本發(fā)明涉及一種表達(dá)l.mesenteroides來源的蔗糖磷酸化酶重組枯草芽孢桿菌，屬于基因工程和酶工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

蔗糖磷酸化酶(ec2.4.1.7，sucrosephosphorylase,spase)，是gh13家族中的一員，是催化轉(zhuǎn)移葡萄糖苷鍵的特異性酶。主要催化2種類型的反應(yīng)：一是將1-磷酸葡萄糖中的葡萄糖基轉(zhuǎn)移至受體；二是將蔗糖中的葡萄糖基轉(zhuǎn)移至受體，受體包括無機磷酸、水、含酚羥基、醇羥基及羧基的物質(zhì)。當(dāng)以酚羥基作為受體時轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為α-熊果苷。α-熊果苷作為一種國際上正在極力推廣的高功效醫(yī)藥、化妝品添加劑，在國內(nèi)外有巨大的需求，在化妝品美白祛斑領(lǐng)域占據(jù)重要的地位。據(jù)調(diào)研α-熊果苷的市場價值約每公斤3800元，而其原料對苯二酚的市場價值約66元每公斤，所以α-熊果苷是一種高附加值的產(chǎn)物，如果能夠?qū)崿F(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)將會帶來非常大的經(jīng)濟收益。蔗糖磷酸化酶還可催化合成某些不穩(wěn)定物質(zhì)的衍生物，提高其穩(wěn)定性。因此，蔗糖磷酸化酶在食品、化妝品及醫(yī)藥方面有廣泛的應(yīng)用價值。

蔗糖磷酸化酶屬胞內(nèi)酶，酶的基因主要來源于腸膜明串珠菌(leuconostocmesenteroides)、變異鏈球菌(streptococcusmutans)、嗜糖假單胞菌(pseudomonassaccharophila)、長雙歧桿菌(bidifobacteriumlongum)、巨大芽孢桿菌(bacillusmegaterium)、青春雙歧桿菌(bifidobacteriumadolescentis)。目前l(fā).mesenteroides來源的蔗糖磷酸化酶只在大腸桿菌中獲得異源表達(dá)，但是大腸桿菌容易產(chǎn)生內(nèi)毒素，不適合應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述問題，本發(fā)明首次以適于食品使用的枯草芽孢桿菌為宿主菌構(gòu)建了重組表達(dá)l.mesenteroides來源的蔗糖磷酸化酶菌株，電泳結(jié)果顯示蔗糖磷酸化酶獲得了高水平表達(dá)，為α-熊果苷的工業(yè)化制備奠定了基礎(chǔ)。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種重組表達(dá)l.mesenteroides來源蔗糖磷酸化酶的重組枯草芽孢桿菌。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列如seqidno.1所示。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述重組枯草芽孢桿菌以保藏編號為cctccm2016536的枯草芽孢桿菌為宿主。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述重組枯草芽孢桿菌以枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)168為宿主。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述表達(dá)載體為pbsmul3。

本發(fā)明的第二個目的是提供所述重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法是將編碼氨基酸序列如seqidno.1所示的蔗糖磷酸化酶的基因與表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌中。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述編碼氨基酸序列如seqidno.1所示的蔗糖磷酸化酶的基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述枯草芽孢桿菌包括保藏編號為cctccm2016536的枯草芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌168。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述表達(dá)載體為pbsmul3。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法具體如下：

1)擴增編碼氨基酸序列如seqidno.1所示的蔗糖磷酸化酶的基因；

2)將克隆出的目的基因連接到pmd-18t，構(gòu)建成為重組載體pmd-18t-sp，轉(zhuǎn)化至e.colijm109進(jìn)一步克隆，酶切后將目的基因連接到表達(dá)載體pbsmul3，命名為pbsmul3-sp。

3)將重組質(zhì)粒pbsmul3-sp通過電轉(zhuǎn)化進(jìn)入枯草芽孢桿菌表達(dá)宿主，獲得重組表達(dá)蔗糖磷酸化酶的枯草芽孢桿菌基因工程菌。

本發(fā)明的第三個目的是提供所述枯草芽孢桿菌在生產(chǎn)蔗糖磷酸化酶中的應(yīng)用，所述應(yīng)用是將所述枯草芽孢桿菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30～35℃，200～250rpm培養(yǎng)24～72h。

本發(fā)明的第四個目的是提供所述枯草芽孢桿菌在生產(chǎn)α-熊果苷中的應(yīng)用。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述應(yīng)用是將所述的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)24～48h后的發(fā)酵液離心得到粗酶液；以摩爾比為1:1～8的對苯二酚和蔗糖為底物，按5000～10000u/g底物的添加量加入酶液，于30～35℃，ph6.8～7.2反應(yīng)12～48h。

