一種人重組Irisin蛋白及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程領(lǐng)域中重組基因的可溶性表達(dá)和純化方法，特別設(shè)及人 Irisin蛋白的原核表達(dá)和純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] Irisin是2012年年初由Spiegelman實(shí)驗(yàn)室在《自然》雜志上報(bào)道的一種新 的肌肉因子，是蛋白水解酶剪切III型纖連蛋白組件包含蛋白5(fibronectintypeIII domain-containingprotein5，F(xiàn)NDC5)后形成的可分泌多膚片段。人FND巧的N-端有 一個(gè)信號(hào)序列，中間為III型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域（FND)，緊接其后的為疏水氨基酸區(qū)和C-末端。 Irisin是FND巧中纖連蛋白結(jié)構(gòu)域的主要部分，是由112個(gè)氨基酸殘基組成的N-糖基化蛋 白質(zhì)激素，其序列在種屬間高度保守，人和小鼠的Irisin氨基酸序列同源性為100%。
[0003] 發(fā)現(xiàn)者用希臘神話中信使女神Iris的名字為Irisin命名，暗喻其像Iris-樣， 作為骨骼肌的使者，傳遞骨骼肌的信號(hào)，并連接骨骼肌與外周組織的關(guān)系。Irisin最重要的 生物學(xué)功能是通過內(nèi)分泌、旁分泌和自分泌的方式作用于白色脂肪細(xì)胞，使后者轉(zhuǎn)變?yōu)榫?有分解代謝脂肪特征的棟色脂肪細(xì)胞，W產(chǎn)熱的方式消除白色脂肪，從而起到減肥作用。研 究表明，尊尾素水平主要反映了肌肉質(zhì)量，且在年輕的男性運(yùn)動(dòng)員中其量高于老年女性；另 有研究表明，II型糖尿病患者的血清Irisin水平是降低的，并且與新發(fā)II型糖尿病的發(fā) 病率呈反比，表明Irisin可能在糖耐量和II型糖尿病中發(fā)揮關(guān)鍵作用；此外，有關(guān)報(bào)道還 指出Irisin與非酒精性脂肪肝、屯、率衰竭等病理現(xiàn)象存在一定的相關(guān)性。
[0004] 可W看出Irisin必將是一個(gè)很有前景的活性因子，并成為代謝性疾病及其并發(fā) 癥防治的新祀點(diǎn)，有非常大的潛在價(jià)值。因此，開發(fā)Irisin蛋白的可大規(guī)模生產(chǎn)并便于純 化的方法，具有非常大的價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[00化]發(fā)明目的：本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種人Irisin重組蛋白的DNA序列。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種人Irisin重組蛋白。
[0007] 本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供含有所述的人Irisin重組蛋白的DNA序列的重組表 達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系統(tǒng)或轉(zhuǎn)基因重組菌。
[0008] 本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種轉(zhuǎn)基因重組菌。
[0009] 本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種人Irisin重組蛋白的制備方法。
[0010] 本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種人Irisin重組蛋白在制備代謝性疾病藥物的應(yīng) 用。
[0011] 技術(shù)方案：為了解決上述問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種人Irisin重組蛋白 的DNA序列，其堿基序列如SEQIDNO:1所示。 陽01引一種人Irisin重組蛋白，其氨基酸序列如沈QIDNO:2所示。
[0013] 含有所述的人Irisin重組蛋白的DNA序列的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系統(tǒng)或轉(zhuǎn) 基因重組菌。
[0014] 將所述的DM序列插入到大腸桿菌表達(dá)載體中得到的表達(dá)人Irisin重組蛋白的 DNA的重組表達(dá)載體。
[0015] 其中，所述大腸桿菌表達(dá)載體為祀T-30a(+)。
[0016] 一種轉(zhuǎn)基因重組菌，所述重組菌是將所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中，篩選 得到轉(zhuǎn)基因重組菌。
[0017] 所述的DNA序列、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系統(tǒng)或轉(zhuǎn)基因重組菌在生產(chǎn)人 Irisin重組蛋白中的應(yīng)用。
[0018] 一種人Irisin重組蛋白的制備方法，包括W下步驟：
