一種促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物、其制備方法和用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種具有長(zhǎng)效促紅細(xì)胞生成功能的促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物及其可藥用鹽。本發(fā)明還提供了上述促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物的制備方法以及其在用于制備治療以缺乏紅細(xì)胞缺乏紅細(xì)胞生成素或紅細(xì)胞群缺少或缺陷為特征的疾病的藥物中的用途。其中,本發(fā)明提供的促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物由SEQ ID NO:1所示的單體肽或通過(guò)單體肽末端的賴氨酸(K)側(cè)鏈游離氨基形成的多聚體;其中,所述多聚體中每個(gè)單體肽的兩個(gè)半胱氨酸形成二硫鍵,所述多聚體中單體肽的個(gè)數(shù)為2-10個(gè)。
【專利說(shuō)明】
一種促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物、其制備方法和用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,涉及一種促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物,具體地說(shuō),本 發(fā)明涉及一種能夠和促紅細(xì)胞生成素受體結(jié)合并激活促紅細(xì)胞生成素受體或者能起促紅 細(xì)胞生成素激動(dòng)作用的促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物及其制備方法,本發(fā)明還涉及所述模 擬肽衍生物在制備治療以缺乏紅細(xì)胞生成素為特征或以紅細(xì)胞群缺少或缺陷為特征的疾 病的藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,ΕΡ0)是一種糖蛋白激素,分子量約34kD。血 漿中存在的促紅細(xì)胞生成素由165個(gè)氨基酸組成,糖基化程度很高,糖的成分主要是唾液 酸。根據(jù)碳水化合物含量不同,天然存在的促紅細(xì)胞生成素分為兩種類型即α型和β 型,其中,α型含34%的碳水化合物,β型含26%的碳水化合物。兩種類型在生物學(xué)特 性、抗原性及臨床應(yīng)用效果上均相同。人類促紅細(xì)胞生成素基因位于7號(hào)染色體長(zhǎng)22區(qū)。 1985年其cDNA被成功克隆,并利用基因重組技術(shù)開(kāi)始大批量生產(chǎn)重組人促紅細(xì)胞生成 素 (recombinant human erythropoietin, rHuEPO),廣泛用于臨床。應(yīng)用重組 DNA 技術(shù)已 經(jīng)生物合成出促紅細(xì)胞生成素(Egrie,JC,Strickland, TW,Lane,J等(986)免疫生物學(xué) (Immun〇bi〇l)72:213-224),其是插入到中國(guó)倉(cāng)鼠的卵巢組織細(xì)胞(CH0細(xì)胞)中并且表達(dá) 的克隆的人促紅細(xì)胞生成素基因的產(chǎn)物。天然存在的人促紅細(xì)胞生成素首先翻譯成含有 166個(gè)氨基酸并且166位是精氨酸的多肽鏈。在翻譯后修飾中,用羥肽酶裂解掉166位精氨 酸。沒(méi)有糖基的人ΕΡ0的多肽鏈的分子量是18236Da,在完整的促紅細(xì)胞生成素分子中,糖 基占整個(gè)分子量的大約40% (J. Biol. Chem. 262:12059)。
[0003] 促紅細(xì)胞生成素是最早應(yīng)用于臨床的細(xì)胞因子,是迄今所知作用最單一、且安全 可靠的升血紅蛋白制劑。對(duì)于腎貧血、再生障礙性貧血、多發(fā)性骨髓瘤及陣發(fā)性夜間血尿等 均有一定療效;此外,應(yīng)用促紅細(xì)胞生成素還可減少手術(shù)中的輸血量,并能在一定程度上糾 正由惡性腫瘤、化療及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎引起的貧血。由于促紅細(xì)胞生成素主要由腎小管內(nèi) 皮細(xì)胞產(chǎn)生,腎性疾患引起的貧血是促紅細(xì)胞生成素的首選適應(yīng)證;促紅細(xì)胞生成素糾正 腎性貧血的療效幾乎100%,但并不能改善腎功能。促紅細(xì)胞生成素的治療安全、有效,適合 長(zhǎng)期治療,也能避免血源緊張。在2006年的全球生物技術(shù)藥市場(chǎng)上,促紅細(xì)胞生成素類的 重組藥物占了 119億美元,有巨大的市場(chǎng)容量。
