一種中性低溫木糖苷酶CaXyl43A及其基因和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種中性低溫木糖苷酶CaXyl43A及其基因和應(yīng)用。其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，本發(fā)明的木糖苷酶的具有以下性質(zhì)：最適pH6.8，最適溫度35℃，在0℃保持酶活，比活為181.6U/mg；具有木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶和外切木聚糖酶的活性；具有一定的木糖耐受性和完全降解木寡糖生成木糖的能力；且易于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。做為一種新型的廣譜酶制劑,可廣泛用于水產(chǎn)飼料、食品、造紙、能源工業(yè)等。
【專利說明】
一種中性低溫木糖苷酶CaXy 143A及其基因和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種中性低溫木糖苷酶CaXy 143A 及其基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 木聚糖(xylan)是植物生物質(zhì)的主要成分，在自然界中的含量僅次于纖維素 (Lynd et al .Microbiology and Molecular Biology Review,2002,66:506-577)，其有效利用具 有重要的意義。木聚糖的生物降解需要木聚糖酶(EC 3.2.1.8)將多聚糖切割成木寡糖，再 由木糖苷酶（EC 3.2. 1.37)進一步將木寡糖降解生成木糖（Collins et al.FEMS Microbiology Review 2005,29:3-23)。因此木糖苷酶在木聚糖降解過程中起著限速酶的 作用，可以減輕木聚糖酶的產(chǎn)物抑制作用（De Almeida et al .FEMS Microbiology Letters 1995,130:171-175)。多種微生物，包括細菌、古細菌、真菌等，都可以產(chǎn)生木糖苷 酶，且木糖苷酶多為胞內(nèi)酶，因此在生物能量轉(zhuǎn)化方面也起著重要的作用 (Saha.Bioresource Technology,2003,90:33-38；Jordan and Wagschal.Applied Microbiology and Biotechnology, 2010,86:1647-1658)?；诜栈嵝蛄泻痛呋虻慕Y(jié) 構(gòu)，木糖苷酶劃分在糖苷水解酶第3、39、43和52家族(111^?://?〇^.〇327.〇找/^17(3〇81(16-hydrolases .html)。第43家族的木糖苷酶數(shù)量多，且一般具有多種活性，因此在工業(yè)領(lǐng)域中 具有更廣泛的應(yīng)用前景。
[0003] 絲狀真菌易于培養(yǎng)、含有多種木糖苷酶編碼基因而成為木糖苷酶的理想來源。大 多數(shù)絲狀真菌來源的木糖苷酶都是中溫或高溫酶，在環(huán)境溫度或低溫條件下喪失酶活。開 發(fā)中性低溫的木糖苷酶在節(jié)約能源、保護環(huán)境、易于催化反應(yīng)等方面具有重要的意義。
[0004] 盡管真菌來源的木糖苷酶已廣泛應(yīng)用于不同的工業(yè)領(lǐng)域，獲得新型具有優(yōu)良特性 的中性低溫木糖苷酶仍具有重大的研究意義與應(yīng)用價值?？寺『彤愒幢磉_中性低溫木糖苷 酶，為生物降解、飼料、食品和造紙工業(yè)提供經(jīng)濟有效、環(huán)境友好的候補酶，是木糖苷酶應(yīng)用 于工業(yè)化生產(chǎn)所必需的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種能高效應(yīng)用的中性低溫木糖苷酶。
[0006] 本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述中性低溫木糖苷酶的基因。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。
[0009] 本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述中性低溫木糖苷酶的基因工程方法。
[0010] 本發(fā)明的另一目的提供上述中性低溫木糖苷酶的應(yīng)用。
[0011 ] 本發(fā)明從枝孢菌(Cladosporium acalyphae SL-16)中分離得到一種新的中性低 溫木糖苷酶CaXyl 43A。
[0012]上述中性低溫木糖苷酶CaXyl43A，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0013] SEQ ID NO.1：
