對(duì)擴(kuò)增起飛時(shí)間短并且熒光信號(hào)強(qiáng)的引物用于RPA突光檢測(cè)，引物和探針序列見表1。
[0014]表1
【權(quán)利要求】
1.一種用于通過重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)鑒定植物中含有CaMV 35S啟動(dòng)子和/或nos終止子轉(zhuǎn)基因成分的RPA引物和探針組合，其特征在于:鑒定含有P-35S轉(zhuǎn)基因成分的正向引物序列如SEQ ID N0.1所示,反向引物序列如SEQ ID N0.2所示,探針序列如SEQ IDN0.3所示；鑒定含有T-nos轉(zhuǎn)基因成分的正向引物序列如SEQ ID N0.4所示，反向引物序列如SEQ ID N0.5所示,探針序列如SEQ ID N0.6所示。
2.一種鑒定轉(zhuǎn)基因植物中含有P-35S和/或T-nos轉(zhuǎn)基因成分的試劑盒，其特征在于:該試劑盒包含權(quán)利要求1所述的引物和探針組合。
3.一種通過重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)鑒定轉(zhuǎn)基因植物中含有P-35S和/或T-nos轉(zhuǎn)基因成分的方法，其特征在于:提取待測(cè)樣品的DNA作為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物及探針組合進(jìn)行快速擴(kuò)增及實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)，如果得到明顯的擴(kuò)增曲線，則證明所檢樣品含有P-35S或T-nos轉(zhuǎn)基因成分。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于: 向50 μ L擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入濃度為10 μ mol/L正向引物及反向弓丨物各2 μ L，濃度為10 μ mol/L 探針 0.5 μ L，模板 DNA 50ng ； 鑒定P-35S擴(kuò)增程序?yàn)?RPA擴(kuò)增檢測(cè)儀或熒光定量PCR儀于39攝氏度反應(yīng)15分鐘；鑒定T-nos擴(kuò)增程序?yàn)?RPA擴(kuò)增檢測(cè)儀或熒光定量PCR儀于39攝氏度反應(yīng)25分鐘。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103509875SQ201310506260
【公開日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2013年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月24日
【發(fā)明者】金蕪軍, 宛煜嵩, 徐潮, 苗朝華, 李亮, 黃衛(wèi)紅 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所