本發(fā)明的第五個目的是提供一種蔗糖磷酸化酶，其氨基酸序列如seqidno.1所示。

本發(fā)明還提供所述基因工程菌在食品、醫(yī)藥、化工領(lǐng)域的應(yīng)用。

有益效果：本發(fā)明以食品準(zhǔn)入的枯草芽孢桿菌為宿主構(gòu)建了表達(dá)l.mesenteroides來源的蔗糖磷酸化酶的重組枯草芽孢桿菌，酶活達(dá)162.19u/ml，應(yīng)用該重組酶生產(chǎn)α-熊果苷，其在30℃下反應(yīng)24小時，然后在40℃下用糖化酶處理3小時時底物轉(zhuǎn)化率達(dá)83.6％，為α-熊果苷的工業(yè)化制備奠定了基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1重組質(zhì)粒pbsmul3-sp的構(gòu)建過程圖；

圖2pmd18t-sp雙酶切驗證圖；從左至右，泳道1為5000marker，2-3為蔗糖磷酸化酶連接表達(dá)載體酶切驗證；

圖3pbsmul3-sp重組質(zhì)粒的雙酶切驗證圖；從左至右，泳道1為10000bpmarker，泳道2～3為蔗糖磷酸化酶連接表達(dá)載體酶切驗證；

圖4pbsmul3-sp重組菌搖瓶發(fā)酵sds-page電泳圖，泳道1～3為13h胞外上清、13h破壁上清、13h破壁沉淀；泳道4為中分子量蛋白marker，泳道5～7為24h胞外上清、24h破壁上清、24h破壁沉淀；泳道8～10為43h胞外上清、43h破壁上清、43h破壁沉淀；

圖5最高轉(zhuǎn)化率的酶轉(zhuǎn)化hplc色譜圖。

具體實施方式

枯草芽孢桿菌bacillussubtilis(保藏編號為cctccm2016536)已在申請?zhí)枮?01611025858.9的專利申請中公開。

酶活的測定方法：將1ml5％的蔗糖溶液和0.9ml的50mmol/l，ph6.7的磷酸緩沖液充分混勻，在30℃預(yù)熱10min，加入100ul的酶液，反應(yīng)10min后加入3mldns，煮沸7min迅速冷卻，加蒸餾水定容至15ml，540nm下測吸光度(以滅活的酶液為催化劑同樣操作作為空白對照)。

酶活定義：將每分鐘水解蔗糖生成1μmol的果糖所需酶量定義為蔗糖磷酸化酶的一個單位的酶活力(u)。

產(chǎn)物的hplc檢測：最終反應(yīng)體系中的α-熊果苷的量采用hplc來確定。色譜條件為：采用hplc(高效液相色譜法)進(jìn)行產(chǎn)物分析具體色譜條件是:agilent1200hplc色譜儀器，agilent自動進(jìn)樣器，agilentsb-aq5μm(4.6mm×250mm)，agilentlc-9a紫外檢測器系統(tǒng)；流動相按照80％(體積分?jǐn)?shù))的10mm的稀磷酸-20％甲醇溶液的配方配置，流動相的流速為0.6ml·min^-1；紫外檢測波長為281nm，用c-18柱和糖柱分別測定樣品中α-熊果苷和單糖和多糖的含量，柱溫35℃。

α-熊果苷的轉(zhuǎn)苷效率d的計算公式為：

d(％)＝m1/m2*100％

其中：

d：對苯二酚轉(zhuǎn)化為α-熊果苷的摩爾轉(zhuǎn)化率(％)；

m1：酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)中生成的α-熊果苷的摩爾數(shù)(mol)；

m2：投入到反應(yīng)液中的對苯二酚的摩爾數(shù)(mol)。

實施例1：腸膜明串珠菌蔗糖磷酸化酶編碼基因的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建

按圖1的流程進(jìn)行表達(dá)載體的構(gòu)建，根據(jù)合成的蔗糖磷酸化酶基因設(shè)計引物f、r：

f：5’-gcgaagcttaaggaggatattatggaaattcagaacaaggc-3’

r：5’-gcgggatccttaattctgggtcagattatcgc-3’

所述限制性酶切位點加下劃線的字母表示。pcr體系為：20μm引物f和r各0.5μl，dntpmix4μl，5×psbuffer10μl，2.5u/μl的primestar聚合酶0.5ul，模板0.5μl，加雙蒸水補齊50μl。pcr條件：94℃預(yù)變性4min；98℃變性10s，55℃退火10s，72℃延伸1min50s，30個循環(huán)。將pcr產(chǎn)物進(jìn)行膠回收、加a純化后與克隆載體pmd-18t連接，酶切回收目的基因?qū)⑵渑c表達(dá)載體pbsmul3進(jìn)行雙酶切，并于16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化e.colijm109，涂布含有氨芐(100μg/ml)抗性的lb平板，37℃培養(yǎng)10-12h，挑取轉(zhuǎn)化子，提取重組質(zhì)粒并雙酶切驗證。如圖3所示，酶切后有兩條片段，大小分別為7000bp左右(表達(dá)載體pbsmul3)和1473bp(蔗糖磷酸化酶)即連接成功。然后對驗證正確的重組質(zhì)粒測定dna序列，陽性克隆子即pbsmul3-sp。