[0014] MTDPTQKDPSPIVTHLFTADPSAHVFNGKLYVYPSHDRETDIQDNDNGDQYDMNDYHVFSMPNVEGPVTDHGIALKA SDIPWVDKQLWAPDAAEKNGKYYLYFPARDKEGIFRIGVAVADQPEGPFKPDENYIPGSYSIDPASFVDDDGQAYLY FGGIWGGQLQCWRTGEFKRDAYSTMEAD⑶EPALMPRVAKLSDDMHTFSSDVQDLWNDTDGKPIHASKHDRRFFEA AffMHKYQGKYYFSYSTGDTHYLAYAI⑶SPLGPFTYQDRILEPVKGWTTHHSIAEFKGKWYLFYHDTSISGKNHLRC VKIREIVYDEQGKIKLAQPQE
[0015] 其中，該酶基因編碼329個氨基酸，N端無信號肽序列，理論分子量為37.6kDa。
[0016] 本發(fā)明的木糖苷酶CaXy143A在中性(pH 6.5-6.8)和中低溫(30-40°C )范圍內(nèi)均具 有高活性的特性。本發(fā)明篩選到Cl ado sporium aca lyphae SL-16所產(chǎn)生的木糖苷酶 CaXy 143A，其最適pH值為6.8，在pH6.5~7.2的范圍內(nèi)維持70%以上的酶活性;最適溫度為 35°C，在30-40°C間均具有80%以上的酶活力；在(TC條件下還有酶活;具有木糖苷酶、阿拉 伯呋喃糖苷酶和外切木聚糖酶的活力。這種性質(zhì)的中性低溫木糖苷酶還未曾有過報道。
[0017] 本發(fā)明提供了編碼上述中性低溫木糖苷酶CaXyl43A。具體地，該基因的基因組序 列如SEQ ID NO.2所示：
[0018] atgaccgaccctacacagaaagaccccagcccgatcgtcacccatctcttcacagctgaccccagcgctcacgtctt caatggcaagctctacgtctacccttcccacgacagggagaccgacatccaggacaacgacaatggcgaccagtatg acatgaacgactaccacgtcttctccatgcccaatgtggaaggccccgtcaccgaccacggcatcgccctcaaggca tcagatatcccatgggtggataagcagctctgggcacccgatgctgcggagaagaacggcaaatactacctctactt ccccgccagagacaaggagggtatcttcagaatcggtgttgctgtcgccgaccagcctgagggacctttcaagcccg acgagaactacatccccggcagctacagcatcgaccccgccagctttgttgacgatgacggccaggcctacctttac ttcggcggtatctggggtggtcagetgcagtgctggcggaccggcgagttcaagcgcgacgcctactcgaccatgga agccgacggcgacgaacccgctctcatgcctcgcgtggccaaactgagcgacgacatgcacaccttctccagcgacg tgcaggacctcgtcgtcaacgacaccgacggcaagccgatccacgccagcaagcacgaccgccgcttcttcgaggcc gcgtggatgcacaagtaccagggcaaatactacttctcatactccaccggcgacacccactacctcgcatacgccat tggcgactctccactcggacccttcacataccaggacagaatcttggagcctgtcaaaggctggacgacgcaccact ctattgcggagttcaagggcaagtggtacttgttctaccacgacacgagcatctcgggcaagaaccacttgcgctgc gtcaagatcagggagatcgtgtacgatgagcagggcaagatcaagttggcgcagccgcaggagtag
[0019] 本發(fā)明通過PCR的方法分離克隆了木糖苷酶基因 Caxyl43A，DNA全序列分析結(jié)果表 明，木聚糖酶Caxy 143A結(jié)構(gòu)基因全長990bp，沒有內(nèi)含子。
[0020] 成熟蛋白理論分子量為37.6kDa。所述CaXyl43A是一種新的木糖苷酶。
[0021] 本發(fā)明還提供了包含上述中性低溫木糖苷酶基因 Caxyl43A的重組載體，優(yōu)選為 pET30-Caxyl43A。將本發(fā)明的木糖苷酶基因插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間， 使其核苷酸序列可操作的與表達調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實施方案， 優(yōu)選為將本發(fā)明的木糖苷酶基因插入到質(zhì)粒pET30(a)上的NdeI和EcoRI限制性酶切位點之 間，使該核苷酸序列位于T7啟動子的下游并受其調(diào)控，得到重組大腸桿菌表達質(zhì)粒pET30-Caxyl43A〇
[0022] 本發(fā)明還提供了包含上述中性低溫木糖苷酶基因 Caxyl43A的重組菌株，優(yōu)選所述 菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌、乳酸桿菌、曲霉或木霉，優(yōu)選為重組菌株P(guān)ET30/ Caxyl43A〇
[0023] 本發(fā)明還提供了一種制備中性低溫木糖苷酶CaXyl43A的方法，包括以下步驟：
[0024] 1)用上述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，得重組菌株；
