一種穩(wěn)定表達(dá)豬瘟病毒e2蛋白的重組細(xì)胞系及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及重組哺乳動(dòng)物表達(dá)細(xì)胞系，具體設(shè)及一種穩(wěn)定表達(dá)豬攝病毒E2蛋白 重組細(xì)胞系。本發(fā)明還公開(kāi)了制備所述重組細(xì)胞系的方法和該重組細(xì)胞系在制備豬攝亞單 位疫苗中的應(yīng)用。屬于生物醫(yī)藥基因工程與免疫學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬攝（Classicalswinefever,CSFO是由豬攝病毒（Classicalswinefever virus,CSFV)引起的豬的一種急性高度致死性疾病，國(guó)際獸疫局（01巧將其定為必須通報(bào) 的疫病，我國(guó)將其列為一類(lèi)動(dòng)物疫病。豬攝每年給我國(guó)造成的經(jīng)濟(jì)損失近100億，對(duì)我國(guó)養(yǎng) 豬業(yè)的危害極其嚴(yán)重。
[0003] 目前對(duì)該病的有效預(yù)防和控制的主要措施是進(jìn)行免疫。中國(guó)科學(xué)家研究成功的豬 攝弱毒疫苗（C株）對(duì)世界范圍內(nèi)豬攝防控發(fā)揮了卓著貢獻(xiàn)。該疫苗目前仍被我國(guó)及世界 上多個(gè)國(guó)家使用。豬攝弱毒疫苗分為乳兔苗，免脾淋苗，原代細(xì)胞苗及傳代細(xì)胞苗等。乳兔 苗和脾淋苗又稱(chēng)為組織苗，是采用健康家兔生產(chǎn)制備的。組織苗的生產(chǎn)需要大量動(dòng)物，且工 藝復(fù)雜，成本高；原代細(xì)胞苗及傳代細(xì)胞苗的生產(chǎn)也受到諸多因素困擾，如細(xì)胞培養(yǎng)用血清 中BVDV及抗體會(huì)干擾病毒生長(zhǎng)，病毒生產(chǎn)滴度低、產(chǎn)量不穩(wěn)定等。而且母源抗體干擾弱毒 疫苗的免疫效果，運(yùn)也是導(dǎo)致豬攝疫苗免疫失敗的因素之一。
[0004] CSFV為有囊膜病毒，病毒粒子大小約為40-60nm。病毒基因組為單股正鏈RNA，長(zhǎng) 約12. 3化，含一個(gè)大的開(kāi)放性閱讀框（0RF)，編碼一個(gè)大的多聚蛋白含3898個(gè)氨基酸殘基， 分子量約為438kDa。多聚蛋白在翻譯的同時(shí)和翻譯后經(jīng)病毒和宿主細(xì)胞的蛋白酶加工成 12種成熟的病毒蛋白，包括結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，其中結(jié)構(gòu)蛋白有C、E0、E1和E2蛋白。 E2蛋白為CSFV的一種重要的囊膜糖蛋白，又稱(chēng)為甜55,是病毒主要的抗原蛋白。E2蛋白誘 導(dǎo)產(chǎn)生病毒的中和抗體，是豬攝病毒主要的免疫保護(hù)性抗原，也是研究豬攝基因工程疫苗 的重要祀蛋白。
[0005] 鑒于現(xiàn)有豬攝疫苗的種種缺陷與不足，W及隨著現(xiàn)代基因工程技術(shù)與細(xì)胞生物工 程技術(shù)的發(fā)展，許多科研人員試圖W現(xiàn)代分子生物學(xué)手段研制出可W克服現(xiàn)有疫苗缺陷的 新型豬攝疫苗。運(yùn)些新型的豬攝疫苗有病毒活載體疫苗、合成膚疫苗、DNA疫苗、大腸桿菌 表和昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)的E2蛋白亞單位疫苗。
[0006] 目前得到應(yīng)用的有歐洲科研人員研制的W昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)的E2蛋白亞單位 疫苗，該疫苗免疫不受母源抗體影響，而且可W與病毒感染進(jìn)行抗體檢測(cè)鑒別診斷，如 出ulst,etal.切totechnology, 20 (1-3) : 271-277]用 20μg昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)的E2 雙相油包 水乳劑免疫豬，能抵抗100LD50CSFVBrescia毒株強(qiáng)毒的攻擊，該疫苗已于上世紀(jì)九十年代 在歐洲批準(zhǔn)上市，在歐洲國(guó)家的豬攝根除計(jì)劃中發(fā)揮了重要作用。但是，該疫苗是通過(guò)昆蟲(chóng) 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的，相對(duì)原核表達(dá)系統(tǒng)而言，該表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)蛋白后可W在一定程 度上進(jìn)行翻譯后加工與修飾，但與病毒天然抗原蛋白結(jié)構(gòu)仍有一定差異，蛋白表達(dá)后折疊 與修飾不如哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，而且該系統(tǒng)生產(chǎn)制備抗原時(shí)，細(xì)胞經(jīng)病毒感染后細(xì)胞 會(huì)裂解與死亡，對(duì)下游純化等生產(chǎn)工藝增加難度。
