紅細(xì)胞膜包裹的酸敏感高分子前藥納米遞藥系統(tǒng)的制備方法及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及高分子化學(xué)和納米制劑技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種用于抗腫瘤藥物遞 送的長(zhǎng)循環(huán)酸敏感高分子遞藥系統(tǒng)的制備及用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 化療是最常見(jiàn)的惡性腫瘤治療手段之一，但是統(tǒng)計(jì)表明，目前臨床上化療并未導(dǎo) 致癌癥患者死亡率的實(shí)質(zhì)性降低。紫杉醇是最有效的化療藥物之一，主要用于治療肺癌、卵 巢癌和乳腺癌等。紫杉醇具有聚合和穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)微管的作用，致使快速分裂的腫瘤細(xì)胞在 有絲分裂階段被牢牢固定，使微管不再分開(kāi)，可阻斷細(xì)胞于細(xì)胞周期之G2與M期，使癌細(xì)胞 復(fù)制受阻斷而死亡。紫杉醇的低水溶性(0.003mg/ml)大大的限制了它在臨床上的應(yīng)用。目 前被批準(zhǔn)臨床上使用的紫杉醇制劑有:Taxol愈，由聚氧乙締藍(lán)麻油和乙醇（1:1，v/v)形成的 制劑，但聚氧乙締藍(lán)麻油會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用，如過(guò)敏反應(yīng)。二代紫杉醇制劑包括 Abraxan泌:，和Gcnexol-PM嚴(yán)，與Taxol'K相比，二代制劑降低了毒副作用，提高了耐受劑量， 顯示出了良好的藥代動(dòng)力學(xué)特性。但是釋藥和體內(nèi)循環(huán)時(shí)間較短問(wèn)題仍然存在，運(yùn)也是導(dǎo) 致紫杉醇二代制劑不理想的原因。
[0003] 在腫瘤組織中適時(shí)、足量釋藥是一個(gè)祀向納米遞藥系統(tǒng)發(fā)揮效應(yīng)的關(guān)鍵一步。為 達(dá)到運(yùn)一目的，腫瘤微環(huán)境響應(yīng)型遞藥系統(tǒng)在近年來(lái)得到很大進(jìn)步，主要包括抑敏感、溫度 敏感、酶敏感型遞藥系統(tǒng)，運(yùn)些遞藥系統(tǒng)可改善藥物釋放行為，提高藥效。目前紫杉醇聚合 物前藥已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，包括?66斗1乂，？64斗1乂，？664斗1乂。雖然與游離紫杉醇相比運(yùn)些 前藥顯示出更高的溶解性和腫瘤祀向性，但是仍存在釋藥不充分的問(wèn)題。如PGG-PTX 60小 時(shí)體外釋藥僅為10%。為改善運(yùn)一問(wèn)題，利用腫瘤組織(pH 6-6.5)及腫瘤細(xì)胞內(nèi)涵體與溶 酶體中（ <抑5)的低抑值的特征，合成了一種pH敏感的高分子水溶性紫杉醇前藥PGSC-PTX， 顯示出良好的抑敏感性【CN 201510051159.0】。
[0004] 長(zhǎng)循環(huán)納米遞藥系統(tǒng)由于可W延長(zhǎng)藥物全身傳遞時(shí)間并更好實(shí)現(xiàn)腫瘤的祀向效 果而備受關(guān)注。目前最常見(jiàn)的方法是用高親水性物質(zhì)聚乙二醇(PEG)對(duì)納米粒子進(jìn)行表面 修飾，且已有PEG化的納米遞藥系統(tǒng)上市。但是，有研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體會(huì)對(duì)PEG化納米載體產(chǎn)生抗 PEG免疫反應(yīng)，從而激發(fā)其被網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞吞隧。