[0025] 2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組木糖苷酶表達；以及
[0026] 3)回收并純化所表達的木糖苷酶CaXyl43A。
[0027] 其中，優(yōu)選所述宿主細胞為大腸桿菌，優(yōu)選將重組大腸桿菌表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿 菌細胞(Escherichia coli)BL21，得到重組菌株pET30/Caxyl43A。
[0028] 本發(fā)明還提供了上述中性低溫木糖苷酶CaXyl43A的應(yīng)用。
[0029] 本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，獲得中性低溫木糖苷酶 的菌物資源，提供一種性質(zhì)優(yōu)良的、適合于在飼料、食品、工業(yè)中應(yīng)用新的中性低溫木糖苷 酶。本發(fā)明的木糖苷酶最適pH為6.8，在pH6.5~7.2都有較高的酶活性;在中性范圍內(nèi)pH穩(wěn) 定性好;比活力為181.6U/mg;具有寬泛的底物特異性。其中性低溫的特點，可降低木糖苷酶 在工業(yè)生產(chǎn)上的能源成本。其寬泛的底物特異性可以提高降解效率，增加木聚糖的利用率。 還可以在常溫條件下，將生物質(zhì)降解的木寡糖轉(zhuǎn)化為有價值的可發(fā)酵的木糖。因此，本木糖 苷酶在多個產(chǎn)業(yè)可以與木聚糖酶協(xié)同作用，完全降解木聚糖。
【附圖說明】
[0030] 圖1在大腸菌中表達的重組木糖苷酶的SDS-PAGE分析，其中，1:純化的重組木糖苷 酶;M:低分子量蛋白質(zhì)Marker。
[0031] 圖2重組木糖苷酶的最適pH。
[0032] 圖3重組木糖苷酶的pH穩(wěn)定性。
[0033]圖4重組木糖苷酶的最適溫度。
[0034]圖5重組木糖苷酶的熱穩(wěn)定性。
[0035]圖6重組木糖苷酶的木糖耐受性。
【具體實施方式】
[0036] 試驗材料和試劑
[0037] 1、菌株及載體:本發(fā)明從枝孢菌Cladosporium acalyphae SL-16。大腸桿菌表達 載體pET30(a)及菌株BL21。
[0038] 2、酶類及其它生化試劑：內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，連接酶購自Invitrogen公司。對 硝基苯基-β-D-木糖（pNPX)、對硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖（pNPAf)和櫸木木聚糖購自 Sigma公司，其它都為國產(chǎn)試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到）。
[0039] 3、培養(yǎng)基：
[0040] (I )Cladosporium acalyphae SL-16培養(yǎng)基為馬鈴薯汁培養(yǎng)基：1000 mL馬鈴薯汁， IOg葡萄糖，25g瓊脂，ρΗ5·0。
[0041 ] (2)大腸桿菌培養(yǎng)基LB(1 %蛋白胨、0.5 %酵母提取物、1 % NaCl，pH7.0)。
[0042]說明：以下實施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實驗方法，均參照《分子克隆實驗 指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書 進行。
[0043] 實施例1 枝抱菌Cladosporium acalyphae SL-16產(chǎn)酶特性
[0044] 將枝孢菌Cladosporium acalyphae SL-16經(jīng)馬鈴薯汁培養(yǎng)基培養(yǎng)后，制成孢子懸 液，接種于鼓皮液體培養(yǎng)基中（Luo et al .Enzyme Microbial Technology,2009,45:126-133)，15°(：培養(yǎng)7(1，以111^的對硝基苯基-|3-0-木糖為底物，在？!16.0和30°(：條件下反應(yīng)10min，以分光光度計法確定其具有木糖苷酶活性。
[0045] 實施例2枝抱菌Cladosporium acalyphae SL-16木糖苷酶編碼基因 Caxyl43A的 克隆
[0046] 提取枝抱菌Cladosporium acalyphae SL-16基因組DNA:
[0047]將液體培養(yǎng)3天的菌絲體用無菌濾紙過濾放入研缽中，加入2mL提取液，研磨5min， 然后將研磨液置于50mL離心管中，65°C水浴鍋裂解20min，每隔IOmin混勻一次，在4°C下 1000 Orpm離心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去雜蛋白，再取上清加入等體積異丙醇，于 室溫靜置5min后，4 °C下1000 Orpm離心10min。棄上清，沉淀用70 %的乙醇洗滌兩次，真空干 燥，加入適量TE溶解，置于-20 °C備用。
[0048] 設(shè)計合成特異引物 Caxyl43A_F/Caxyl43A_F:
