一種抗煙嘧黃隆除草劑的植物培育方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種抗煙嘧黃隆除草劑的植物培育方法。通過(guò)從加拿大引進(jìn)了野生青狗尾草群體中發(fā)現(xiàn)的抗煙嘧黃隆材料，并與國(guó)內(nèi)谷子雜交，用產(chǎn)生的YM15谷子種質(zhì)為材料克隆抗煙嘧黃隆基因(NiALS)進(jìn)行克隆，以克隆基因NiALS為模板設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)SpeI?SacI酶切后與XbaI?SacI酶切的pBI121連接獲得表達(dá)載體。葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草，經(jīng)卡那霉素篩選獲得再生植株。與野生型野草相比，NiALS轉(zhuǎn)基因煙草具有煙嘧黃隆抗性。采用本發(fā)明的抗煙嘧黃隆除草劑的植物培育方法，有效地提高了植物的生產(chǎn)力和品質(zhì)。
【專利說(shuō)明】
_種抗煙嘧黃隆除草劑的植物培育方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及本發(fā)明涉及植物育種領(lǐng)域，具體是一種抗煙嘧黃隆除草劑的植物培育 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 農(nóng)田雜草可導(dǎo)致農(nóng)作物的減產(chǎn)并降低作物的品質(zhì)。除草劑除草已成為當(dāng)今農(nóng)田有 效控制雜草，減少除草勞動(dòng)量，提高作物產(chǎn)量與質(zhì)量，發(fā)展農(nóng)業(yè)生產(chǎn)一項(xiàng)基本措施?？钩?劑育種工程也一直受到人們的廣泛重視，特別是對(duì)那些不具抗除草劑特性、不能用除草劑 除草的作物尤為重要。
[0003] 谷子抗旱耐瘠，是我國(guó)北方優(yōu)質(zhì)抗旱糧食作物。然而谷子為小粒作物，單粒頂土能 力差，需密植確保出苗，然后進(jìn)行人工間苗。另外，谷子對(duì)市場(chǎng)上銷售的除草劑均不敏感，谷 田除草一直依靠人工作業(yè)。這種落后的生產(chǎn)方式不適合現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的要求，成為制約谷子集 約化、規(guī)?；a(chǎn)的瓶頸難題。因此培育抗除草劑谷子品種具有重要意義。近年來(lái)，通過(guò)遠(yuǎn) 緣雜交育成的抗除草劑谷子品種，實(shí)現(xiàn)了谷田的化學(xué)除草;另通過(guò)選育抗、感拿捕凈的同型 姊妹系，二者按一定比例混合播種，利用二者對(duì)除草劑的抗性差異，苗期通過(guò)噴施拿捕凈同 步實(shí)現(xiàn)了谷子的化學(xué)間苗、化學(xué)除草?？钩輨┕茸拥呐嘤?jiǎn)化了谷子栽培、實(shí)現(xiàn)了谷田 的化學(xué)除草，使谷子集約化、規(guī)模化生產(chǎn)成為可能。目前應(yīng)用于抗除草劑谷子育種的主要是 拿捕凈和咪唑乙煙酸兩種類型。然而谷田雜草種類繁多，拿捕凈為單子葉雜草除草劑，對(duì)雙 子葉無(wú)效，除草不徹底;咪唑乙煙酸對(duì)單雙子葉都有效，但長(zhǎng)期使用單一除草劑具有使雜草 產(chǎn)生抗藥性的潛在風(fēng)險(xiǎn)。
[0004]挖掘和利用可用于谷子育種的新型除草劑抗性基因，對(duì)于拓寬谷子抗除草劑育 種、增加谷子除草劑抗性的多樣性是保障谷子化學(xué)除草持續(xù)有效和安全使用的一項(xiàng)重要措 施。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 對(duì)此，本發(fā)明通過(guò)從加拿大引進(jìn)的抗咪唑乙煙酸野生青狗尾草群體中篩選獲得的 抗煙嘧黃隆突變體為材料，并與國(guó)內(nèi)谷子雜交，用產(chǎn)生的YM15谷子種質(zhì)為材料克隆抗煙嘧 黃隆基因 MALS，并進(jìn)行轉(zhuǎn)化和檢測(cè)。采用本發(fā)明的抗煙嘧黃隆除草劑的植物培育方法，有 效地提高了植物的生產(chǎn)力和品質(zhì)。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0007] 一種抗煙嘧黃隆基因，其特征在于，由SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0: 2所示的核苷酸 序列組成。
[0008] 一種抗煙嘧黃隆基因在培育抗除草劑谷子中的應(yīng)用，其特征在于，該基因由SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列組成。
[0009] -種抗煙嘧黃隆除草劑的植物培育方法，其特征在于，包括如下步驟：
[0010] (1)抗煙嘧黃隆除草劑基因（NiALS)擴(kuò)增：
[0011] 引物序列FI: ACGAACGAGTGTGGCCTAAG;
[0012] R1：GTCAAAGAAAGGCAAGGGCG；
[0013] (2)植物表達(dá)載體構(gòu)建：
