阿米卡星含量測(cè)定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種阿米卡星含量測(cè)定方法，采用高效液相色譜與共振瑞利散射聯(lián)用技術(shù)，先用高效液相色譜法將供試品中的阿米卡星洗脫分離，再將洗脫分離后的阿米卡星和探針溶液混合反應(yīng)，最后將混合反應(yīng)后的反應(yīng)液注入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)；高效液相色譜的色譜條件為：以乙腈：水＝7:93為流動(dòng)相；流速＝0.50mL·min?1；探針溶液為磷酸鹽緩沖液；檢測(cè)器為熒光檢測(cè)器。本發(fā)明建立了HPLC?RRS聯(lián)用測(cè)定AMK的新方法，拓寬了RRS技術(shù)的應(yīng)用范圍，并為HPLC提供了全新的檢測(cè)模式。本發(fā)明的檢測(cè)方法簡(jiǎn)便快速、靈敏度高、選擇性好并成功用于不同制劑中AMK含量的測(cè)定中，為下一步藥代動(dòng)力學(xué)的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。
【專利說明】
阿米卡星含量測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于藥物分析技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種阿米卡星含量測(cè)定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 硫酸阿米卡星(又稱丁胺卡那霉素，Amikacin，AMK)屬第三代半合成氨基糖苷類抗 生素，具有抗菌效率高、耐藥性低等優(yōu)點(diǎn)，特別對(duì)耐慶大霉素、妥布霉素等的耐藥菌株有很 強(qiáng)活性，其突出優(yōu)點(diǎn)是對(duì)許多腸道革蘭陰性桿菌所產(chǎn)生的氨基糖苷類鈍化酶穩(wěn)定，不會(huì)被 此類酶鈍化而失去抗菌活性，是臨床廣泛使用的強(qiáng)效廣譜抗生素。但AMK仍具有與其他氨基 糖苷類抗生素相似的耳毒性和腎毒性等副作用，且毒副作用具有明顯的量效依賴關(guān)系，為 了更好地發(fā)揮療效、減少不良反應(yīng)，同時(shí)保證用藥安全，建立一種簡(jiǎn)便、快速、高效并能滿足 臨床上對(duì)AMK檢測(cè)要求的定量分析方法是十分重要的。
[0003] 由于AMK分子結(jié)構(gòu)中無特征紫外吸收基團(tuán)，給AMK的痕量測(cè)定帶來了一定的困難。 目前，中國藥典(2010版)采用微生物法測(cè)定其含量，但該法操作繁瑣，實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)。此外， 分光光度法、熒光法、化學(xué)發(fā)光法、高效液相色譜-柱前衍生法、毛細(xì)管電泳法、質(zhì)譜法等也 有報(bào)道。其中高效液相色譜-柱前衍生法是測(cè)定AMK的首選方法，但衍生化也為測(cè)定帶來了 許多弊端，例如，實(shí)驗(yàn)中需控制多種衍生化條件(衍生試劑的選擇、用量、衍生反應(yīng)的溫度及 時(shí)間等），衍生反應(yīng)可能引入多種干擾測(cè)定的雜質(zhì)離子，此外，衍生試劑毒性大且價(jià)格昂貴。 因此，以上方法均不適于醫(yī)院制劑的快速檢驗(yàn)及痕量分析。
[0004] 共振瑞利散射(resonance Rayleigh scattering，RRS)是指當(dāng)瑞利散射位于或接 近分子吸收帶時(shí)，電子吸收電磁波的頻率與散射光頻率相同，電子因共振而強(qiáng)烈吸收輻射 能量并再次發(fā)生散射的過程。RRS因其靈敏度高、線性范圍較寬、方法簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，已發(fā)展成 為光譜分析中活躍的研究領(lǐng)域。國內(nèi)西南大學(xué)和北京大學(xué)先后在共振光的研究方面進(jìn)行了 開創(chuàng)性的工作。西南大學(xué)的劉紹璞等研究發(fā)現(xiàn)，靜電作用、疏水作用以及電荷轉(zhuǎn)移作用對(duì)于 光譜特征以及RRS強(qiáng)度的增加有重要影響。通過離子締合反應(yīng)，RRS技術(shù)不僅可用于測(cè)定生 物大分子如蛋白質(zhì)、核酸等還可應(yīng)用于痕量離子及藥物小分子的測(cè)定中，極大的拓展了 RRS 的應(yīng)用領(lǐng)域。