[0007] 慢病毒化entivirus)載體是WHIV-1 (人類(lèi)免疫缺陷I型病毒）為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái) 的基因治療載體，它對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能夠穩(wěn)定表達(dá)豬攝病毒E2蛋白， 且克服了表達(dá)豬攝病毒E2蛋白對(duì)細(xì)胞毒性作用的重組細(xì)胞系。
[0009] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述重組細(xì)胞系在制備預(yù)防豬攝病毒疫苗藥物中的 應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供由上述重組細(xì)胞系和佐劑制備的豬攝亞單位疫苗。
[0011] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述豬攝亞單位疫苗的制備方法。
[0012] 本發(fā)明的上述目的是通過(guò)如下方案予W實(shí)現(xiàn)的：
[0013] 一種穩(wěn)定表達(dá)豬攝病毒E2蛋白的重組細(xì)胞系，該重組細(xì)胞系是由如下方案制備 而得：
[0014]步驟 1:
[0015] 構(gòu)建慢病毒重組載體，該慢病毒重組載體包括其中插入編碼豬攝病毒E2蛋白的 基因的序列和組氨酸標(biāo)簽序列，所述編碼豬攝病毒E2蛋白的基因的序列如SEQIDNO. 1所 示；
[001引 步驟2:
[0017] 將所述慢病毒重組載體與慢病毒包裝輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞肥K-293T，進(jìn) 行病毒包裝和生產(chǎn)，收集病毒液；
[001引 步驟3:
[0019] 用上述病毒液感染人胚胎腎細(xì)胞肥K-293T后培養(yǎng)，將培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行稀釋克隆， 收集克隆細(xì)胞培養(yǎng)上清液與細(xì)胞，檢測(cè)并比較豬攝病毒E2蛋白表達(dá)量，獲得穩(wěn)定表達(dá)豬攝 病毒E2蛋白的重組細(xì)胞系。
[0020] 上述編碼豬攝病毒E2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0021] 本發(fā)明采用SDS-PAGE電泳檢測(cè)重組細(xì)胞系的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果標(biāo)明篩選出的 重組細(xì)胞系在多次傳代后仍保持很好的蛋白表達(dá)水平，證明本發(fā)明構(gòu)建的重組細(xì)胞系能穩(wěn) 定表達(dá)目的基因一豬攝病毒E2蛋白。
[0022] 本發(fā)明還提供上述重組細(xì)胞系在制備預(yù)防豬攝病毒疫苗藥物中的應(yīng)用。
[0023] 本發(fā)明還提供一種豬攝亞單位疫苗，該疫苗是由有效劑量的本發(fā)明所述重組細(xì)胞 系和佐劑組成。
[0024] 本發(fā)明還提供一種豬攝亞單位疫苗的制備方法，具體包括如下步驟：
[00幼步驟1:
[0026] 將本發(fā)明所述的重組細(xì)胞系正常傳代后長(zhǎng)至融合度達(dá)到90%W上時(shí)，換無(wú)血清培 養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7d;收集培養(yǎng)上清經(jīng)2000rpm離屯、lOmin，吸取上清液，該上清液即為疫苗抗 原液；
[0027]步驟 2:
[0028] 將步驟1制備的疫苗抗原液與佐劑按1 :1~1 :3重量比進(jìn)行混合并充分乳化后， 則制備得到所需豬攝亞單位疫苗。
[0029] 上述豬攝亞單位疫苗為雙相油佐劑疫苗，所述佐劑為礦物油佐劑。