由于紅細(xì)胞在體內(nèi)良好的循環(huán)特性，有研 究者依據(jù)紅細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，對(duì)納米粒子表面進(jìn)行模擬紅細(xì)胞膜的修飾來(lái)達(dá)到延長(zhǎng)體內(nèi) 循環(huán)時(shí)間的目的，但是運(yùn)種方法需要進(jìn)行紅細(xì)胞膜蛋白鑒別、純化與化學(xué)連接等工作，無(wú)疑 增大了納米粒的制備難度，且難W使納米載體完全模擬紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。張良方副教授 提出利用紅細(xì)胞膜直接包裹納米粒，在保留納米粒功能的同時(shí)，賦予納米粒長(zhǎng)循環(huán)的特性。 研究表明，與PEG化納米粒相比，紅細(xì)胞膜包裹納米粒的半衰期延長(zhǎng)了2.5倍。此外，由于紅 細(xì)胞膜的易獲得性、內(nèi)源性、低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，可W大大增加遞藥系統(tǒng)的成藥性。因此，紅 細(xì)胞膜包裹技術(shù)為增加納米遞藥系統(tǒng)的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間、提高藥物成藥性和有效性提供了一 種簡(jiǎn)單實(shí)用的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于針對(duì)遞藥系統(tǒng)在體內(nèi)的長(zhǎng)循環(huán)、釋藥問(wèn)題，提供一種紅細(xì)胞膜 包裹的載紫杉醇的酸敏感納米遞藥系統(tǒng)RBCm/PGSC-Pl'X用于腫瘤治療藥物的制備。將該遞 藥系統(tǒng)靜脈注射入血后，紅細(xì)胞膜的包裹可保證該遞藥系統(tǒng)在血液中長(zhǎng)循環(huán);在腫瘤酸性 環(huán)境中，PGSC-Pl'X可加速降解并釋放足量的PTX，殺死腫瘤細(xì)胞。該遞藥系統(tǒng)的成功實(shí)施將 為當(dāng)前腫瘤治療提供一種合理化方式。
[0006] 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的具體技術(shù)方案是：
[0007] -種紅細(xì)胞膜包裹的酸敏感高分子前藥納米遞藥系統(tǒng)的制備方法，該納米遞藥系 統(tǒng)由紅細(xì)胞膜包裹酸敏感高分子前藥納米粒構(gòu)成，其酸敏感高分子前藥為PGSC-PTX，由聚 谷氨酸鋼和簇甲半脫氨酸通過(guò)膚鍵連接組成，再與抗癌藥物紫杉醇PTX鍵合形成，其結(jié)構(gòu)如 下：
[0009] 能自組裝形成平均粒徑為50nm的納米粒，并可在酸性環(huán)境下釋放藥物PTX;
[0010] 特點(diǎn)在于，所述納米遞藥系統(tǒng)的制備方法包括：
[OOW 步驟1:制備紅細(xì)胞囊泡：取小鼠全血，離屯、操作，破膜釋放內(nèi)含物，得到空紅細(xì)胞 膜，超聲得到均一的紅細(xì)胞膜囊泡；
[001 ^ 步驟2:紅細(xì)胞膜囊泡與酸敏感高分子前藥比例為50-70億個(gè):6-lOmg，將酸敏感高 分子前藥與紅細(xì)胞膜囊泡混合，在IOOW，59Hz條件下超聲5min;得到粒徑均一的紅細(xì)胞膜包 裹的酸敏感高分子前藥納米粒即所述納米遞藥系統(tǒng)RBCm/PGSC-PTX，通過(guò)G50葡聚糖凝膠柱 分離純化；
[0013] 步驟3:測(cè)定所述納米遞藥系統(tǒng)的粒徑、形態(tài)；
[0014] 步驟4:測(cè)定所述納米遞藥系統(tǒng)的長(zhǎng)期穩(wěn)定性；
[0015] 步驟5:測(cè)定所述納米遞藥系統(tǒng)的血清穩(wěn)定性；