[0005] 近年來，RRS與流動(dòng)注射分析及毛細(xì)管電泳聯(lián)用方法的成功建立，表明被測(cè)物可在 動(dòng)態(tài)反應(yīng)中與探針結(jié)合成離子締合物，并被定量檢測(cè)。盡管這些聯(lián)用方法仍存在著一定的 不足，卻充分發(fā)揮了 RRS高靈敏度及高選擇性的優(yōu)點(diǎn)同時(shí)避免了其重現(xiàn)性、穩(wěn)定性較差的不 足。
[0006] 高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC)自 20世紀(jì)70 年代建立以來，以高速、高效、靈敏度高及檢測(cè)范圍廣等特點(diǎn)成為目前應(yīng)用最多的色譜分析 方法，在有機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物開發(fā)與檢測(cè)、食品科學(xué)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、商檢和法檢等方 面都有廣泛的應(yīng)用。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，HPLC已與眾多檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，從傳統(tǒng)的紫外、熒 光檢測(cè)器到先進(jìn)的質(zhì)譜及核磁共振檢測(cè)技術(shù)，HPLC已可同時(shí)滿足對(duì)被測(cè)物定量及定性的分 析需求。HPLC與更為精密的檢測(cè)儀器聯(lián)用的同時(shí)也大大提高了設(shè)備成本及檢測(cè)成本，因此 發(fā)展高效通用的檢測(cè)器仍是HPLC的主要發(fā)展趨勢(shì)之一。
[0007] 雖然高效液相色譜法(HPLC)是目前藥物分析中最常用的檢測(cè)方法，但HPLC與RRS 聯(lián)用(HPLC-RRS)的方法鮮見報(bào)道。RRS技術(shù)與其他分析儀器聯(lián)用方法的成功建立表明其可 以作為一種新型的檢測(cè)方法與HPLC聯(lián)用(HPLC-RRShRRS技術(shù)作為一種新型的HPLC檢測(cè)方 法，其突出優(yōu)點(diǎn)是RRS信號(hào)的產(chǎn)生不依賴于被測(cè)物本身的化學(xué)特性，尤其適用于無紫外特征 吸收及非熒光物質(zhì)的檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 有鑒于此，本發(fā)明要解決制劑中阿米卡星檢測(cè)操作繁瑣，周期長(zhǎng)，檢出限較高，試 劑價(jià)格昂貴且會(huì)產(chǎn)生毒性衍生物的問題，提供一種利用高效液相色譜與共振瑞利散射聯(lián)用 技術(shù)的阿米卡星含量測(cè)定方法。
[0009] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種阿米卡星含量測(cè)定方法，采用高效液 相色譜與共振瑞利散射聯(lián)用技術(shù)，先用高效液相色譜法將供試品中的阿米卡星洗脫分離， 再將洗脫分離后的阿米卡星和探針溶液混合反應(yīng)，最后將混合反應(yīng)后的反應(yīng)液注入檢測(cè)器 進(jìn)行檢測(cè)；
[00?0]進(jìn)一步的，所述高效液相色譜的色譜條件為：以乙腈:水=7:93為流動(dòng)相;流速= 0.50mL · mirT1;所述探針溶液為磷酸鹽緩沖液;所述檢測(cè)器為熒光檢測(cè)器。
[0011] 進(jìn)一步的，所述檢測(cè)波長(zhǎng)Aex = Aem=362nm。
[0012] 進(jìn)一步的，所述磷酸鹽緩沖液溶液濃度為2 · 5 X 10-4mol · L-1 〇
[0013] 進(jìn)一步的，所述磷酸鹽緩沖液溶液PH=3.0。
[0014] 進(jìn)一步的，所述磷酸鹽緩沖液的流速為0.05mL · min-1。
[0015] 進(jìn)一步的，所述探針溶液與洗脫分離后的阿米卡星反應(yīng)的反應(yīng)管長(zhǎng)150cm，內(nèi)徑 0.5mm〇
[0016] 進(jìn)一步的，所述阿米卡星的最低檢測(cè)限為0.5yg · ml/1。
[0017] 進(jìn)一步的，所述阿米卡星的線性范圍為1 .Oyg · ml/1~15.0yg · mL一、
[0018] 進(jìn)一步的，所述色譜條件的色譜柱為C18,5ym，250mmX4.6mm。
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以獲得包括以下技術(shù)效果：
[0020] 1)本發(fā)明的技術(shù)方案，建立了 HPLC-RRS聯(lián)用測(cè)定AMK的新方法。