[0030] 本發(fā)明制備的穩(wěn)定表達(dá)豬攝病毒E2蛋白的重組細(xì)胞系，具有容易培養(yǎng)、增殖快 速、可無(wú)限擴(kuò)大、性質(zhì)穩(wěn)定和蛋白表達(dá)量高的特點(diǎn)，其表達(dá)蛋白與佐劑制備成疫苗后免疫豬 能誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)豬攝病毒中和抗體，可抵抗豬攝病毒強(qiáng)毒攻擊。
[0031] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下有益效果：
[0032] 1、現(xiàn)有技術(shù)中采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后克隆篩選最終獲得的細(xì)胞系，其重組基因表達(dá) 不穩(wěn)定，不易獲得高水平細(xì)胞株；而本發(fā)明采用慢病毒載體攜帶目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒后 轉(zhuǎn)染肥K-293T細(xì)胞，產(chǎn)生的高滴度病毒顆粒再感染肥K-293T細(xì)胞從而構(gòu)建得到的重組細(xì) 胞系，表達(dá)穩(wěn)定，在多次傳代后仍保持很好的蛋白表達(dá)水平；
[0033] 2、本發(fā)明所選用的表達(dá)系統(tǒng)為肥K-293T細(xì)胞，得到的重組細(xì)胞系肥K-293T-E2具 有與親本細(xì)胞相似的生物特性，有利于抗原蛋白的規(guī)模生產(chǎn)；表達(dá)蛋白在表達(dá)細(xì)胞內(nèi)能得 到接近病毒蛋白的天然構(gòu)象與修飾加工，抗原性好；重組細(xì)胞可W用轉(zhuǎn)瓶高密度發(fā)酵培養(yǎng)， 易于大量生產(chǎn)；
[0034] 3、本發(fā)明構(gòu)建的慢病毒重組載體中，除了包含插入編碼豬攝病毒E2蛋白的基因 的序列外，還含有組氨酸標(biāo)簽序列，有利于后期純化；
[0035] 4、本發(fā)明的重組表達(dá)細(xì)胞系可W利用無(wú)血清培養(yǎng)基或低血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)表 達(dá)，可W降低疫苗生產(chǎn)成本；
[0036] 5、將本發(fā)明的表達(dá)豬攝病毒E2蛋白的重組細(xì)胞培養(yǎng)物制備疫苗可W誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī) 體產(chǎn)生針對(duì)CSFV的高效價(jià)抗體，阻止病毒感染動(dòng)物機(jī)體；
[0037] 6、本發(fā)明抗原表達(dá)量高，利用普通細(xì)胞培養(yǎng)瓶皿培養(yǎng)，產(chǎn)量可達(dá)200毫克每升；
[0038] 7、利用本發(fā)明的重組表達(dá)細(xì)胞系細(xì)胞培養(yǎng)物制備的油佐劑疫苗能誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體 產(chǎn)生高效價(jià)抗體，抗體持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，能對(duì)免疫動(dòng)物提供長(zhǎng)久的有效的免疫保護(hù)；
[0039] 8、利用本發(fā)明重組細(xì)胞系表達(dá)抗原制備的疫苗免疫動(dòng)物不產(chǎn)生豬攝病毒E0蛋白 抗體W及非結(jié)構(gòu)蛋白抗體，可W利用檢測(cè)豬攝病毒E0蛋白抗體或非結(jié)構(gòu)蛋白抗體來(lái)對(duì)疫 苗免疫與病毒感染動(dòng)物進(jìn)行鑒別；
[0040] 9、本發(fā)明所制備的豬攝疫苗不含病毒核酸，不能復(fù)制，無(wú)致病性，具有極高的生物 安全性，疫苗免疫不受母源抗體或已經(jīng)存在抗體干擾與影響。
【附圖說(shuō)明】
[0041] 圖1為慢病毒重組載體PLV-CMV-E2構(gòu)建示意圖；
[0042] 圖2為慢病毒重組載體PLV-CMV-E2的菌落PCR電泳圖；
[0043] 圖中，Μ為化2000Marker，1-6為分別為1-6號(hào)克隆的菌落PCR結(jié)果，7為陰性對(duì) 照，8為陽(yáng)性對(duì)照；
[0044] 圖3為慢病毒重組載體PLV-CMV-E2的化eI酶切電泳圖；
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