一種適合昆蟲細(xì)胞生長的無血清無動(dòng)物源培養(yǎng)基添加物的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種適合對(duì)昆蟲細(xì)胞主要包括S巧和 化曲Five細(xì)胞）的無血清無動(dòng)物源培養(yǎng)的添加物的研制。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，常用的昆蟲細(xì)胞有Sf-9細(xì)胞，即：Spodopterafrugiperda(草地貪夜蛾）細(xì) 胞和Hi曲Five細(xì)胞，Hi曲Five細(xì)胞度TI-TN-5B1-4)是來自于粉紋夜蛾燈richopulsia ni)親本細(xì)胞系的克隆分離株，常用于桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)度EV巧的重組蛋白表達(dá)。桿 狀病毒表達(dá)系統(tǒng)化aculovirusexpressionsystem)是近年來應(yīng)用較多的真核表達(dá)系統(tǒng)， 它可W在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)多種外源基因，包括真菌，植物，細(xì)菌，病毒的基因。桿狀病毒是 一類W昆蟲細(xì)胞為天然宿主的雙鏈DNA病毒，具有高度的種屬特異性，不感染脊椎動(dòng)物，對(duì) 人、畜無害。目前研究較多的是首猜銀紋夜蛾核多角體病毒（AcNPV)，其宿主是草地貪夜蛾。 而Sf-9細(xì)胞和化曲Five細(xì)胞，是桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞。在應(yīng)用于蛋白的表達(dá)與 制備純化中，有著許多的優(yōu)點(diǎn)，包括：表達(dá)的重組蛋白能正確折疊，并形成二硫鍵；翻譯后 可進(jìn)行修飾加工如糖基化、憐酸化、酷胺化及信號(hào)膚切割等，使重組蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更 接近天然蛋白；與其他真核表達(dá)系統(tǒng)相比，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)可W高效表達(dá)外源基因，表達(dá) 量最高可達(dá)被感染昆蟲細(xì)胞總蛋白量的50% ;可W容納大片段外源基因。
[0003] 目前，國內(nèi)的生產(chǎn)工藝多采用Grace培養(yǎng)基或者IPk41培養(yǎng)基添加5-10 %的小牛 血清培養(yǎng)，或者用商業(yè)化無血清培養(yǎng)基如SF90〇n再添加適當(dāng)血清培養(yǎng)。很多商品號(hào)稱是 無血清培養(yǎng)基，但是，很難做到完全脫離血清培養(yǎng)。另外，由于目前國內(nèi)血清供應(yīng)日益緊張 伴隨著價(jià)格不斷走高，對(duì)國內(nèi)生物抗體生產(chǎn)企業(yè)產(chǎn)生了明顯的限制。此外，從生產(chǎn)的角度來 講，血清中含有大量成分復(fù)雜的蛋白質(zhì)，運(yùn)極不利于疫苗、類病毒顆粒、細(xì)胞因子和單克隆 抗體等生物制品的下游純化分離，同時(shí)血清所含的化學(xué)成分不確定，血清也存在批次穩(wěn)定 性問題，而且還容易引起細(xì)菌、真菌、病毒和支原體污染。因此，盡量不用或少用血清成為昆 蟲細(xì)胞培養(yǎng)的趨勢，現(xiàn)有技術(shù)常通過添加牛血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、膜島素等動(dòng)物源成分， 來降低血清的添加量，但是動(dòng)物源成分的蛋白質(zhì)對(duì)生物制品（如疫苗）的安全性有很大影 響，所W迫切需要一種能代替血清功能的細(xì)胞培養(yǎng)添加物。既能夠使細(xì)胞快速生長，保持較 高的活力，又減少了污染的可能，提高細(xì)胞產(chǎn)品的穩(wěn)定性，同時(shí)減少動(dòng)物來源的蛋白組分含 量，利于后期純化工藝，降低生產(chǎn)成本。
[0004] 目前，商業(yè)化的昆蟲培養(yǎng)基有Grace培養(yǎng)基、I化-41培養(yǎng)基、TC100培養(yǎng)基，運(yùn) 些培養(yǎng)基都是結(jié)合血清使用的經(jīng)典的培養(yǎng)基，也有商業(yè)化的無血清培養(yǎng)基如：SF900II， SF900III，ExpressFi\c'SFM，EX-CEI丄等系列產(chǎn)品，運(yùn)些產(chǎn)品價(jià)格高且配方保密，且很 難完全去除血清培養(yǎng)，不能持續(xù)的維持細(xì)胞的活力，或者是成本較高，很少有針對(duì)于昆蟲細(xì) 胞，研發(fā)出替代血清的添加物。本發(fā)明基于上述的產(chǎn)品現(xiàn)狀，開發(fā)了適合昆蟲細(xì)胞懸浮生長 的代替血清的細(xì)胞添加物，在培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞的過程當(dāng)中，能起到代替血清的功能，并且價(jià)格 低廉。W傳統(tǒng)培養(yǎng)基Grace或者是IPk41作為基礎(chǔ)，添加有利于昆蟲細(xì)胞生長的添加物， 昆蟲細(xì)胞能夠獲得24化的連續(xù)生長，細(xì)胞活力能保持在95%W上。