[0019] 1)從人肌肉組織中提取總RNA并做反轉(zhuǎn)錄PCR得到其cDNA，WcDNA為模板，PCR 得到人Irisin的基因片段，其堿基序列如SEQIDNO:1所示；
[0020] 2)構(gòu)建祀T30a-Irisin原核表達(dá)載體；
[0021] 3)構(gòu)建Rosetta-pET-30a-I;risin原核表達(dá)菌株；
[0022] 4)人Irisin重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及鑒定。
[0023] 一種所述的人Irisin重組蛋白在制備代謝性疾病藥物的應(yīng)用。
[0024] 有益效果：本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有W下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明所提供的方法步驟簡(jiǎn) 便，生產(chǎn)成本低，生產(chǎn)周期短，通過本發(fā)明所提供的方法，可得到純度較高的特異性目的蛋 白。其最主要優(yōu)勢(shì)在于：本發(fā)明首次W原核表達(dá)體系實(shí)現(xiàn)了人Irisin蛋白的可溶性表達(dá)， 并且，在用儀柱純化蛋白的過程中通過咪挫梯度洗脫及抑梯度洗脫，確定了目的蛋白的最 佳洗脫條件，可得到高純度的目的蛋白。
【附圖說明】 陽0巧]圖1 :祀T-30a-Irisin載體酶切檢驗(yàn)瓊脂糖電泳分析圖（M為DL5000DNAMaker;1 為經(jīng)Ndeiahol雙酶切的祀T-30a-Irisin載體；2為未經(jīng)酶切的祀T30a-Irisin載體。可 初步判斷祀T-30a-Irisin載體成功構(gòu)建。）
[0026]圖 2 :Rosetta-pET-30a-Irisin菌株IPTG梯度誘導(dǎo)SDS-PAGE電泳分析圖（M為 PremixedProteinMarker;圖中1所用IPTG誘導(dǎo)劑濃度為OmM;2所用IPTG誘導(dǎo)劑濃度為 0.ImM;3所用IPTG誘導(dǎo)劑濃度為0. 2mM;4所用IPTG誘導(dǎo)劑濃度為0. 4mM;5所用IPTG誘 導(dǎo)劑濃度為0. 6mM;6所用IPTG誘導(dǎo)劑濃度為0. 8mM;7所用IPTG誘導(dǎo)劑濃度為1.OmM;可 看出14KDa左右位置有明顯差異，初步判斷目的蛋白有表達(dá)）
[0027] 圖3 :Rosetta-pET-30a-I;risin菌株低溫誘導(dǎo)儀柱純化SDS-PAGE電泳分析圖（M 為PremixedProteinMarker;圖中1為誘導(dǎo)菌體；2為誘導(dǎo)菌體裂解上清；3為過柱液；4 為洗涂液I;5為洗涂液II;6為洗脫液；6泳道為純化目的蛋白，其條帶單一且與預(yù)測(cè)結(jié)果 一致，運(yùn)表明本發(fā)明通過純化得到了較高純度的目的蛋白）
[0028] 圖4:人Irisin蛋白原核表達(dá)Westernblot分析圖（圖中為14邸a位置特異 性條帶，其中，1為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的Rosetta-pET-30a-Irisin菌體；2為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的 Rosetta-pET-30a-I;risin菌體；3 為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的Rosetta-pET-30a-I;risin菌體裂解上 清；4為經(jīng)儀柱純化的人Irisin原核表達(dá)蛋白。結(jié)果表明，目的蛋白成功表達(dá)。）
[0029] 圖5 :BCA蛋白濃度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 實(shí)施例1 :構(gòu)建人Irisin蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒和菌株
[0031] 1.從人肌肉組織中的到Irisin的目的基因
[0032] 從人肌肉組織中提取總RNA并做反轉(zhuǎn)錄PCR得到其cDNA。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道 及NCBI網(wǎng)上公布Irisin基因序列（NM_153756)設(shè)計(jì)引物，W上述得到的cDNA為模板，做 PCR得到人Irisin的基因片段。把上述人Irisin基因插入到PMD19-T載體中。命名為 pMD19-T-Irisin，并測(cè)序確定正確獲取目的基因。
[0033] 2.構(gòu)建祀T30a-Irisin原核表達(dá)載體
[0034] 跟據(jù)人Irisin基因序列設(shè)計(jì)引物，其中上游帶有Ndel酶切位點(diǎn)，下游帶有化〇1 酶切位點(diǎn)：
[0035]上游引物：5 ' 一TACATATGGACAGTCCCTCAGCCCCA-3 '
[0036]下游引物：5 ' 一CACTCGAGCTCTTTCATGGTTACCTCA-3，
[0037] W步驟1中pMD19-T-Irisin載體為模板，用上述的一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 陽03引 PCR體系：