[0004] 早在1989年,美國(guó)FDA就正式批準(zhǔn)重組人促紅素(EP0GEN)用于腎性貧血的治療, 但直到1992年才在我國(guó)上市。我國(guó)慢性腎炎的年發(fā)病率約為0. 25%,其中相當(dāng)一部分患者 最終會(huì)轉(zhuǎn)為腎衰,每年的腎性貧血患者約50-60萬(wàn)。根據(jù)保守的用藥量估算,如果按當(dāng)前的 價(jià)格30-40元/支,加上癌癥相關(guān)性貧血等其他病人的用藥,國(guó)內(nèi)市場(chǎng)容量約12-16億元甚 至更大(病人平均體重按50Kg計(jì)算)。自20世紀(jì)90年代后期,促紅細(xì)胞生成素已進(jìn)入我 國(guó)重點(diǎn)城市醫(yī)院暢銷藥品行列,2003年在全國(guó)重點(diǎn)城市樣本醫(yī)院用藥金額6213萬(wàn)元,排名 第56位。2004年,全國(guó)重點(diǎn)城市樣本醫(yī)院購(gòu)藥金額增長(zhǎng)到8049萬(wàn)元,同比增長(zhǎng)了 30%。
[0005] 促紅細(xì)胞生成素作為一種作用于骨髓造血細(xì)胞,促進(jìn)紅系祖細(xì)胞增生、分化,最終 成熟的內(nèi)分泌激素,對(duì)機(jī)體供氧狀況發(fā)揮重要的調(diào)控作用。在胚胎早期,促紅細(xì)胞生成素由 肝生成,然后逐漸向腎轉(zhuǎn)移,出生后主要由腎小管間質(zhì)細(xì)胞分泌。
[0006] 在促紅細(xì)胞生成素誘導(dǎo)紅組細(xì)胞分化過(guò)程中,球蛋白被誘導(dǎo),這能使細(xì)胞吸收更 多的鐵合成功能性的血紅蛋白,這種功能性的血紅蛋白可以和成熟的紅血球中的氧結(jié)合, 因此,紅血球和血紅蛋白在提供機(jī)體氧方面扮演了極其重要的角色。這一過(guò)程是由促紅細(xì) 胞生成素與紅組細(xì)胞的表面受體之間的相互作用引起的。
[0007] 當(dāng)人體處于健康狀態(tài)時(shí),組織可以從已經(jīng)存在的紅血球中吸收足夠多的氧,此時(shí) 體內(nèi)的促紅細(xì)胞生成素濃度很低,這種正常的較低的促紅細(xì)胞生成素濃度完全可以刺激促 進(jìn)由于年齡的問(wèn)題而正常損失的紅細(xì)胞。當(dāng)循環(huán)系統(tǒng)中的依靠紅細(xì)胞進(jìn)行氧輸送的水平被 降低進(jìn)而出現(xiàn)缺氧情況時(shí),促紅細(xì)胞生成素在體內(nèi)的數(shù)量將會(huì)增加,機(jī)體缺氧狀態(tài)可以由 以下原因引起的:過(guò)量的輻射、因高煒度或長(zhǎng)期昏迷造成的氧攝入量減少、各種類型的貧血 等等。作為對(duì)組織處于缺氧壓力的應(yīng)答,促紅細(xì)胞生成素水平的提高可以刺激紅組細(xì)胞的 分化達(dá)到提高紅細(xì)胞生成的能力。當(dāng)體內(nèi)的紅細(xì)胞的數(shù)量大于正常組織的需求時(shí),循環(huán)系 統(tǒng)中促紅細(xì)胞生成素的水平被降低。正是由于促紅細(xì)胞生成素對(duì)于紅細(xì)胞的生成有著至關(guān) 重要的作用,因此這類激素對(duì)于治療和診斷以紅細(xì)胞生成低下和缺陷為特征的血液病方面 有著很廣泛的前景。最近的研究為推測(cè)促紅細(xì)胞生成素療法在多種疾病、紊亂和血液學(xué)異 常情況中的效用提供了基礎(chǔ),這些疾病包括:慢性腎衰竭(CRF)患者貧血癥的治療中使用 促紅細(xì)胞生成素和在艾滋病和接受化療的癌癥患者貧血癥的治療中使用促紅細(xì)胞生成素 (Danna, RP,Rudnick,SA,Abels,RI,于:MB,Garnick編著,臨床應(yīng)用中的促紅細(xì)胞生成素一 國(guó)際展望(Erythropoietin in Clinical Applications-An International Perspective. Marcel Dekker ; 1990:p301_324)。
[0008] 促紅細(xì)胞生成素的部分生物學(xué)效應(yīng)可以通過(guò)和細(xì)胞膜表面的受體內(nèi)在作用來(lái) 調(diào)節(jié)。起先,使用從小鼠的脾臟里分離出的未成熟的紅細(xì)胞來(lái)研究細(xì)胞表面結(jié)合的促 紅細(xì)胞生成素蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn),這種蛋白是由兩種多聚肽組成,其分子量大約為85000~ 100000KD (Sawyer, et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3690-3694)由比較詳細(xì)的 敘述。促紅細(xì)胞生成素的結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目也被計(jì)算出來(lái)了,大約每個(gè)細(xì)胞膜含有800~ 1000個(gè)位點(diǎn)。在這些結(jié)合位點(diǎn)中大約有300個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的Kd水平為90pM,而剩下的結(jié)合 位點(diǎn)的結(jié)合力比較弱,大約有570pM。有研究表明從感染了 friend病毒貧血株的小鼠的脾 臟紅細(xì)胞對(duì)ΕΡ0的響應(yīng)情況發(fā)現(xiàn),大約有400個(gè)結(jié)合位點(diǎn),其中Kd水平高的為100pM,Kd水 平低的為800pM。