[0021] 2)本發(fā)明的檢測(cè)方法，方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、選擇性好并成功用于不同制劑 中AMK含量的測(cè)定中，為下一步藥代動(dòng)力學(xué)的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。
[0022] 3)本發(fā)明的HPLC-RRS聯(lián)用方法，進(jìn)一步拓寬了RRS技術(shù)的應(yīng)用范圍，并為HPLC提供 了一種全新的檢測(cè)模式。
[0023] 當(dāng)然，實(shí)施本發(fā)明的任一產(chǎn)品必不一定需要同時(shí)達(dá)到以上所述的所有技術(shù)效果。
【附圖說明】
[0024] 此處所說明的附圖用來提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本發(fā)明的一部分，本發(fā) 明的示意性實(shí)施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中： [0025]圖1為本發(fā)明實(shí)施例中PSB-AMK的RRS光譜圖；
[0026]圖2為本發(fā)明實(shí)施例中pH值對(duì)RRS反應(yīng)的影響圖；
[0027]圖3為本發(fā)明實(shí)施例中PSB-AMK體系的紫外-可見光(UV/VIS)吸收?qǐng)D譜；
[0028] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例中PSB-AMK離子締合物UV/VIS吸收光譜與RRS光譜對(duì)比圖；
[0029]圖5為本發(fā)明實(shí)施例中AMK與PSB反應(yīng)式；
[0030] 圖6為本發(fā)明實(shí)施例中PSB-AMK體系HPLC-RRS色譜圖；
[0031]圖7為本發(fā)明實(shí)施例中PSB濃度對(duì)RRS反應(yīng)的影響圖；
[0032]圖8為本發(fā)明實(shí)施例中探針流速對(duì)RRS反應(yīng)的影響圖。
【具體實(shí)施方式】
[0033]以下將配合附圖及實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方式，藉此對(duì)本發(fā)明如何應(yīng)用 技術(shù)手段來解決技術(shù)問題并達(dá)成技術(shù)功效的實(shí)現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實(shí)施。
[0034] 實(shí)施例
[0035] 1、試劑
[0036] AMK標(biāo)準(zhǔn)品及購自中國藥品生物制品檢定所，鎊胺天藍(lán)(PSB)購自Chroma公司（德 國）。甲醇和乙腈均為色譜純(江蘇省漢邦公司）DBR緩沖溶液由0.04mol · mL-%?〇4、腿〇3、 CH3C00H與0.02mol · mL-SaOH溶液按一定比例混合，配成不同pH值的緩沖溶液，用酸度計(jì)校 正其pH值。三氟乙酸(TFA)為分析純。實(shí)驗(yàn)中使用超純水。AMK粉針劑、針劑及洗劑均購自當(dāng) 地藥店。
[0037] 2、儀器
[0038] 安捷倫1100系統(tǒng)（美國）（G1322A在線脫氣，G1311A四元栗，G1316A柱溫箱，G1313A 自動(dòng)進(jìn)樣器，G1321A熒光檢測(cè)器和G2070-60069色譜工作站）1100高壓力恒定流栗(伍豐科 學(xué)儀器有限公司，上海，中國hEclipse熒光分光儀（瓦里安，美國）用于測(cè)量RRS強(qiáng)度。U-3019/3310紫外可見分光光度計(jì)（日立，日本）用于記錄吸收光譜。PHS-3C型酸度計(jì)(上海大 普分析儀器廠）<=Sartorius BS210S電子天平（Sartorius公司，德國）JK-l快速混勾器(江 蘇國華儀器廠）。
[0039] 3、溶液的配制
[0040] 3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置
[00411 精密稱取AMK標(biāo)準(zhǔn)品10.Omg，經(jīng)雙蒸水溶解后定溶于10ml容量瓶中，得到濃度為 1 .Omg · mL-1的儲(chǔ)備液，并存儲(chǔ)于4-8°C的冰箱中。精密量取不同體積的AMK儲(chǔ)備液于5ml容量 瓶中，用pH值為3.0的BR緩沖溶液稀釋得到不同濃度的AMK工作液。RRS實(shí)驗(yàn)中所用AMK標(biāo)準(zhǔn) 溶液為儲(chǔ)備液由雙蒸水稀釋所得。
[0042] 3.2探針溶液的配制