實施例2：重組質(zhì)粒pbsmul3-sp的轉(zhuǎn)化

1)新鮮lb平板(lb固體培養(yǎng)基：蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl10g/l，0.2g/l瓊脂粉)挑枯草芽孢桿菌bacillussubtilis(保藏編號為cctccm2016536)單菌落接種于5mllb液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)10h。

2)取2.5ml轉(zhuǎn)接入40ml加0.5m的山梨醇lb培養(yǎng)基，37℃，200rpm震蕩培養(yǎng)四個小時。

3)取全部菌液冰水浴10min，然后5000rpm，4℃，離心5min收集菌體。

4)用40ml預(yù)冷的電轉(zhuǎn)緩沖液(山梨醇0.5m，甘露醇0.5m，葡萄糖10％)洗滌菌體，5000rpm，4℃，離心5min去上清，如此漂洗4次。

5)將洗滌后的菌體重懸于1ml電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基中，分裝到1.5mlep管中，每管裝300μl感受態(tài)細(xì)胞。

6)將300μl感受態(tài)細(xì)胞中加入10μl重組質(zhì)粒，冰浴孵育15min，加入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯(2mm)中，電擊一次。電轉(zhuǎn)儀設(shè)置：2.4kv，25uf，200ω，電擊1次。

7)電擊完畢立即加入1ml復(fù)蘇培養(yǎng)基rm(山梨醇0.5m，甘露醇0.38m，蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl10g/l)吹吸，37℃，200rpm，復(fù)蘇3h后，涂板。37℃，過夜培養(yǎng)，挑取菌落至lb卡那霉素培養(yǎng)基中，進(jìn)行驗證，酶切后表達(dá)載體和目的基因條帶大小一一對應(yīng)即驗證正確，然后進(jìn)行搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶。

實施例3:搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶

將實施例2中得到的重組枯草芽孢桿菌菌株接種于lb培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)8h后以5％接種量轉(zhuǎn)接至tb發(fā)酵培養(yǎng)基中，先放至37℃、200rpm恒溫培養(yǎng)2h，再移至33℃恒溫培養(yǎng)48h產(chǎn)酶。發(fā)酵結(jié)束后，離心收集上清液即為粗酶液。

lb培養(yǎng)基(g/l)：蛋白胨10，酵母膏5，nacl10。

tb培養(yǎng)基(g/l)：蛋白胨10，酵母粉24，甘油5，k2hpo4·3h2o16.43，kh2po42.31。

對粗酶液中的酶活進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，酶活力為136u/ml。蛋白電泳結(jié)果顯示在53kda處有一條與理論分子量一致的條帶(圖4)。

實施例4：酶轉(zhuǎn)化法制備α-熊果苷

在50ml的密閉的容器中進(jìn)行10ml的酶轉(zhuǎn)化體系。以對苯二酚為受體分子，蔗糖作為供體進(jìn)行spase轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)。反應(yīng)體系包括：在20mm磷酸鈉緩沖液(ph7.0)中加入供受體的摩爾比例為4:1的蔗糖和hq以及7500u/g對苯二酚的spase，將其在30℃下反應(yīng)24h。沸水浴中加熱5min終止反應(yīng)。然后在40℃下用糖化酶處理3h并進(jìn)一步加熱滅活，離心并通過hplc分析產(chǎn)物。當(dāng)反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化率可達(dá)83.64％，色譜峰見圖5。

實施例5

采用實施例1～3相同策略構(gòu)建重組枯草芽孢桿菌，區(qū)別在于，將宿主替換為枯草芽孢桿菌168，經(jīng)檢測，酶活達(dá)113u/ml。

雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。

序列表

<110>江南大學(xué)