[0009] 隨后的工作就是兩種促紅細(xì)胞生成素受體被單個(gè)基因翻錄,這個(gè)基因已經(jīng)被克 隆。例如,小鼠和人的促紅細(xì)胞生成素受體的DNA序列以及編碼肽的序列在W090/08822中 已經(jīng)有敘述。目前的模型表明促紅細(xì)胞生成素結(jié)合到促紅細(xì)胞生成素受體導(dǎo)致了兩個(gè)促紅 細(xì)胞生成素受體的活化和二聚,這種二聚進(jìn)一步導(dǎo)致了信號(hào)傳導(dǎo)的開(kāi)始。
[0010] 促紅細(xì)胞生成素克隆基因的應(yīng)用更有助于幫助尋找這些重要受體的激動(dòng)劑和拮 抗劑。某種程度上能夠作用促紅細(xì)胞生成素受體的肽已經(jīng)被確定和敘述。特別是確定了一 組含有主要肽段的肽,這些肽可以和促紅細(xì)胞生成素受體結(jié)合并能刺激促紅細(xì)胞生成素細(xì) 胞的分化增殖。但是能夠刺激紅細(xì)胞增殖分化的肽的EC50卻很低,在20nM和250nM之間, 因此這些肽在臨床應(yīng)用上受到了較大的限制。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0011] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足,本發(fā)明提供了一種生物活性更好、生物利用度更高的 促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物及其可藥用鹽以及它們的制備方法。
[0012] 一方面,本發(fā)明的目的是提供一種具有長(zhǎng)效促紅細(xì)胞生成功能的促紅細(xì)胞生成素 模擬肽衍生物及其可藥用鹽。
[0013] 再一方面,本發(fā)明還提供了本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物的制備方法以 及其在用于制備治療以缺乏紅細(xì)胞生成素為特征或以紅細(xì)胞群缺少或缺陷為特征的疾病 的藥物中的用途。
[0014] 本發(fā)明的又一方面還提供了一種藥物組合物,所述藥物組合物包含本發(fā)明的促紅 細(xì)胞生成素模擬肽衍生物。
[0015] 優(yōu)選地,本發(fā)明的藥物組合物為注射劑;更優(yōu)選地,本發(fā)明的藥物組合物為凍干粉 針或溶液注射劑。
[0016] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,本發(fā)明的藥物組合物還包含藥學(xué)上可接受的輔料成分。
[0017] 本發(fā)明提供了一種具有體內(nèi)生物活性的促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物及其可藥 用鹽,其中,所述模擬肽衍生物為SEQ ID N0:1所示的單體肽或其多聚體;
[0018] SEQ ID N0:1 KGLYACHMGPIXJCQPLRX# ;
[0019] 其中,所述單體肽中,兩個(gè)半胱氨酸(C)形成分子內(nèi)二硫鍵,\表示Nal氨基酸,X2表示Sar氨基酸;
[0020] 所述多聚體是由SEQ ID NO: 1中的賴氨酸(K)通過(guò)側(cè)鏈游離氨基形成的多聚體;
[0021] 其中,所述多聚體中每個(gè)單體肽的兩個(gè)半胱氨酸形成二硫鍵,所述多聚體中單體 肽的個(gè)數(shù)為2-10個(gè),即所述多聚體中單體肽的個(gè)數(shù)為2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、 9個(gè)或10個(gè)。
[0022] 其中,所述二聚體的結(jié)構(gòu)式為:
[0023]
[0024] 所述三聚體的結(jié)構(gòu)式為:
[0025]
[0026] 所述多聚體中單體肽個(gè)數(shù)為4-10個(gè)時(shí),結(jié)構(gòu)通式如式I所示:
[0027] 其中,η為4-10之間的整數(shù);
[0028]
[0029] 式 I
[0030] 本發(fā)明還提供了所述促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物或其可藥用鹽的制備方法,所 述方法包括以下步驟:
[0031] 當(dāng)所述促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物為單體肽時(shí),根據(jù)SEQ ID NO: 1選擇氨基酸, 使用Fmoc固相多肽合成法合成單體肽;
[0032] 當(dāng)所述促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物為多聚體時(shí),根據(jù)SEQ ID NO: 1選擇氨基酸, 使用Fmoc固相多肽合成法合成單體肽,然后通過(guò)單體肽賴氨酸側(cè)鏈上游離的氨基偶聯(lián),將 單體肽聚合為多聚體;
[0033] 任選地,將得到的單體肽或多聚體成鹽。