[0014] 以克隆基因 NiALS為模板設(shè)計(jì)引物，正向引物序列5端加 Spe頂每切位點(diǎn)，反向引物 序列5端加 Sac頂每切位點(diǎn)，序列為：
[0015] F2:GactagtACGAACGAGTGTGGCCTAAG，
[0016] R2：CgagctcGTCAAAGAAAGGCAAGGGCG,
[0017] PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)Spel-SacI酶切后與Xbal-SacI酶切的pBI121連接獲得表達(dá)載體， 命名為 pBI121-NiALS。
[0018] (3)植物轉(zhuǎn)化:葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化，經(jīng)卡那霉素篩選獲得再生植株。
[0019] 步驟（1)中，PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為：50yL,含 lOXbuffer 5yL、250ymol L-MNTP 各 4μ L、10mmol L-1 引物各4yL、PrimerStar HS高保真聚合酶lyL(TakaRa)、模板DNAlyL;反應(yīng)條件 為：98°C預(yù)變性5s;98°C變性1〇8,58°(：退火3〇8,72°(：延伸2111丨11，40個(gè)循環(huán)；最后72°(：延伸 10min〇
[0020] 步驟（2)中，PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為：50yL,含 lOXbuffer 5yL、250ymol L-MNTP 各 4μ L、10mmol L-1 引物各4yL、PrimerStar HS高保真聚合酶lyL(TakaRa)、模板DNAlyL;反應(yīng)條件 為：98°C預(yù)變性5s;98°C變性1〇8,58°(：退火3〇8,72°(：延伸2111丨11，40個(gè)循環(huán)；最后72°(：延伸 10min〇
[0021] 步驟(3)中，轉(zhuǎn)化方法如下：
[0022]表達(dá)載體質(zhì)粒pBI121-NiALS，通過(guò)電擊法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌AGL1中，用于煙草轉(zhuǎn)化； 剪取新鮮葉子70%乙醇漂洗lmin，10%NaC10消毒lOmin;切掉葉片葉脈和葉片邊緣，5-6個(gè) 外植體葉片，置于預(yù)培養(yǎng)基中（MS+O.lmgL-hAA+lmg L-1 6-BA)，光照下，預(yù)培養(yǎng)2天;預(yù)培養(yǎng) 2天后，取外植體置于提前準(zhǔn)備好的0D600 = 1.0的農(nóng)桿菌菌液中，輕輕晃動(dòng)，侵染3-5min;用 濾紙吸除殘留菌液后，置于新的預(yù)培養(yǎng)基中，避光共培養(yǎng)2天;2天后將外植體轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng) 基中（MS+O.lmg L-hAA+lmg L-1 6_BA+160mg L-himentin+lOOrng L-lKan);待抗性芽長(zhǎng)到 約lcm左右時(shí)，移到生根培養(yǎng)基上(MS+lOOmg L-lKan)，獲得轉(zhuǎn)基因再生植株。
[0023] -種檢測(cè)權(quán)利要求1所述抗煙嘧黃隆除草劑的植物的方法，其特征在于，包括如下 步驟：T 0代再生植株提取D N A，進(jìn)行P C R檢測(cè)：設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)引物F 4 : GCTCCATCACCAAGCACAAC，R4: CAGAGACAGTGGGTCGTCAC;電泳觀察，陽(yáng)性植株可擴(kuò)出 392bp大小 的電泳條帶，陰性植株無(wú)擴(kuò)增條帶。？〇?檢測(cè)的反應(yīng)體系2(^，含2\1^1(^、1〇111111〇11/1引 物各0.5yL、模板DNA lyL。反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4min;94°C變性40s，59°C退火40s，72°C延 伸2〇8,35個(gè)循環(huán)；最后72°(：延伸51^11。
[0024] -種抗煙嘧黃隆除草劑的基因檢測(cè)試劑盒，包括引物序列F4:
[0025] GCTCCATCACCAAGCACAAC，R4:CAGAGACAGTGGGTCGTCAC。
[0026]在一個(gè)實(shí)施例中，所述試劑盒還包括引物序列F1:
[0027] ACGAACGAGTGTGGCCTAAG；Rl：GTCAAAGAAAGGCAAGGGCG 〇
【附圖說(shuō)明】
[0028] 圖1是Ni ALS基因 PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖。
[0029] 圖2是本發(fā)明的pEASY-El-NiALS重組蛋白表達(dá)結(jié)果電泳圖。
[0030] 圖3是本發(fā)明的PBI121-NiALS表達(dá)載體構(gòu)建示意圖。