[0016] 步驟6:測(cè)定所述納米遞藥系統(tǒng)的體外藥物釋放特征；
[0017] 步驟7:測(cè)定所述納米遞藥系統(tǒng)對(duì)肺癌細(xì)胞的攝取；
[001引步驟8:巧憶所述納米遞藥系統(tǒng)對(duì)肺癌細(xì)胞的毒性；
[0019] 步驟9:測(cè)定巨隧細(xì)胞對(duì)所述納米遞藥系統(tǒng)的攝?。?br>[0020] 步驟10:測(cè)定所述納米遞藥系統(tǒng)對(duì)紅細(xì)胞膜的破壞作用；
[0021 ]步驟11:測(cè)定所述納米遞藥系統(tǒng)在大鼠體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間；
[0022] 步驟12:測(cè)定所述納米遞藥系統(tǒng)對(duì)肺癌腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。
[0023] 所述步驟2采用超聲方法包裹酸敏感高分子前藥，用G50葡聚糖凝膠柱分離純化納 米遞藥系統(tǒng)。
[0024] 本發(fā)明制備的紅細(xì)胞膜包裹的酸敏感高分子前藥納米遞藥系統(tǒng)的用途，其特征在 于，該納米遞藥系統(tǒng)用于制備能夠進(jìn)行長(zhǎng)循環(huán)、被動(dòng)祀向、運(yùn)送活性物質(zhì)的抗腫瘤藥物。
[0025] 本發(fā)明的遞藥系統(tǒng)具有W下特征:粒徑在IOOnm左右，呈球形；在憐酸緩沖液和血 清中均比較穩(wěn)定;在酸性環(huán)境下藥物釋放特性較好;在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中毒性明顯降低；巨隧細(xì)胞 對(duì)該系統(tǒng)的攝取明顯減少;該系統(tǒng)對(duì)紅細(xì)胞沒(méi)有破壞作用，可用于靜脈注射;該系統(tǒng)在血液 中的循環(huán)時(shí)間明顯比高分子長(zhǎng);該系統(tǒng)對(duì)肺癌腫瘤生長(zhǎng)有明顯抑制作用。
【附圖說(shuō)明】
[00%] 圖1為本發(fā)明RBCm/PGSC-PTX制備流程圖；
[0027] 圖2為本發(fā)明RBCm/PGSC-PTX NPs的粒徑圖和透射電鏡圖；
[00%]圖3為本發(fā)明RBCm/PGSC-PTX NPs的長(zhǎng)期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)和血清穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)圖；
[00巧]圖4為本發(fā)明RBCm/PGSC-PTX NPs在不同抑下藥物釋放對(duì)比圖；
[0030] 圖5為本發(fā)明RBCm/PGSC-PTX NPs的體外細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)圖；
[0031] 圖6為本發(fā)明RBCm/PGSC-PTX NPs的體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)圖；
[0032] 圖7為本發(fā)明RBCm/PGSC-PTX NPs的免疫原性試驗(yàn)圖；
[0033] 圖8為本發(fā)明RBCm/PGSC-PTX NPs的溶血性試驗(yàn)圖；
[0034] 圖9為本發(fā)明RBCm/PGSC-PTX NPs的長(zhǎng)循環(huán)試驗(yàn)圖；
[0035] 圖10為本發(fā)明RBCm/PGSC-PTX NPs的療效試驗(yàn)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 高分子前藥紫杉醇載藥量為32.8%。
[0037] 實(shí)施例1