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽0化]本發(fā)明目的在于，克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種適合昆蟲細(xì)胞懸浮生長的無 血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)基研制過程中，用一些具有特殊功能的化合物、脂類成分、酵母和植物水 解物、微量元素和維生素代替了培養(yǎng)基中常規(guī)添加的動(dòng)物源成分，在降低血清使用成本的 同時(shí)，減小了培養(yǎng)基中血清和動(dòng)物源蛋白攜帶外源病原菌污染的機(jī)率，同時(shí)培養(yǎng)基中的蛋 白含量大幅減少，十分有利于后期純化工藝，提高細(xì)胞產(chǎn)品的穩(wěn)定性。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：提供一種適合昆蟲細(xì)胞瓶培養(yǎng) 的無血清培養(yǎng)基，其特征在于，在常規(guī)Grace或者是IPk41培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加了氨基 酸、脂類、微量元素和水解物成分，用W替代血清的功能，用于無血清的添加量，添加成分如 下：
[0007] 葡萄糖 3-15g/l， 陽00引 k精氨酸2-9mM,
[0009] k天冬酷胺
[0010] k甘氨酸 5-14mM, W11] k組氨酸 2. 77mM, 陽〇1引心異亮氨酸8.41mM, 陽01引 k亮氨酸5-llmM,
[0014] k賴氨酸 4-9mM, 陽〇1引 k蛋氨酸0. 1-0. 7mM,
[0016] k蘇氨酸
[0017] k色氨酸 0. 2-1. 4mM, 陽0化]心結(jié)氨酸，2-5mM
[0019] k脯氨酸 7-lOmM,
[0020] 棉巧水解物 300-3000mg/l，
[0021] 大米水解物 300-3000mg/l,
[0022] 麥教水解物 300-3000mg/l，
[0023] 重組膜島素2-25mg/l，
[0024] 丙酬酸鋼 50-300mg/l, 陽0巧]亞砸酸鋼0.0010. 04mg/l, 陽0%] 巧樣酸鐵0. 05-lmg/l，
[0027] 亞油酸 0. 1-0. 3mg/l，
[0028] 大豆卵憐脂 10-65mg/l,
[0029] 膽固醇 5-25mg/l，
[0030] 環(huán)庚Ξ締酪酬 0.l-6mg/l，
[0031] F-68 100-600mg/l,
[0032] 還原型谷脫甘膚0. 04-0. 5mg/l，
[0033] 心谷氨酷胺3-15g/L。
[0034] 其中，F(xiàn)-68是pluronicF-68的簡稱，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中的常用添加物，對(duì)細(xì)胞具 有保護(hù)作用。
[0035] 關(guān)于"棉巧水解物"、"麥教水解物及"大米水解物"在本領(lǐng)域中有公認(rèn)的含義， 就是將棉巧，麥教，大米，經(jīng)過特殊的工藝，包括酶消化、酸處理等手段進(jìn)行處理后，提取適 合細(xì)胞生長組分，目前均有商品化試劑，本發(fā)明具體使用的是Difico公司生產(chǎn)的水解物。
[0036] Grace和IPk41，是成分公開的培養(yǎng)基，目前均有商品化試劑，本發(fā)明具體使用的 是LifeTechnology公司生產(chǎn)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
[0037] 本發(fā)明研制的無血清培養(yǎng)基添加物，不僅降低了培養(yǎng)基成本而且還大幅減少了培 養(yǎng)基中動(dòng)物源蛋白的含量，簡化了無血清培養(yǎng)基研發(fā)的過程，更有利于細(xì)胞下游產(chǎn)品的分 離和純化。
[0038] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的另一個(gè)技術(shù)方案是適合昆蟲細(xì)胞瓶培養(yǎng)的無 血清培養(yǎng)基的配置方法，其特征在于，所述配制方法包括如下工藝步驟：
[0039] S1 :在容器中加注射用水至總體積的90%，將一袋Grace或者是IPk41培養(yǎng)基全 部倒入容器中，用少量注射用水將袋內(nèi)殘留培養(yǎng)基洗下并入容器，輕微攬拌溶解；
[0040] S2 :將上述組分依次加入到溶液中，輕微攬拌溶解；
[0041] S3 :輕微攬拌至完全溶解，加注射用水至總體積的100% ; 柳創(chuàng) S4 :用Imol/L氨氧化鋼溶液或Imol/L鹽酸溶液調(diào)抑至6. 2 ;
[0043] S5 :用0. 2μm濾膜正壓過濾除菌； W44] S6 :溶液配制完成后應(yīng)在2°C~8°C下密閉避光保存。
[0045] 其中優(yōu)選的技術(shù)方案是，所述S1步驟中注射用水的水溫為30°C。
[0046] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及有益效果是，該培養(yǎng)基通過氨基酸、脂類、微量元素、水解物等的 添加，代替了血清的功能。相比較傳統(tǒng)的IPk41+10%FBSW及Grace+10%FBS，更能促進(jìn) 細(xì)胞快速生長，增加細(xì)胞密度，縮短倍增時(shí)間，提高細(xì)胞活力，說明該發(fā)明培養(yǎng)基更適合于 昆蟲細(xì)胞細(xì)胞的無血清懸浮培養(yǎng)。
【附圖說明】
[0047] 圖1 :Sf9細(xì)胞在Grace+SM中生長曲線（左欄）與