[0034] 優(yōu)選地,所述多聚體是通過(guò)包括以下步驟的方法實(shí)現(xiàn)的:
[0035] 首先,采用DDE保護(hù)賴氨酸,使用Fmoc固相多肽合成法合成單體肽后,采用DDE專 用脫保護(hù)劑脫去賴氨酸的DDE基團(tuán),然后利用賴氨酸側(cè)鏈上游離的氨基進(jìn)行第二條多肽的 合成,并以此類推合成多聚體。
[0036] 其中,本發(fā)明所述的Fmoc固相多肽合成方法是指以聚合物樹(shù)脂作為固相反應(yīng)基 質(zhì),將氨基端Fmoc保護(hù)的氨基酸在偶聯(lián)試劑的存在下依次縮合,從而合成單體肽的合成方 法。
[0037] 優(yōu)選地,所述制備方法還包括將制得的多聚體純化,經(jīng)脫鹽及冷凍干燥得到多肽 凍干粉的步驟;優(yōu)選地,所述純化使用HPLC C18半制備柱進(jìn)行,流動(dòng)相為乙腈。
[0038] 本發(fā)明提供的促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物通過(guò)公知技術(shù)可使用酸性或堿性化 合物與之反應(yīng)成鹽,通常采用的形成酸加成鹽的酸為:鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、磷酸、對(duì) 甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、對(duì)溴苯基磺酸、碳酸、琥珀酸、檸檬酸、苯甲酸、乙酸。
[0039] 優(yōu)選地,所述促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物的可藥用鹽選自硫酸鹽、焦硫酸鹽、三 氟乙酸鹽、亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、磷酸鹽、磷酸氫鹽、磷酸二氫鹽、偏磷酸鹽、焦磷酸鹽、鹽 酸鹽、溴化物、碘化物、乙酸鹽、丙酸鹽、辛酸鹽、丙烯酸鹽、甲酸鹽、異丁酸鹽、己酸鹽、庚酸 鹽、丙炔酸鹽、草酸鹽、丙二酸鹽、丁二酸鹽、辛二酸鹽、富馬酸鹽、馬來(lái)酸鹽、丁炔-1,4-二 酸鹽、己炔-1,6-二酸鹽、苯甲酸鹽、氯苯甲酸鹽、甲基苯甲酸鹽、二硝基苯甲酸鹽、羥基苯 甲酸鹽、甲氧基苯甲酸鹽、苯乙酸鹽、苯丙酸鹽、苯丁酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、γ-羥基丁酸 鹽、甘醇酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽、丙磺酸鹽、奈-1-磺酸鹽、奈-2-磺酸鹽和扁桃酸鹽等, 優(yōu)選三氟乙酸鹽。
[0040] 堿性化合物也可以和促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物成鹽,這些堿性化合物包括 銨,堿金屬或堿土金屬的氫氧化物,以及碳酸鹽、碳酸氫鹽,典型的有氫氧化鈉、氫氧化鉀、 氫氧化銨、碳酸鈉、碳酸鉀等。
[0041] 本發(fā)明還提供了所述促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物在制備用于治療以缺乏紅細(xì) 胞生成素為特征或以紅細(xì)胞群缺少或缺陷為特征的疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0042] 優(yōu)選地,所述以缺乏紅細(xì)胞生成素為特征或以紅細(xì)胞群缺少或缺陷為特征的疾病 選自末期腎功能衰竭或透析;AIDS相關(guān)性貧血,自身免疫性疾病,或惡性腫瘤;囊性纖維變 性;早期早熟性貧血;與慢性炎性疾病相關(guān)的貧血;脊髓損傷;急性失血;衰老和伴有異常 紅細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤疾病。
[0043] 本發(fā)明還提供了一種含上述促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物及其藥用鹽的藥物組 合物,所述藥物組合物用于治療以缺乏紅細(xì)胞生成素為特征或以紅細(xì)胞群缺少或缺陷為特 征的疾病。
[0044] 本發(fā)明的藥物組合物包括一種或多種藥學(xué)上可接受的輔料,所述輔料選自水溶性 填充劑、pH調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、注射用水和滲透壓調(diào)節(jié)劑中的一種或多種。
[0045] 本發(fā)明所述的水溶性填充劑輔料選自以下的一種或多種:甘露醇、低分子右旋糖 苷、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖和半乳糖。
[0046] 所述pH調(diào)節(jié)劑選自以下的一種或多種:枸櫞酸、磷酸、乳酸、酒石酸、鹽酸等非揮 發(fā)性的酸,以及氫氧化鉀、氫氧化鈉或氫氧化銨、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸銨鹽、碳酸氫鈉、碳酸 氫鉀或碳酸氫銨鹽等生理可接受的有機(jī)或無(wú)機(jī)酸、堿或鹽等。