[0031] 圖4 NiALS轉(zhuǎn)化煙草及轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測(cè)電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0032]為了闡明本發(fā)明的技術(shù)方案及技術(shù)目的，下面結(jié)合附圖及【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明 做進(jìn)一步的介紹。
[0033]抗煙嘧黃隆谷子種質(zhì)YM15由本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)谷子與野生青狗尾草雜交獲得。轉(zhuǎn)基因 煙草受體W38、質(zhì)粒PBI121由本實(shí)驗(yàn)室保存。
[0034]基因克隆和生物信息學(xué)分析
[0035] 參考NCBI公布的豫谷 1 號(hào)ALS基因 （GenBank accession ηο· :ΧΜ_004952503·2)、抗 煙嘧黃隆突變狗尾草ALS基因 （GenBank accession no. :KF020517)和谷子基因組(http:// plants · ensembl · org/Setaria_italica)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增YM15中煙啼黃隆除草劑基因（NiALS)， 引物序列FI: ACGAACGAGTGTGGCCTAAG; R1: GTCAAAGAAAGGCAAGGGCG 〇
[0036] PCR反應(yīng)體系50yL,含lOXbuffer 5yL、250ymol L-MNTP各4yL、10mmol L-1 引物各 4yL、PrimerStar HS高保真聚合酶lyL(TakaRa)、模板DNA lyL。反應(yīng)條件為98°C預(yù)變性5s; 98°C變性10s,58°C退火30s,72°C延伸2min,40個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10min。
[0037] 用1.2%瓊脂糖凝膠，在5V cm-1電壓下電泳分離PCR產(chǎn)物，用0.01 %EB溶液染色 15min，用紫外成像儀照相。擴(kuò)增片段大小預(yù)計(jì)為2100bP<3PCR獲得了目的大小的片段(圖1)。 [0038] PCR產(chǎn)物與pEASY-Tl載體連接后，經(jīng)轉(zhuǎn)化，挑取陽(yáng)性克隆。送去測(cè)序。每個(gè)克隆測(cè)序 三次。獲得NiALS全長(zhǎng)序列。對(duì)該序列進(jìn)行0RF讀碼框預(yù)測(cè)，氨基酸預(yù)測(cè)。
[0039] PCR產(chǎn)物與T載體連接后，測(cè)序獲得NiALS序列（SEQ ID NOdhORF分析結(jié)果表明， 該序列包含1932bp的讀碼框(SEQ ID N0:2)，編碼643個(gè)氨基酸（SEQ ID N0:3)，分子量為 69KD〇
[0040] 表達(dá)載體構(gòu)建
[00411以克隆基因 NiALS為模板設(shè)計(jì)引物，構(gòu)建植物表達(dá)載體。正向引物序列5端加 Spel 酶切位點(diǎn)，反向引物序列5端加 SacI酶切位點(diǎn)，序列為:F2:GactagtACGAACGAGTGTGGCCTAAG， R2: CgagctcGTCAAAGAAAGGCAAGGGCGlCR反應(yīng)體系為：50yL，含 10 X buffer 5yL、250ymol L- ΜΝΤΡ各4yL、10mmol L-1 引物各4yL、PrimerStar HS高保真聚合酶lyL(TakaRa)、模板DNA 1μ L;反應(yīng)條件為:98°C預(yù)變性5s;98°C變性10s，58°C退火30s，72°C延伸2min，40個(gè)循環(huán);最后 72°C延伸lOmiruPCR產(chǎn)物經(jīng)Spel-Sad酶切后與Xbal-Sad酶切的pBI121連接獲得表達(dá)載 體，命名為 pBI121-NiALS。
[0042] 原核表達(dá)載體的構(gòu)建：以克隆基因?yàn)槟０?，F(xiàn)3 : CTCCCTTTCCGTGCCACTCG-3，R3 : AAGGGCGGCGCTCCCTGAAT為引物，PrimerStar HS高保真聚合酶，擴(kuò)增NiALS基因，PCR產(chǎn)物純 化后與PEASY-E1原核表達(dá)載體連接(全式金），連接體系按說(shuō)明書(shū)步驟。構(gòu)建載體命名為 pEASY-E卜NiALS。
[0043] 原核表達(dá)
[0044] IPTG誘導(dǎo)融合基因的表達(dá)。將鑒定正確的BL21(DE3)菌液在LB(含LB/Amp+)中預(yù)培 養(yǎng)過(guò)夜；按1: 50~1:100比例轉(zhuǎn)接過(guò)夜培養(yǎng)物到新鮮的LB液體培養(yǎng)液中（含LB/Amp + )， 250rpm，37 °C培養(yǎng)2~3h，使其0D600值達(dá)到Ο . 5-0.6左右；加入終濃度為ImM的IPTG進(jìn)行誘 導(dǎo)，230rpm，37 °C分別繼續(xù)培養(yǎng)2、4、6h，不加 IPTG誘導(dǎo)的樣品作為對(duì)照；在不同時(shí)間點(diǎn)收集 菌液，空白大腸桿菌對(duì)照在4h時(shí)收集菌液，8000rpm離心10min，棄上清。