[0043]精密稱取PSB固體粉末，用pH值為3.0的BR緩沖溶液溶解并定溶于50ml容量瓶中， 得到濃度為2.5X ΙΟΛιοΙ · Γ1的PSB探針溶液。RRS實(shí)驗(yàn)中所用PSB溶液為雙蒸水稀釋所得。 [0044] 3.3樣品的配制
[0045]取ΑΜΚ粉針劑、針劑及洗劑適量，用pH值為3.0的BR緩沖溶液稀釋至適量濃度，所用 樣品均置于4 °C冰箱中保存，進(jìn)樣前均經(jīng)0.45μπι濾膜過濾。
[0046] 4、RRS 實(shí)驗(yàn)
[0047] 4.1RRS 光譜
[0048] 于10mL比色管中，依次加入l.OmL pH 3.0的BR緩沖溶液、一定量的阿米卡星標(biāo)準(zhǔn) 溶液和l.OmL 2.5X10-4mol · L-1的PSB溶液，用水稀釋至刻度，搖勾，于熒光分光光度計(jì)上 以λΜ = λ_方式進(jìn)行同步掃描，記錄共振瑞利散射光譜，并分別于最大RRS波長(zhǎng)處測(cè)量離子 締合物的RRS強(qiáng)度IRRS及試劑空白的RRS強(qiáng)度1〇, Δ IRRS=IRRS_Io。
[0049]圖1為本發(fā)明實(shí)施例中PSB-AMK的RRS光譜圖，圖中1為PSB溶液;2為AMK溶液;3-10 為AMK濃度分別為0 · 5、0 · 8、0 · 9、1 · 0、1 · 2、1 · 4、1 · 6、1 · 7yg · mL-1 的PSB-AMK混合溶液。
[0050]從圖1中可以看出：①在一定酸度下，PSB及AMK自身的RRS均十分微弱，但當(dāng)PSB與 AMK反應(yīng)形成離子結(jié)合產(chǎn)物時(shí)，RRS強(qiáng)度顯著增強(qiáng);②最大散射波長(zhǎng)位于362nm處，另外兩個(gè) 散射峰分別位于275nm與677nm;③在最大散射波長(zhǎng)處，RRS強(qiáng)度與AMK濃度呈良好線性關(guān)系。 因此，RRS法可用于AMK的定量測(cè)定。
[0051 ] 4.2酸度對(duì)RRS反應(yīng)的影響
[0052] 通過調(diào)節(jié)BR緩沖溶液的pH值來考察酸度對(duì)RRS的反應(yīng)，如表1和圖2所示。結(jié)果表 明，反應(yīng)的最佳酸度范圍為pH 2.0~3.3,超出此范圍，PSB-AMK體系的RRS強(qiáng)度均會(huì)明顯降 低。這與AMK及PSB的結(jié)構(gòu)有關(guān)，在較低的pH值下，PSB結(jié)構(gòu)中的兩個(gè)氨基基團(tuán)（-NH 2)將會(huì)吸 引溶液中的氫質(zhì)子(H+)，而使PSB帶兩個(gè)單位的正電荷，PSB自身形成二聚物的趨勢(shì)增加，與 PSB-AMK分子間的締合作用相競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致離子締合物的RRS強(qiáng)度減??；另一方面，在較高pH值 條件下，不利于形成AMK陽離子，亦使RRS反應(yīng)強(qiáng)度減低
[0053]表1BR緩沖溶液的pH關(guān)系
[0055] 4.3反應(yīng)時(shí)間及穩(wěn)定性對(duì)RRS反應(yīng)的影響
[0056] 實(shí)驗(yàn)考察了反應(yīng)時(shí)間及穩(wěn)定性對(duì)RRS反應(yīng)的影響，結(jié)果表明，在室溫下，PSB與AMK 可迅速反應(yīng)，反應(yīng)強(qiáng)度可穩(wěn)定至少2h。在HPLC-RRS實(shí)驗(yàn)中，無論流速與管長(zhǎng)如何變化，目標(biāo) 成分與探針反應(yīng)時(shí)間都是十分短暫的，這必然要求離子締合反應(yīng)能迅速發(fā)生，若為延長(zhǎng)反 應(yīng)時(shí)間一味的增加管長(zhǎng)或減低流速，則必然導(dǎo)致色譜峰嚴(yán)重展寬，因此RRS反應(yīng)迅速且穩(wěn)定 性好是HPLC-RRS實(shí)驗(yàn)的先決條件。
[0057] 4.4PSB-AMK體系的紫外可見光吸收?qǐng)D譜
[0058]圖3所示為PSB-AMK體系的紫外-可見光(UV/VIS)吸收?qǐng)D譜，圖中1為AMK溶液;2為 PSB-AMK混合溶液;3為PSB溶液。圖4所示為PSB-AMK離子締合物UV/VIS吸收光譜與RRS光譜 的對(duì)比圖。
[0059]如圖3和4所示:①AMK只在200nm附近有微弱的吸收，PSB的兩個(gè)主要的吸收峰分別 位于317nm和617nm;②當(dāng)AMK與PSB形成離子締合物后，兩個(gè)吸收峰分別從317nm移動(dòng)到 347nm及617nm移動(dòng)到635nm，這與離子締合反應(yīng)中存在電荷轉(zhuǎn)移現(xiàn)象有關(guān);③RRS散射峰位 于分子吸收帶內(nèi)，其中362nm及677nm的散射峰與347nm及635nm的吸收峰相對(duì)應(yīng)，這是RRS散 射強(qiáng)度增強(qiáng)的主要原因。