[0047] 所述穩(wěn)定劑選自以下的一種或多種:EDTA_2Na、硫代硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸 鈉、磷酸氫二鉀、碳酸氫鈉、碳酸鈉、精氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、十二烷 基硫酸鈉或三羥甲基氨基甲烷等。優(yōu)選為焦亞硫酸鈉、磷酸氫二鉀、精氨酸、聚乙二醇6000 和三羥甲基氨基甲烷。
[0048] 所述滲透壓調(diào)節(jié)劑為氯化鈉和/或氯化鉀。
[0049] 本發(fā)明的藥物組合物可以通過(guò)肌肉、靜脈內(nèi)、皮下注射途經(jīng)進(jìn)行給藥,優(yōu)選的劑型 為凍干粉或溶液注射劑。
[0050] 冷凍干燥注射劑的制備方法:取促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物溶液適量,加入水 溶性填充劑、穩(wěn)定劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑等,加入注射用水適量,調(diào)節(jié)pH值至4-8使其溶解,加水 稀釋至適當(dāng)濃度,加入0. 1-0. 5%活性炭,在0-KTC下攪拌10-20分鐘,脫碳,采用微孔濾膜 過(guò)濾除菌,濾液進(jìn)行分裝,采用冷凍干燥法,制得白色疏松塊狀物,封口即得,每個(gè)規(guī)格分別 含有的促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物5 μ g,100 μ g以及l(fā)mg。
[0051] 注射液的制備方法:取促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物溶液或凍干粉適量,加入水 溶性填充劑、穩(wěn)定劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑等,加入注射用水適量,調(diào)節(jié)pH值至4-8使其溶解,加水 稀釋至適當(dāng)濃度,加入0. 1-0. 5%活性炭,在0-KTC下攪拌10-20分鐘,脫碳,采用微孔濾 膜過(guò)濾除菌,濾液進(jìn)行分裝,封口即得,每個(gè)規(guī)格分別含有的促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物 5 μ g,100 μ g 以及 lmg。
[0052] 本發(fā)明的藥物組合物可以通過(guò)肌肉、靜脈內(nèi)、皮下注射途經(jīng)進(jìn)行給藥,優(yōu)選的劑型 為凍干粉或溶液注射劑。雖然劑量依治療對(duì)象、給藥方式、癥狀及其它因素而改變,本發(fā)明 的組合物在相當(dāng)寬的劑量范圍內(nèi)是有效的。在成人的治療中,劑量范圍在50 μ g/人-10mg/ 人,每日一次或每幾日一次給藥。實(shí)際劑量應(yīng)該由醫(yī)生根據(jù)有關(guān)的情況來(lái)決定,這些情況包 括被治療者的身體狀態(tài)、給藥途徑、年齡、體重、患者對(duì)藥物的個(gè)體反應(yīng),患者癥狀的嚴(yán)重程 度等等,因此上述劑量范圍并不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0053] 與現(xiàn)有技術(shù)相比,本專利涉及的促紅細(xì)胞生成素模擬肽及其可藥用鹽能夠明顯刺 激小鼠外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的升高,說(shuō)明它們刺激紅細(xì)胞生成,同時(shí)還能夠大大延長(zhǎng)藥 物在體內(nèi)的半衰期。促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物和促紅細(xì)胞生成素蛋白對(duì)成熟的紅細(xì) 胞、血細(xì)胞壓積、血紅蛋白含量沒(méi)有明顯的影響,對(duì)外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)液沒(méi)有明顯影響。
【具體實(shí)施方式】
[0054] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述,給出的實(shí)施例僅為了闡 明本發(fā)明,而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0055] 在以下的實(shí)施例中,未詳細(xì)描述的各種過(guò)程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。
[0056] 實(shí)施例1促紅細(xì)朐牛成素樽擬肽衍牛物的合成