[0049] Caxy143A-F：5'-atgaccgaccctacacagaaagacc-3'；
[0050] Caxy143A-R：5'-ctactcctgcggctgcgccaacttg-3'；
[0051 ] 以枝抱菌Cladosporium acalyphae SL-16總DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)參 數(shù)為：94°C變性5min;然后94°C變性30sec，60°C退火30sec，72°C延伸60sec，30個循環(huán)后72 °C保溫lOmin。得到一約990bp片段，將該片段回收后與pEASY-T3載體相連送三博生物技術(shù) 有限公司測序。
[0052] 實施例3枝抱菌Cladosporium acalyphae SL-16木糖苷酶基因的RT-PCR分析
[0053] 提取枝抱菌Cladosporium acalyphae SL-16的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄酶得到cDNA的 一條鏈，然后以引物Caxy 143A-E-F/Caxyl43A-E-F擴增該單鏈cDNA，獲得木聚糖酶的cDNA序 列，擴增得到產(chǎn)物回收后送三博生物技術(shù)有限公司測序。
[0054] Caxy143A-E-F：5'-atgaccgaccctacacagaaagacc-3'；
[0055] Caxyl43A-E-R：5'-ggggaattcctagtggtggtggtggtggtgctcctgcggctgcgccaacttg-3，；
[0056] 通過比較木糖苷酶的基因組序列和cDNA序列后發(fā)現(xiàn)該基因沒有內(nèi)含子，編碼329 個氨基酸和一個終止密碼子，無信號肽序列，分離克隆得到的編碼木糖苷酶的基因為新基 因。
[0057]實施例4重組木糖苷酶的制備。
[0058] 將表達載體pET30(a)進行雙酶切（Nedl+EcoRI)，同時將編碼木糖苷酶的基因 Caxyl43A雙酶切(Nedl+EcoRI)，切出編碼木糖苷酶的基因片段與表達載體pET30(a)連接， 獲得含有枝孢菌Cladosporium acalyphae SL-16木糖苷酶基因 Caxyl43A的重組質(zhì)粒 pET30-Caxyl43A并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，獲得重組大腸桿菌菌株pET30/Caxyl43A。
[0059] 取含有重組質(zhì)粒的BL21菌株，接種于IOOmL LB培養(yǎng)液中，16°C150rpm振蕩培養(yǎng)12h 后，加入0.6% IPTG誘導(dǎo)IOh，收集細胞，超聲波破碎，離心收集上清液。測定木糖苷酶的活 力。重組木糖苷酶的表達量為0.86U/mL。SDS-PAGE結(jié)果（圖1)表明，重組木糖苷酶在大腸桿 菌中得到了表達。所表達的木糖苷酶經(jīng)過純化之后，其蛋白質(zhì)的含量達到總蛋白的15%以 上。
[0060] 實施例5重組木糖苷酶的活性分析
[0061] 分光光度計法（Shao et al .Applied and Environmental Microbiology ,2011， 77:719-726):具體方法如下：在pH6.8,35°C條件下，ImL的反應(yīng)體系包括IOOyL適當(dāng)?shù)南♂?酶液，900yL ImM的對硝基苯基-β-D-木糖，反應(yīng)10min，冷卻后405nm測定OD值。1個酶活單位 (U)定義為在給定的條件下每分鐘釋放出Iymol對硝基苯的酶量。
[0062]實施例6重組木糖苷酶CaXyl43A的性質(zhì)測定
[0063] 1、重組木糖苷酶CaXy 143A的最適pH和pH穩(wěn)定性的測定方法如下：
[0064] 將實施例4純化的重組木糖苷酶在不同的pH下進行酶促反應(yīng)以測定其最適pH。底 物對硝基苯基-β-D-木糖用不同pH的0.1m 〇l/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中30°C下進行木 糖苷酶活力測定。結(jié)果（圖2)表明，CaXy 143A的最適pH為6.8，在pH6.5~7.2的范圍內(nèi)，酶活 性均維持在最大酶活性的60%以上。木糖苷酶于上述各種不同pH的緩沖液中30°C處理 6〇min，再在 PH6.8緩沖液體系中35 °C下測定酶活性，以研究酶的pH耐性。結(jié)果（圖3)表明木 糖苷酶在pH 5.0-8.0之間均很穩(wěn)定，在此pH范圍內(nèi)處理60min后剩余酶活性在70 %以上，這 說明此酶pH穩(wěn)定性較好。
[0065] 2、木糖苷酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性測定方法如下：
[0066]木糖苷酶的最適溫度的測定為在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH6.8)緩沖液體系 及不同溫度下進行酶促反應(yīng)。耐溫性測定為木糖苷酶在不同溫度下處理不同時間，再在 pH6.8、35°C下進行酶活性測定。酶反應(yīng)最適溫度測定結(jié)果（圖4)表明其最適溫度為35°C。酶 的熱穩(wěn)定性性試驗表明（圖5 )，重組酶在30 °C時穩(wěn)定性良好。40 °C下保溫60min，喪失80 %的 酶活。
