一種重組人Ⅰ型膠原蛋白及其固定化發(fā)酵生產(chǎn)的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領域，具體涉及重組人I型膠原蛋白在畢赤酵母中的表達、 固定化發(fā)酵以及生物活性鑒定。
【背景技術】
[0002] 膠原蛋白是一種非常關鍵的結構蛋白，主要存在于哺乳動物結締組織的細胞外 基質中，占全身蛋白總量的25%~35%(1^11〇，附1?)〇]\1，13〇抑116 6七&1.(]〇11&8611已11(1 Gelatin. Annual Review of Food Science and Technology, 2015, 6:527-557) 〇 膠原蛋白 由三條α鏈相互纏繞形成的右手螺旋結構，α鏈是由G-X-Y氨基酸三聯(lián)體的重復序列構 成，G是甘氨酸，X和Y通常是脯氨酸和羥脯氨酸（He L，Mu C，Shi J et al. Modification of collagen with a natural cross-linker,procyanidin. International journal of biological macromolecules，2011，48 (2) : 354-359) D 到目前為止，已發(fā)現(xiàn) 29 種 膠原蛋白，其中I型膠原蛋白含量最高，約占總量的90% (Jridi M，Bardaa S，Moalla D et al.Microstructure, rheological and wound healing properties of collagen-based gel from cuttlefish skin.International journal of biological macromolecules，2015, 77:369-374)。在新組織的形態(tài)發(fā)生和細胞代謝中，它賦予新組織機 械強度和特殊的生化特性（Ferreira AM，Gentile P，Chiono V，et al. Collagen for bone tissue regeneration. Actabiomaterialia，2012, 8 (9):3191-3200)〇
[0003] 膠原蛋白具有生物可降解性、良好的生物相容性、低抗原性、低細胞毒性、親水性 好等功能，并且能促進細胞增殖（Liu D，Nikoo M，Boran G et al. Collagen and Gelatin. Annual Review of Food Science and Technology，2015, 6:527-557) D 它能被加工形成各 種形式，例如交聯(lián)的膜、薄片、珠粒、纖維和海綿（Lee C，Lee Y. Biomedical applications and tissue engineering of collagen. Advanced Drug Delivery, 2013:445) 〇 基于以上 特性，膠原蛋白被廣泛地應用于臨床醫(yī)學，例如注射型膠原蛋白可以用于止血、燒傷、繃帶、 血管移植等（Prajapati VD，Jani GK，Kapadia JR. Current knowledge on biodegradable microspheres in drug delivery. Expert opinion on drug delivery, 2015, 17:1-17)〇
[0004] 膠原蛋白目前主要通過酸、堿水解的方式從動物結締組織中提取，在提取過程中 無法避免會喪失部分生物活性，作用于人體會產(chǎn)生異種排斥反應，而且存在感染病毒的 隱患（Olsen Dj Jiang J，Chang R et al. Expression and characterization of a low molecular weight recombinant human gelatin:development of a substitute for animal-derived gelatin with superior features. Protein expression and purific ation，2005, 40(2) :346-357)。由于膠原蛋白在醫(yī)用材料等領域有廣闊的應用前景，所以 迫切需要新的手段制備膠原蛋白，利用基因工程技術生產(chǎn)重組人膠原蛋白成為熱門的研 究令頁域（Olsen Dj Yang C，Bodo M，et al. Recombinant collagen and gelatin for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews，2003, 55 (12) : 1547-1567) a Li 等將人 I 型 膠原蛋白α I鏈的氨基酸序列進行拼接和重復，經(jīng)畢赤酵母表達和純化，證明其能促進乳 倉鼠腎細胞的增殖（Li L, Fan D, Ma X，et al. High-level secretory expression and purification of unhydroxylated human collagen a I (III)chain in Pichiapastoris GSl15.Biotechnology and applied biochemistry, 2015,doi:10. 1002/bab. 1297)〇 Yao等重復構建類人I型膠原蛋白a I鏈的特定肽段，在大腸桿菌中表達、純化，證明 該序列可以促進小鼠成纖維細胞3T3粘附和自身交聯(lián)（Yao J, Yanagisawa S, Asakura T. Design, expression and characterization of collagen-like proteins based on the cell adhesive and crosslinking sequences derived from native collagens. Journal of biochemistry, 2004, 136(5):643-649)〇
[0005] 纖維床生物反應器（fibrous bed bioreactor，簡稱FBB)，是一種以絲網(wǎng)為支 持物填裝纖維材料作為固定化載體的反應器。與傳統(tǒng)的固定化反應器相比，F(xiàn)BB采用具 有高孔隙率和高比表面積的纖維材料作為載體，傳質效率高；FBB固定化的細胞可以不 斷更新，活細胞比例高；同時FBB還有具有成本低、制作簡單、底物耐受性高、穩(wěn)定性好等 優(yōu)點(Zhu H, Yang S T. Long-term continuous production of monoclonal antibody by hybridoma cells immobilized in a fibrous-bed bioreactor. Cytotechnolo gy, 2004, 44(1-2) : 1-14) 〇

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種以畢赤酵母為表達體系的重組類人I型膠原蛋白制 備方法。畢赤酵母分泌表達生產(chǎn)的重組類人I型膠原蛋白既避免了動物來源膠原蛋白帶來 的病毒隱患，又能夠降低人體的免疫排斥反應，并明顯地促進哺乳動物細胞的增值。本發(fā)明 同時利用纖維床生物反應器系統(tǒng)，固定化發(fā)酵重組工程菌，與傳統(tǒng)游離細胞發(fā)酵相比，具有 不需反復接種、細胞密度高、傳質效率好、制作簡單等優(yōu)點。
[0007] 本發(fā)明技術方案如下：
[0008] -種重組人I型膠原蛋白，它的全長為344個氨基酸，以人I型膠原蛋白a 1鏈 660-964位肽段為基本構架，在其N端添加680-694位的15個氨基酸、在C端添加950-964 位的15個氨基酸以及3組GER氨基酸三聯(lián)體。添加的680-694位肽段和950-964位已被 證明可以支持細胞粘附和細胞增殖。本發(fā)明成功得到了能夠促進細胞增殖的重組類I型人 膠原蛋白。
[0009] 上述重組人I型膠原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No: 1所示。
[0010] 編碼上述蛋白的基因，其序列如SEQ ID No:2所示。
[0011] 表達重組人I型膠原蛋白的畢赤酵母重組工程菌的構建方法，其特征在于，包括 以下步驟：
[0012] a. PCR擴增目的基因
[0013] 以上述編碼上述重組人I型膠原蛋白的基因為模版，設計引物擴增目的基因，擴 增引物如下：
[0014] 上游引物：GCCTACGTAGAACAAGGCGTTCCAGGT
[0015] 下游引物：GAATGCGGCCGCAGGCAGGCCAACAACACCACG
[0016] b.構建重組質粒 pPIC9K-rhC I
[0017] 純化回收PCR產(chǎn)物，然后對載體pPIC9K和純化后的PCR產(chǎn)物進行Snab I和Not I雙酶切，T4連接酶體系連接回收目的片段和PPIC9K載體，轉化至大腸桿菌DH 5 α，涂布 于含有氨芐青霉素的LB平板，菌落PCR篩選鑒定陽性轉化子；
[0018] c.構建重組表達人I型膠原蛋白的畢赤酵母重組工程菌
[0019] 使用Sal I單酶切線性化重組質粒pPIC9K-rhC I，電擊轉化至感受態(tài)畢赤酵母 GS115,用抗生素 G418梯度篩選得