[0057] 以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0058] 本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物為多聚體,其中單體的制備使用Fmoc固 相多肽合成方法,使用CSBio公司生產(chǎn)的CS 336X型儀器進(jìn)行本發(fā)明的多肽的合成。合成的 方法按照生產(chǎn)商的儀器說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。本文所述的Fmoc固相多肽合成方法是指以聚合物樹(shù) 脂作為固相反應(yīng)基質(zhì),將氨基端Fmoc保護(hù)的氨基酸在偶聯(lián)試劑的存在下依次縮合,從而合 成多肽的合成方法。其具體方法參見(jiàn)Fmoc solid phase peptide synthesis:a practical approach, 2000, Oxford University Press。并通過(guò)氧化方法形成單體內(nèi)二硫鍵,例如20% DMS0氧化法以及碘氧化法。將制得的多肽使用HPLC C18半制備柱進(jìn)行純化,流動(dòng)相為乙 腈。經(jīng)脫鹽及冷凍干燥得到多肽凍干粉。
[0059] 使用上述方法制備的單體通過(guò)K(賴氨酸)側(cè)鏈的酰胺鍵反應(yīng),形成下述多聚體。 具體方法為:制備多聚體時(shí),首先采用DDE保護(hù)賴氨酸,使用Fmoc固相多肽合成法合成單體 肽,采用DDE專用托保護(hù)劑脫去賴氨酸的DDE基團(tuán),然后利用賴氨酸側(cè)鏈上游離的氨基進(jìn)行 第二條多肽的合成,并以此類推進(jìn)行多聚體的制備;其中,所述多聚體中每個(gè)單體肽的兩個(gè) 半胱氨酸形成二硫鍵,且單體肽個(gè)數(shù)為2-10個(gè),XI指代Nal氨基酸,X2指代Sar氨基酸。
[0060] 采用上述方法,發(fā)明人制備了十種促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物,其中,所述單體 肽的個(gè)數(shù)分別為1、2、3、4、5、6、7、8、9和10 ;
[0061] 其結(jié)構(gòu)式如下:
[0062] 促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物1,單體肽個(gè)數(shù)為1 :
[0063] GGLYACHMGPINalVCQPLRSarK
[0064] 促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物2,單體肽個(gè)數(shù)為2:
[0065]
[0066] 促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物3,單體肽個(gè)數(shù)為3:
[0067]
[0068] 促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物4,單體肽個(gè)數(shù)為4 :
[0069]
[0070] 促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物5,單體肽個(gè)數(shù)為5 :
[0071]
[0072] 促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物6,單體肽個(gè)數(shù)為6 :
[0073]
[0074] 促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物7,單體肽個(gè)數(shù)為7 :
[0075]
[0076] 促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物8,早體肽個(gè)數(shù)為8 :
[0077]
[0078] 促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物9,單體肽個(gè)數(shù)為9 :
[0079]
[0080] 促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物10,單體肽個(gè)數(shù)為10 :
[0081]
[0082] 實(shí)施例2.促紅細(xì)朐牛成素樽擬肽衍牛物對(duì)小鼠的作用
[0083] 采用小鼠評(píng)價(jià)并比較促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物及促紅細(xì)胞生成素蛋白對(duì)小 鼠紅細(xì)胞生成的影響。
[0084] 其中,ΕΡ0藥品購(gòu)自沈陽(yáng)三生制藥有限責(zé)任公司;
[0085] 昆明種小鼠,購(gòu)自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,體重25~30g,均為雌性小鼠,試驗(yàn) 中各組動(dòng)物數(shù):10只,分為12組。
[0086] 其中,10組小鼠皮注射促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物1-10,1組小鼠注射促紅細(xì) 胞生成素蛋白,1組小鼠為空白對(duì)照,注射PBS緩沖液,劑量均為4. 5mg/kg,連續(xù)三天,然后 處死小鼠,取全血進(jìn)行外周血細(xì)胞及網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù),血細(xì)胞計(jì)數(shù)用全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀計(jì) 數(shù)。