[0060] 4.5離子締合物的形成
[0061] 實(shí)驗(yàn)中用摩爾比法和等摩爾連續(xù)變化法測(cè)定了 AMK與PSB結(jié)合成離子締合物的組 成比約為2:1。在一定的酸性介質(zhì)中，AMK陽離子(A2+)與PSB陰離子(P 4-)由于靜電引力及疏 水性作用結(jié)合成離子締合物，反應(yīng)如圖5所示，結(jié)合成離子締合物后分子體積及分子量均明 顯增大，散射強(qiáng)度隨分子量的增大而增加，綜合以上原因，使得PSB-AMK離子締合物的RRS強(qiáng) 度顯著增加。
[0062] 4.6結(jié)論
[0063] 當(dāng)反應(yīng)條件確定之后，RRS反應(yīng)強(qiáng)度主要有以下兩方面因素決定:一是形成的離子 締合物的體積(體積越大，散射強(qiáng)度越強(qiáng)）；二是散射分子的摩爾吸光系數(shù)ε ( ε值越大，分子 的吸光度越強(qiáng)，對(duì)散射強(qiáng)度的貢獻(xiàn)越大）。當(dāng)ΑΜΚ2+與染料陰離子PSB4-相反應(yīng)形成離子締合 物后，分子的體積及ε值均較ΑΜΚ自身大幅度的增加。此外，由于范德華力及疏水作用力均導(dǎo) 致大的散射分子形成，這都大大的有利于散射強(qiáng)度的增加。
[0064] 5、HPLC-RRS 實(shí)驗(yàn)
[0065] 實(shí)驗(yàn)中所用色譜柱為Agilent Zorbox SB-C18column(250mmX4.6mm i .cl·，5μηι) 及保護(hù)柱（Security Guard C18，4 X 2mm，Phenomenex)。流動(dòng)相為乙臆：水（7:93，v/v)，HPLC 流速為〇.50mL · min-柱溫為30°C，進(jìn)樣量 10μ1。探針為2.5X 10-4mol · L 一1的？38溶液，？!13.0，單栗的流速為0.051111^1^11-1，反應(yīng)管長(zhǎng)150〇11，內(nèi)徑0.5111111。實(shí)驗(yàn)所用的 溶液均經(jīng)過〇. 45μηι濾膜過濾。
[0066] 5.1色譜條件的優(yōu)化
[0067] 5.1.1測(cè)定波長(zhǎng)的選擇
[0068] 根據(jù)4.4項(xiàng)，兩個(gè)主要的散射峰分別為36211111和67711111，實(shí)驗(yàn)中分別嘗試人(^ = \(^ = 362nm及677nm的情況。發(fā)現(xiàn)當(dāng)Aex=Aem=362nm時(shí)，散射峰明顯，峰形較好;相反，當(dāng)A ex = Aem= 677nm時(shí)，液相圖譜中完全沒有散射峰出現(xiàn)，這與熒光檢測(cè)器的光源的能量有關(guān)。因此，實(shí)驗(yàn) 中選擇362nm為測(cè)定波長(zhǎng)。
[0069] 5.1.2有機(jī)溶劑對(duì)RRS反應(yīng)的影響及流動(dòng)相的選擇
[0070] HPLC-RRS聯(lián)用中流動(dòng)相選擇的一個(gè)重要特點(diǎn)就是其中不能含有過高濃度的有機(jī) 溶劑，這是因?yàn)樵赗RS反應(yīng)中，由于離子締合物具有較強(qiáng)的疏水性，從而與水形成界面，使得 RRS強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，若溶液中含有高濃度的有機(jī)溶劑將使這一界面消失，導(dǎo)致RRS強(qiáng)度顯著 降低。一般液相系統(tǒng)常用的有機(jī)溶劑為甲醇與乙腈，不同濃度的散射體系對(duì)兩者的耐受度 不同，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況具體選擇。
[0071 ] HPLC-RRS成功測(cè)定的前提是使目標(biāo)成分在與探針反應(yīng)之前充分離子化，離子化有 兩種方式:一是選擇酸性的流動(dòng)相，使目標(biāo)成分在流動(dòng)相中離子化;二是在制備樣品的過程 中使目標(biāo)成分離子化，也就是使樣品在進(jìn)樣前離子化。