[0038] (1)紅細(xì)胞膜囊泡的制備
[0039] 1)取20g左右重量的小鼠，腹腔注射0.2ml的2 %戊己比妥鋼溶液，待完全麻醉后， 剖開(kāi)劍突及W上部位，暴露屯、臟后，從左屯、室進(jìn)針，取用肝素鋼潤(rùn)洗過(guò)的注射器取血(大約 Iml)，取血后轉(zhuǎn)移至2ml含肝素鋼的EP管中；
[0040] 2)將全血放入離屯、機(jī)中離屯、，900g，20min，棄去上層清液，留下暗紅色沉淀，取沉 淀3倍體積的1沖BS放入，并均勻吹散，放入離屯、機(jī)離屯、2500g，15min.此為第一次洗涂，重復(fù) 操作立次；
[0041] 3)上述最后一次操作后，棄去上層清液，留下沉淀，取沉淀等量的1*PBS放入離屯、 管中吹散，取950ul的0.2mM的抓TA放入離屯、管混勻，待充分溶血后，加入50ul20沖BS，于 21000g，離屯、7min.此為第一次溶血洗涂重復(fù)操作五次；
[0042] 4)上述最后一次操作后，棄去上層清液，加入1mlO.2mM的抓TA重懸，即為紅細(xì)胞膜 懸浮液。
[0043] 5)將得到的紅細(xì)胞膜懸液在IOOW，59Hz條件下超聲5min，得到均勻的紅細(xì)胞膜囊 泡。
[0044] (2)紅細(xì)胞膜包裹酸敏感的高分子前藥納米系統(tǒng)的制備
[0045] 1)配制濃度為8mg/ml的高分子前藥納米粒；
[0046] 2)將配置好的上述高分子前藥納米粒與Iml全血中提取的紅細(xì)胞囊泡混合，在 100W，59化條件下超聲5min，得到紅細(xì)胞膜包裹酸敏感的高分子前藥納米系統(tǒng)；
[0047] 3)用G50葡聚糖凝膠柱分離純化上述納米系統(tǒng)，得到粒徑均一的紅細(xì)胞膜包裹高 分子前藥納米系統(tǒng)。
[004引實(shí)施例2
[0049]配置高分子載紫杉醇前藥（PGSC-PTX)和紅細(xì)胞包裹的高分子載紫杉醇前藥 (RBCm/PGSC-PTX) Img/ml，超聲5分鐘后靜置2分鐘，用馬爾文激光粒度儀測(cè)定其粒徑大小和 粒徑分布，圖2(A、B)顯示納米顆粒徑分布情況，PGSC-PTX和RBCm/PGSC-PTX兩種納米粒的平 均粒徑分別為50nm和IOOnm左右。
[00加]實(shí)施例3
[0051 ] PGSC-PTX和RBCm/PGSC-PTX的形態(tài)通過(guò)透射電子顯微鏡（TEM)來(lái)觀察，需用1 %的 憐鶴酸負(fù)染制備樣品，具體如下：（1)滴一滴樣品溶液于銅網(wǎng)上，（2)空氣中干燥約10分鐘， 用濾紙吸去多余的液體，（3)再滴一滴1%的憐鶴酸于銅網(wǎng)上，室溫干燥5分鐘后用濾紙吸去 多余的染液，（4)待樣品干燥后置于透射電鏡下觀察。圖2(C、D)為PGSC-PTX和RBCm/PGSC-PTX兩種納米粒的透射電鏡圖片，兩種納米粒形態(tài)均比較規(guī)則，呈球形。
[0化2] 實(shí)施例4
[0053] 將PGSC-PTX和RBCm/PGSC-PTX用PBS液配制成1 .Omg/ml，用動(dòng)態(tài)光散射儀(DLS)測(cè) 定粒徑大小和分散性指數(shù)(PDI)，每?jī)商鞙y(cè)定一次，連續(xù)測(cè)定兩周，考察納米粒子的長(zhǎng)期穩(wěn) 定性。結(jié)果如圖3(A)，兩種納米粒的穩(wěn)定性良好，放置半個(gè)月后粒徑無(wú)明顯變化(p〉0.05)。 [0054] 實(shí)施例5
[0055]將PGSC-PTX和RBCm/PGSC-PTX用 100%FBS配制成 1. Omg/ml，樣品置于37°C輕輕震 蕩，分別于不同時(shí)間點(diǎn)取樣在560nm條件下測(cè)定吸光值，每組重復(fù)測(cè)定S次，根據(jù)吸光值來(lái) 考察樣品的血清穩(wěn)定性。兩種納米粒的血清穩(wěn)定性如圖3(B)，在放置4小時(shí)后PGSC-PTX和 RBCm/PGSC