<120>一種表達(dá)l.mesenteroides來源的蔗糖磷酸化酶重組枯草芽孢桿菌

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>490

<212>prt

<213>腸膜明串珠菌leuconostocmesenteroides

<400>1

metgluileglnasnlysalametleuilethrtyralaaspserleu

151015

glylysasnleulysaspvalhisglnvalleulysgluaspilegly

202530

aspalaileglyglyvalhisleuleuprophepheproserthrgly

354045

aspargglyphealaproalaasptyrthrargvalaspalaalaphe

505560

glyasptrpalaaspvalglualaleuglygluglutyrtyrleumet

65707580

pheaspphemetileasnhisileserarggluservalmettyrgln

859095

aspphelyslysasnhisaspaspserlystyrlysaspphepheile

100105110

argtrpglulysphetrpalalysalaglygluasnargprothrgln

115120125

alaaspvalaspleuiletyrlysarglysasplysalaprothrgln

130135140

gluilethrpheaspaspglythrthrgluasnleutrpasnthrphe

145150155160

glyglugluglnileaspileaspvalasnseralailealalysglu

165170175

pheilelysthrthrleugluaspmetvallyshisglyalaasnleu

180185190

ileargleuaspalaphealatyralavallyslysvalaspthrasn

195200205

aspphephevalgluprogluiletrpaspthrleuasngluvalarg

210215220

gluileleuthrproleulysalagluileleuprogluilehisglu

225230235240

histyrserileprolyslysileasnasphisglytyrphethrtyr

245250255

aspphealaleuprometthrthrleutyrthrleutyrserglylys

260265270

thrasnglnleualalystrpleulysmetserprometlysglnphe

275280285

thrthrleuaspthrhisaspglyileglyvalvalaspalaargasp

290295300

ileleuthraspaspgluileasptyralasergluglnleutyrlys

305310315320

valglyalaasnvallyslysthrtyrserseralasertyrasnasn

325330335

leuaspiletyrglnileasnserthrtyrtyrseralaleuglyasn

340345350

aspaspalaalatyrleuleuserargvalpheglnvalphealapro

355360365

glyileproglniletyrtyrvalglyleuleualaglygluasnasp

370375380

ilealaleuleugluserthrlysgluglyargasnileasnarghis

385390395400

tyrtyrthrargglugluvallyssergluvallysargprovalval

405410415

alaasnleuleulysleuleusertrpargasngluserproalaphe

420425430

aspleualaglyserilethrvalaspthrprothraspthrthrile

435440445

valvalthrargglnaspgluasnglyglnasnlysalavalleuthr

450455460

alaaspalaalaasnlysthrphegluilevalgluasnglyglnthr

465470475480

valmetserseraspasnleuthrglnasn

485490

<210>2

<211>1473

<212>dna

<213>腸膜明串珠菌leuconostocmesenteroides

<400>2

atggaaattcagaacaaggccatgttaattacctatgcagatagcttaggcaaaaatctg60

aaagatgttcatcaggttctgaaagaagatattggagatgccattggcggtgttcatctg120

ctgccgtttttcccgtcaaccggcgatcgcggctttgccccagcagattatacccgcgtg180

gatgcagcctttggcgattgggccgatgtggaagccttaggtgaagaatattatctgatg240

tttgattttatgattaatcatatttcacgcgaatcagttatgtatcaggattttaagaag300

aaccatgatgatagtaaatataaggacttctttattcgctgggaaaaattttgggccaaa360

gcaggcgaaaatcgtccgacccaggccgatgtggatctgatctataagcgcaaagataaa420

gccccgacccaggaaattacctttgatgatgggaccaccgaaaatctgtggaataccttt480

ggcgaagaacagattgatattgatgtgaatagcgccattgccaaagagttcattaaaacc540

accttagaagatatggttaaacatggcgccaaccttattcgcttagatgcctttgcctat600

gccgttaaaaaagtggataccaatgacttcttcgttgaaccggaaatttgggataccctg660

aacgaagtgcgcgaaattctgaccccgctgaaagccgaaattctgccggaaattcatgaa720

cattatagcattccgaagaaaattaatgatcatggctattttacctatgattttgcactg780

ccgatgaccaccctgtataccctgtatagcggcaaaaccaatcagttagccaaatggctg840

aaaatgtctccgatgaaacagtttaccaccttagatacccatgatggcattggtgttgtg900

gatgcacgcgatattctgaccgatgatgaaattgattatgcaagcgaacagctgtataag960

gtgggcgccaatgttaaaaagacctatagctcagcaagctataacaatctggacatctat1020

cagattaatagtacctattatagtgcactgggtaatgatgatgcagcatatctgctgtct1080

cgcgtgtttcaggtgtttgcaccgggcattccgcaaatctactatgtgggcttactggcc1140

ggtgaaaatgatattgccctgctggaatcaaccaaagaaggtcgtaatattaatcgtcat1200

tattatacccgcgaagaagttaaatcagaagttaaacgtccggttgttgccaacctgctg1260

aaactgctgtcttggcgtaacgagtctccggcctttgatctggcaggctctattaccgtg1320

gataccccgaccgataccaccattgttgtgacccgccaggatgaaaatggtcagaataag1380

gcagtgctgaccgcagatgcagccaataagacctttgaaattgtggaaaatggtcagacc1440

gttatgtctagcgataatctgacccagaattaa1473