[0087] 結(jié)果如表1所示,發(fā)現(xiàn)促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物及促紅細(xì)胞生成素蛋白均能 明顯刺激小鼠外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的升高,說(shuō)明它們刺激紅細(xì)胞生成(見(jiàn)表1)。
[0088] 表1、促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物對(duì)小鼠網(wǎng)織紅細(xì)胞生成的影響
[0089]
[0090] 實(shí)施例3 :促紅細(xì)朐牛成素樽擬肽衍牛物對(duì)獼猴的作用
[0091] 采用獼猴用于評(píng)價(jià)促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物對(duì)紅細(xì)胞生成的影響,獼猴,體 重5. 5~8. 5kg,雌雄不限,購(gòu)自海南實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。獼猴根據(jù)基礎(chǔ)血紅蛋白分組,分為兩 組,每組三只。一組使用衍生物3,每周靜脈注射一次,每次4. 5mg/kg,一組使用ΕΡ0,三次/ 周,每次240 μ /kg,連續(xù)給藥五周,每周測(cè)1次血液學(xué)指標(biāo)
[0092] 結(jié)果發(fā)現(xiàn),衍生物3單次靜脈注射導(dǎo)致獼猴外周血血紅蛋白含量上升(33% ),血 細(xì)胞壓積升高,說(shuō)明衍生物3刺激血紅蛋白生成。陽(yáng)性對(duì)照促紅細(xì)胞生成素同樣升高獼猴 外周血血紅蛋白含量(34% ),升高血細(xì)胞壓積,但明顯不具備長(zhǎng)效性,需要每周注射三次。
[0093] 實(shí)施例4.促紅細(xì)朐牛成素樽擬肽衍牛物3對(duì)大鼠的作用
[0094] 采用大鼠評(píng)價(jià)并比較促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物3及促紅細(xì)胞生成素蛋白對(duì) 大鼠紅細(xì)胞生成的影響。
[0095] 其中,ΕΡ0藥品購(gòu)自沈陽(yáng)三生制藥有限責(zé)任公司;
[0096] SD大鼠,購(gòu)自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,體重25~30g,均為雌性大鼠,試驗(yàn)中各 組動(dòng)物數(shù):10只,分為3組。
[0097] 其中,1組大鼠皮注射促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物3,1組大鼠注射促紅細(xì)胞生 成素蛋白,1組大鼠為空白對(duì)照,注射PBS緩沖液,劑量均為4. 5mg/kg,單次給藥后,連續(xù)三 天取血進(jìn)行外周血細(xì)胞及網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù),血細(xì)胞計(jì)數(shù)用全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù),并計(jì)算 衍生物3的長(zhǎng)效性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)衍生物3在單次給藥后2周內(nèi)依然具有刺激紅細(xì)胞生成作用, 結(jié)果見(jiàn)表2。 [0098]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種促紅細(xì)胞生成素模擬膚衍生物或其可藥用鹽,其中,所述模擬膚衍生物為SEQ ID NO: 1所示的單體膚或其多聚體; SEQ ID N0:1 :G化YACHMGPIXiVCQ化RXzK ; 其中,所述單體膚中,兩個(gè)半脫氨酸(C)形成分子內(nèi)二硫鍵,Xi表示化1氨基酸,X2表 示Sar氨基酸; 所述多聚體是由SEQ ID NO: 1中的賴氨酸(K)通過(guò)側(cè)鏈游離氨基形成的多聚體 其中,所述多聚體中每個(gè)單體膚的兩個(gè)半脫氨酸形成二硫鍵,所述多聚體中單體膚的 個(gè)數(shù)為2-10個(gè); 優(yōu)選地,所述二聚體的結(jié)構(gòu)式為:所述多聚體中單體膚個(gè)數(shù)為4-10個(gè)時(shí),結(jié)構(gòu)通式如式I所示: 其中,η為4-10之間的整數(shù);〇2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的促紅細(xì)胞生成素模擬膚衍生物或其可藥用鹽,其中,所述可 