[0067] 3、木糖苷酶的1值測定方法如下：
[0068] 用不同濃度的對硝基苯基-β-D-木糖為底物，在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液 (pH6.0)緩沖液體系中，20 °C和35 °C下測定酶活性，計算出其在20 °C和35 °C下的Km、Vmax、kcat 和kcat/Km值。經(jīng)測定，此木糖苷酶在35 °C下以對硝基苯基-β-D-木糖為底物的km值為2.73mg/ mL，最大反應(yīng)速度Vmax為272.4ymol/min · mg，kcat值為 175.2/s和kcat/Km值為67.4ml/mg · s; 在20°C下以對硝基苯基-β-D-木糖為底物的km值為0.69mg/mL，最大反應(yīng)速度V max*58.1μ mol/min · mg，kcat值為37.4/s和kcat/Km值為54.1ml/mg · s
[0069] 4、不同金屬離子化學(xué)試劑對CaXyl43A酶活的影響測定如下：
[0070] 在酶促反應(yīng)體系中加入不同濃度的不同的金屬離子及化學(xué)試劑，研究其對酶活性 的影響，各種物質(zhì)終濃度為5mmo 1/L。在35 °C、pH6.8條件下測定酶活性。結(jié)果(表1)表明，部 分離子和化學(xué)試劑在濃度為5mmol時對重組木糖苷酶的活力有明顯影響，包括Ni 2+、C〇2+、Mn2 +、Cu2+、Pb2+、Zn2+、Ag.、SDS 和 EDTA。
[0071] 表1.各種化學(xué)試劑對木糖苷酶CaXyl43A活力的影響
[0074] 5、CaXyl43A的底物特異性
[0075] 在酶促反應(yīng)體系中加入不同的底物，研究CaXy 143A的酶活性。在35 °C、pH6.8條件 下測定酶活性。結(jié)果(表2)表明，CaXyl43A同時具有木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶和外切木 聚糖酶的活性。
[0076] 表2.CaXyl43A的底物特異性

[0078] 6、CaXyl43A的木糖耐受性
[0079] 在酶促反應(yīng)體系中加入0-400mM的木糖和4mM或5mM的對硝基苯基-β-D-木糖，研究 CaXy 143A的木糖耐受性。在35°C、pH6.8條件下測定酶活性。結(jié)果（圖6)表明，CaXy143A的木 糖耐受性Ki值為44.3mM。
[0080] 7、CaXyl43A木糖苷酶降解木寡糖的產(chǎn)物分析如下：
[〇〇811 在500yL 5mM的木寡糖(木二糖至木六糖）中加入IOOyL純化的酶液，最適溫度下保 溫12h。用無水乙醇將酶蛋白沉淀，上清液用2500色譜儀，利用高效陰離子交換色譜-脈沖安 培(HPAEC-PAD)檢測方法，進行產(chǎn)物中糖種類的分析。分析結(jié)果表明：CaXyl43A可以完全降 解木寡糖，生成唯一的產(chǎn)物:木單糖。
【主權(quán)項】
1. 一種中性低溫木糖苷酶CaXyl43A，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。2. -種中性低溫木糖苷酶基因 Caxyl43A，其特征在于，編碼權(quán)利要求1所述的中性低溫 木糖苷酶CaXyl43A。3. 如權(quán)利要求2所述的中性低溫木糖苷酶基因 Caxyl43A，其特征在于，其堿基序列如 SEQIDN0.2**。4. 包含權(quán)利要求3所述中性低溫木糖苷酶基因 Caxyl43A的重組載體。5. 包含權(quán)利要求2所述中性低溫木糖苷酶基因 Caxyl43A的重組載體pET30-Caxyl43A。6. 包含權(quán)利要求2所述中性低溫木糖苷酶基因 Caxyl43A的重組菌株。7. 如權(quán)利要求6的重組菌株，其特征在于，所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌、乳 酉支桿囷、曲霉或木霉。8. -種制備中性低溫木糖苷酶CaXyl43A的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 用權(quán)利要求4的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，得重組菌株； 2) 培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組木糖苷酶表達；以及 3) 回收并純化所表達的木糖苷酶CaXy 143A。9. 權(quán)利要求1所述中性低溫木糖苷酶CaXyl43A的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/56GK105861471SQ201610342316
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月23日
【發(fā)明人】姚斌, 馬銳, 柏映國, 黃火清, 羅會穎, 蘇小運, 王亞茹, 王苑, 師霞
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所