[0072]實(shí)驗(yàn)中首先選擇了第一種方式使AMK分子離子化，通過在流動(dòng)相中加入TFA來調(diào)節(jié) pH值，使之與反應(yīng)RRS反應(yīng)的pH值相當(dāng)。但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流動(dòng)相中含有一定比例的TFA時(shí)，即 使流動(dòng)相中還有50%的甲醇或乙腈都無法將AMK完全洗脫出來。這種現(xiàn)象可以用類似離子 對(duì)色譜的機(jī)理來解釋，AMK經(jīng)酸化后形成陽離子并與解離后TFA陰離子形成中性產(chǎn)物，其能 更好的吸附于非極性的固定相中，在甲醇或乙腈的比例不能太大的前提下，AMK很難被完全 洗脫下來。因此在PSB-AMK體系中，第二種離子化方式是可行的。在處理樣品中，AMK需用pH 值為3.0的BR緩沖溶液稀釋得到不同濃度工作液，也就是說AMK在這一步即進(jìn)樣前已被完全 咼子化。
[0073] 實(shí)驗(yàn)中，嘗試了不同比例的甲醇-水（10:90~50:50，v/v)及乙腈-水等作為流動(dòng)相 的情況。當(dāng)流動(dòng)相中含有甲醇時(shí)，AMK保留時(shí)間較長(zhǎng)、對(duì)稱度不高、峰形較差，若再增大甲醇 的比例，由于有機(jī)溶劑對(duì)締合反應(yīng)的影響，AMK目標(biāo)峰面積顯著減小。相反，當(dāng)乙腈比例為 10%左右時(shí)，AMK在lOmin中內(nèi)被完全洗脫，色譜圖見圖6。因此，實(shí)驗(yàn)最后采用乙腈-水(7: 9 3，v / v)為流動(dòng)相，AMK保留時(shí)間為5.8 m i η，峰形良好。此體系流動(dòng)相組成簡(jiǎn)單，同時(shí)采用等 度洗脫，給HPLC的分析帶來了便利。
[0074] 5 · 1 · 3HPLC流速對(duì)RRS反應(yīng)的影響
[0075] HPLC-RRS聯(lián)用中HPLC流速的選擇與一般液相方法不同。實(shí)驗(yàn)中考察了不同HPLC流 速(0.20ml · mirT1~0.80ml · mirT1)對(duì)RRS反應(yīng)的影響。實(shí)驗(yàn)表明，ΑΜΚ峰面積隨流速的增大 而減小。原因是隨著HPLC流速的增大，形成離子締合物的反應(yīng)時(shí)間相應(yīng)縮短，RRS強(qiáng)度減弱。 另一方面，若HPLC流速過低，則洗脫時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)稱因子下降。在綜合評(píng)價(jià)了對(duì)稱因子、保留 時(shí)間及RRS反應(yīng)的基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)最終選定了0.50ml · min-1為HPLC流速。
[0076] 5.2柱后條件的優(yōu)化
[0077] 柱后條件的優(yōu)化采用流動(dòng)注射分析的方法進(jìn)行考察，也就是用不銹鋼兩通代替色 譜柱，去除色譜柱的影響僅分析柱后反應(yīng)的情況，包括探針濃度、pH值、探針流速及反應(yīng)管 長(zhǎng)度的考察。
[0078] 5 · 2 · 1探針濃度對(duì)RSS反應(yīng)的影響
[0079] 實(shí)驗(yàn)中考察了濃度范圍為1.0X10-4m〇l · L-1~3.5X10-4mol · L-1的PSB探針濃度 對(duì)RRS反應(yīng)的影響，實(shí)驗(yàn)中具體采用的PSB探針濃度及相應(yīng)的色譜峰峰面積見表2。
[0080] 表2探針濃度對(duì)RSS反應(yīng)的影響
[0082] 如圖7所示，起初依照反應(yīng)比，PSB濃度沒有達(dá)到飽和，RRS反應(yīng)強(qiáng)度隨鉬酸銨濃度 的增大而增大，當(dāng)濃度達(dá)到一定值后，PSB趨于飽和，當(dāng)濃度再度增大時(shí)，PSB自身形成二聚 物的趨勢(shì)加大，與PSB-ΑΜΚ分子間的締合作用相競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致離子締合物的RRS強(qiáng)度隨PSB濃度 的增大而減小。因此，實(shí)驗(yàn)中選擇2.5Xl(T 4mol · Γ1的PSB為探針。
[0083] 5.2.2?田直對(duì)1??反應(yīng)的影響
[0084] 靜態(tài)條件下pH對(duì)RRS反應(yīng)的影響已在HPLC-RRS反應(yīng)前考察，結(jié)果表明BR緩沖溶液 最佳酸度范圍是pH 2.0~3.3。但在HPLC-RRS的反應(yīng)盤管中，pH值由探針溶液及HPLC流動(dòng)相 共同決定，此外不同體系對(duì)pH值變化的敏感度不同，在動(dòng)態(tài)條件下需根據(jù)不同的情況，在選 定的pH值的基礎(chǔ)上調(diào)節(jié)。
[0085] 5.2.3探針流速對(duì)RRS反應(yīng)的影響