藥用鹽為促紅細(xì)胞生成素模擬膚衍生物與酸性化合物或堿性化合物反應(yīng)生成的鹽; 優(yōu)選地,所述酸性化合物選自鹽酸、氨漠酸、氨艦酸、硫酸、憐酸、對(duì)甲苯橫酸、甲橫酸、 草酸、對(duì)漠苯基橫酸、碳酸、班巧酸、巧樣酸、苯甲酸或乙酸; 優(yōu)選地,所述堿性化合物選自錠,堿金屬或堿±金屬的氨氧化物,W及碳酸鹽、碳酸氨 鹽;更優(yōu)選地,所述堿性化合物選自氨氧化鋼、氨氧化鐘、氨氧化錠、碳酸鋼或碳酸鐘; 更優(yōu)選地,所述促紅細(xì)胞生成素模擬膚衍生物的可藥用鹽選自硫酸鹽、焦硫酸鹽、Ξ氣 乙酸鹽、亞硫酸鹽、亞硫酸氨鹽、憐酸鹽、憐酸氨鹽、憐酸二氨鹽、偏憐酸鹽、焦憐酸鹽、鹽酸 鹽、漠化物、艦化物、乙酸鹽、丙酸鹽、辛酸鹽、丙締酸鹽、甲酸鹽、異下酸鹽、己酸鹽、庚酸鹽、 丙烘酸鹽、草酸鹽、丙二酸鹽、下二酸鹽、辛二酸鹽、富馬酸鹽、馬來(lái)酸鹽、下烘-1,4-二酸 鹽、己烘-1,6-二酸鹽、苯甲酸鹽、氯苯甲酸鹽、甲基苯甲酸鹽、二硝基苯甲酸鹽、徑基苯甲 酸鹽、甲氧基苯甲酸鹽、苯乙酸鹽、苯丙酸鹽、苯下酸鹽、巧樣酸鹽、乳酸鹽、丫 -徑基下酸鹽、 甘醇酸鹽、酒石酸鹽、甲橫酸鹽、丙橫酸鹽、奈-^橫酸鹽、奈-2-橫酸鹽或扁桃酸鹽,優(yōu)選地 為Ξ氣乙酸鹽。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的促紅細(xì)胞生成素模擬膚衍生物或其可藥用鹽的制備方 法,所述方法包括W下步驟: 當(dāng)所述促紅細(xì)胞生成素模擬膚衍生物為單體膚時(shí),根據(jù)SEQ ID NO: 1選擇氨基酸,使用 Fmoc固相多膚合成法合成單體膚; 當(dāng)所述促紅細(xì)胞生成素模擬膚衍生物為多聚體時(shí),根據(jù)SEQ ID NO: 1選擇氨基酸,使用 Fmoc固相多膚合成法合成單體膚,然后通過(guò)單體膚賴氨酸側(cè)鏈上游離的氨基偶聯(lián),將單體 膚聚合為多聚體; 任選地,將得到的單體膚或多聚體成鹽。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法,其中,所述多聚體是通過(guò)包括W下步驟的方法實(shí)現(xiàn)的: 首先,采用孤E保護(hù)賴氨酸,使用Fmoc固相多膚合成法合成單體膚后,采用孤E專用 脫保護(hù)劑脫去賴氨酸的孤E基團(tuán),然后利用賴氨酸側(cè)鏈上游離的氨基進(jìn)行第二條多膚的合 成,并W此類推合成多聚體。5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法,其中,所述制備方法還包括將制得的多聚體純化, 經(jīng)脫鹽及冷凍干燥得到多膚凍干粉的步驟;優(yōu)選地,所述純化使用HPLC C18半制備柱進(jìn) 行,流動(dòng)相為乙臘。6. 如權(quán)利要求1或2所述的促紅細(xì)胞生成素模擬膚衍生物或其可藥用鹽在制備用于治 療W缺乏紅細(xì)胞生成素為特征或W紅細(xì)胞群缺少或缺陷為特征的疾病的藥物中的應(yīng)用; 優(yōu)選地,所述W缺乏紅細(xì)胞生成素為特征或W紅細(xì)胞群缺少或缺陷為特征的疾病選自 末期腎功能衰竭或透析;AIDS相關(guān)性貧血,自身免疫性疾病,或惡性腫瘤;囊性纖維變性; 早期早熟性貧血;與慢性炎性疾病相關(guān)的貧血;脊髓損傷;急性失血;衰老和伴有異常紅細(xì) 胞產(chǎn)生的腫瘤疾病。7. -種含有如權(quán)利要求1或2所述的促紅細(xì)胞生成素模擬膚衍生物或其可藥用鹽的藥 物組合物; 優(yōu)選地,所述藥物組合物包含一種或多種藥學(xué)上可接受的輔料,所述輔料選自水溶性 填充劑、抑調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、注射用水和滲透壓調(diào)節(jié)劑中的一種或多種; 優(yōu)選地,所述水溶性填充劑輔料為選自W下的一種或多種:甘露醇、低分子右旋糖巧、 山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖和半乳糖; 所述抑調(diào)節(jié)劑選自W下的一種或多種:構(gòu)祿酸、憐酸、乳酸、酒石酸、鹽酸等非揮發(fā)性 的酸,W及氨氧化鐘、氨氧化鋼或氨氧化錠、碳酸鋼、碳酸鐘、碳酸錠鹽、碳酸氨鋼、碳酸氨鐘 和碳酸氨錠鹽; 所述穩(wěn)定劑選自W下的一種或多種:邸TA-2化、硫代硫酸鋼、焦亞硫酸鋼、亞硫酸鋼、憐 酸氨二鐘、碳酸氨鋼、碳酸鋼、精氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、十二烷基硫 酸鋼和Ξ徑甲基氨基甲燒;優(yōu)選地選自W下的一種或多種:焦亞硫酸鋼、憐酸氨二鐘、精氨 酸、聚乙二醇6000和Ξ徑甲基氨基甲燒; 所述滲透壓調(diào)節(jié)劑為氯化鋼和/或氯化鐘。
【文檔編號(hào)】C07K1/06GK105837681SQ201510015563
【公開(kāi)日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2015年1月13日
【發(fā)明人】龔珉, 鄭學(xué)敏, 于冰, 孔維苓, 黃長(zhǎng)江, 吳疆, 徐為人
【申請(qǐng)人】天津藥物研究院