[0086] 實(shí)驗(yàn)按照表3所示的流速，考察了探針流速(0.02~0.20mL · mirT1)對(duì)RRS反應(yīng)的影 響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。
[0087] 表3探針流速對(duì)RRS反應(yīng)的影響
[0089] 如圖8所示，當(dāng)單栗流速低于0.02mL · mirT1時(shí)，由于探針流速過慢導(dǎo)致混合后溶液 中探針含量降低，RRS反應(yīng)不完全，AMK峰面積下降、靈敏度減低；當(dāng)流速大于0.10mL · mirT1 時(shí)，由于流速過快，導(dǎo)致反應(yīng)時(shí)間減少，RRS強(qiáng)度下降。實(shí)驗(yàn)中，選擇探針的流速為0.05mL· min-1。
[0090] 5.2.4反應(yīng)管長(zhǎng)度對(duì)RRS反應(yīng)的影響
[0091] 實(shí)驗(yàn)中考察了不同反應(yīng)管長(zhǎng)度（100~300cm)對(duì)RRS反應(yīng)的影響。RRS反應(yīng)強(qiáng)度隨反 應(yīng)管的增加而增強(qiáng)，但當(dāng)反應(yīng)管長(zhǎng)度超過200cm后，色譜峰展寬嚴(yán)重，對(duì)稱度下降;若反應(yīng)管 過短，由于反應(yīng)時(shí)間也相應(yīng)減少，目標(biāo)峰面積明顯減小。綜合以上各因素考慮，實(shí)驗(yàn)選擇反 應(yīng)管長(zhǎng)度為150cm〇
[0092] 6.方法可行性考察
[0093] 6.1標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍
[0094] 精密配置不同濃度的AMK標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，回歸 方程及相關(guān)系數(shù)為y = 252.98x-78.408，R2 = 0.9993，其中y為色譜峰面積，X為AMK濃度(μ g · mL-4。線性范圍為l.Oyg · mL-1 ~15.Oyg · mL-1，最低檢測(cè)限為0.5yg · 。
[0095] 6.2精密度實(shí)驗(yàn)
[0096] 分別制備濃度為2.0、5.0、10.(^8*1111/1的411(標(biāo)樣各5份，均按上述樣品處理方法 處理后，于同日內(nèi)進(jìn)樣5次測(cè)定；另取上述樣品，每天測(cè)定一次，連續(xù)測(cè)定5天，測(cè)定樣品峰面 積，按回歸方程求出對(duì)應(yīng)濃度，計(jì)算其日內(nèi)和日間的精密度，結(jié)果見表4。
[0097] 表4日內(nèi)及日間精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n = 5)
[0099] 7、應(yīng)用
[0100] 上述HPLC-RRS方法已成功用于不同制劑中AMK的含量測(cè)定中。將AMK粉針劑、針劑 及洗劑，上述操作，分別制備成濃度為2. Oyg · ml/1的樣品，經(jīng)經(jīng)過0.45μπι濾膜過濾后，取10μ 1進(jìn)樣?；厥章室姳?。
[0101] 表5不同制劑中ΑΜΚ含量的測(cè)定
[0103] HPLC-RRS聯(lián)用技術(shù)中，HPLC系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了樣品的自動(dòng)分離分析，同時(shí)RRS檢測(cè)技術(shù)實(shí) 現(xiàn)了對(duì)無紫外吸收物質(zhì)的檢測(cè)，這是HPLC-RRS聯(lián)用技術(shù)無可比擬的優(yōu)點(diǎn)。
[0104]本文建立了HPLC-RRS聯(lián)用測(cè)定ΑΜΚ的新方法，該方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、選擇性 好并成功用于不同制劑中AMK含量的測(cè)定中，為下一步藥代動(dòng)力學(xué)的研究奠定了良好的基 礎(chǔ)，同時(shí)，進(jìn)一步拓寬了RRS技術(shù)的應(yīng)用范圍，并為HPLC提供了一種全新的檢測(cè)模式。
[0105] 如在說明書及權(quán)利要求當(dāng)中使用了某些詞匯來指稱特定成分或方法。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)可理解，不同地區(qū)可能會(huì)用不同名詞來稱呼同一個(gè)成分。本說明書及權(quán)利要求并不 以名稱的差異來作為區(qū)分成分的方式。如在通篇說明書及權(quán)利要求當(dāng)中所提及的"包含"為 一開放式用語，故應(yīng)解釋成"包含但不限定于"。"大致"是指在可接收的誤差范圍內(nèi)，本領(lǐng)域 技術(shù)人員能夠在一定誤差范圍內(nèi)解決所述技術(shù)問題，基本達(dá)到所述技術(shù)效果。說明書后續(xù) 描述為實(shí)施本發(fā)明的較佳實(shí)施方式，然所述描述乃以說明本發(fā)明的一般原則為目的，并非 用以限定本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視所附權(quán)利要求所界定者為準(zhǔn)。
[0106] 還需要說明的是，術(shù)語"包括"、"包含"或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的 包含，從而使得包括一系列要素的商品或者系統(tǒng)不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確 列出的其他要素，或者是還包括為這種商品或者系統(tǒng)所固有的要素。在沒有更多限制的情 況下，由語句"包括一個(gè)……"限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系統(tǒng)中還 存在另外的相同要素。
[0107] 上述說明示出并描述了本發(fā)明的若干優(yōu)選實(shí)施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明 并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對(duì)其他實(shí)施例的排除，而可用于各種其他組合、 修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識(shí) 進(jìn)行改動(dòng)。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動(dòng)和變化不脫離本發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在本發(fā) 明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 阿米卡星含量測(cè)定方法，其特征在于，采用高效液相色譜與共振瑞利散射聯(lián)用技術(shù)， 先用高效液相色譜法將供試品中的阿米卡星洗脫分離，再將洗脫分離后的阿米卡星和探針 溶液混合反應(yīng)，最后將混合反應(yīng)后的反應(yīng)液注入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)； 所述高效液相色譜的色譜條件為：以乙腈:水=7:93為流動(dòng)相;流速=0.5〇1111^1]1；[]^1; 所述探針溶液為磷酸鹽緩沖液;所述檢測(cè)器為熒光檢測(cè)器。2. 如權(quán)利要求1所述的阿米卡星含量測(cè)定方法，其特征在于，所述檢測(cè)波長(zhǎng)λΜ = λ_ = 362nm〇3. 如權(quán)利要求2所述的阿米卡星含量測(cè)定方法，其特征在于，所述磷酸鹽緩沖液溶液濃 度為〗』※^-4!^^·!/ 1。4. 如權(quán)利要求3所述的阿米卡星含量測(cè)定方法，其特征在于，所述磷酸鹽緩沖液溶液pH =3.0〇5. 如權(quán)利要求4所述的阿米卡星含量測(cè)定方法，其特征在于，所述磷酸鹽緩沖液的流速 為0.05mL · min-、6. 如權(quán)利要求5所述的阿米卡星含量測(cè)定方法，其特征在于，所述探針溶液與洗脫分離 后的阿米卡星反應(yīng)的反應(yīng)管長(zhǎng)150cm，內(nèi)徑0.5_。7. 如權(quán)利要求6所述的阿米卡星含量測(cè)定方法，其特征在于，所述阿米卡星的最低檢測(cè) 限為0.5yg · mL-工。8. 如權(quán)利要求7所述的阿米卡星含量測(cè)定方法，其特征在于，所述阿米卡星的線性范圍 為1 · Oyg · mL-1 ~15 · Oyg · mL_1〇9. 如權(quán)利要求8所述的阿米卡星含量測(cè)定方法，其特征在于，所述色譜條件的色譜柱為 Cl 8，5ym，250mm X 4 · 6mm。
【文檔編號(hào)】G01N30/06GK106018591SQ201610322483
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年5月16日
【發(fā)明人】陸巍, 尚京川, 曲斐, 韓文莉
【申請(qǐng)人】重慶醫(yī)科大學(xué)