[0045] 沉淀懸浮于lOOul lx SDS凝膠加樣緩沖液，100度加熱3min，室溫高速離心lmin， 冰上放置，待全部樣品處理完后電泳檢測(cè)。SDS-PAGE組分為12 %分離膠，5 %濃縮膠。120V， 電泳2h?？捡R斯亮藍(lán)染色檢測(cè)表達(dá)結(jié)果。如圖2所示。
[0046] NiALS轉(zhuǎn)基因煙草的獲得
[0047] NiALS插入到PBI121載體Xbal-Spel位點(diǎn)，獲得表達(dá)載體PBI121-MALS(圖3)。表達(dá) 載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌AGL1后，葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草，經(jīng)卡那霉素篩選獲得再生植株。
[0048] 具體方法如下：質(zhì)粒pBI121-NiALS，參照BI0-RAD電擊儀說(shuō)明書(shū)，將不同載體組合 通過(guò)電擊法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌AGL1中。用于煙草轉(zhuǎn)化:剪取新鮮葉子70%乙醇漂洗lmin，10% NaCIO消毒lOmin。切掉葉片葉脈和葉片邊緣，5-6個(gè)外植體葉片，置于預(yù)培養(yǎng)基中(MS+O.lmg L-lIAA+lmg L-l 6-BA)，光照下，預(yù)培養(yǎng)2天。預(yù)培養(yǎng)2天后，取外植體置于提前準(zhǔn)備好的 0D600 = 1.0的農(nóng)桿菌菌液中，輕輕晃動(dòng)，侵染3-5min;用濾紙吸除殘留菌液后，置于新的預(yù) 培養(yǎng)基中，避光共培養(yǎng)2天;2天后將外植體轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中（MS+O.lmg L-lIAA+lmg L-1 6_BA+160mg L-lTimentin+100mg L-lKan);待抗性芽長(zhǎng)到約lcm左右時(shí)，移到生根培養(yǎng)基上 (MS+100mg L-lKan)，獲得轉(zhuǎn)基因再生植株。
[0049] 轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)
[0050] PCR檢測(cè)TO代再生植株，陽(yáng)性植株可擴(kuò)出392bp大小的電泳條帶，陰性植株無(wú)擴(kuò)增 條帶，擴(kuò)增大小與預(yù)期一致，部分結(jié)果如圖4。
[0051 ] PCR檢測(cè)共獲得6棵陽(yáng)性植株。M: DL2000marker; P :PBI 121-NiALS質(zhì)粒對(duì)照;W:野生 型煙草對(duì)照；1，2，3，4，：PCR檢測(cè)陽(yáng)性植株，5:PCR檢測(cè)隱性植株。
[0052] 再生植株提取D N A，進(jìn)行P C R檢測(cè)，設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)引物F 4 : GCTCCATCACCAAGCACAAC，R4: CAGAGACAGTGGGTCGTCAC。用 2 X EasyTaq PCR SuperMiX (全式 金)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系20yL，含2 XMixlOyL、10mmolL-l引物各0.5yL、模板DNAlyL。反應(yīng) 條件為94°C預(yù)變性4min;94°C變性40s，59°C退火40s，72°C延伸2〇8,35個(gè)循環(huán)；最后72°(：延 伸5min。擴(kuò)增PCR產(chǎn)物大小為392bp。
[0053] 轉(zhuǎn)基因煙草的抗除草劑驗(yàn)證
[0054]將上述鑒定陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因煙草植株，在苗期6-7片葉子時(shí)，噴施濃度為0.25% (V/ V)的商品化煙嘧黃隆除草劑(玉京香），該濃度為田間正常用藥量，野生型煙草為對(duì)照。12天 后觀察其生長(zhǎng)發(fā)育情況，結(jié)果表明噴施除草劑的野生型植株生長(zhǎng)受到抑制，葉片不同程度 發(fā)黃，萎蔫。而轉(zhuǎn)基因植株可正常生長(zhǎng)，具有煙嘧黃隆抗性。說(shuō)明克隆的NiALS基因在煙草植 株內(nèi)可正常表達(dá)，對(duì)煙嘧黃隆除草劑具有抗性。
[0055]本發(fā)明從遠(yuǎn)緣雜交育成的抗煙嘧黃隆谷子種質(zhì)YM15中克隆了該抗性基因命名為 NiALS，基因全長(zhǎng)1932bp，編碼643個(gè)氨基酸。NiALS序列在1877位處存在G-A的單堿基突變， 導(dǎo)致626位異亮氨基酸替換絲氨酸，可能是其產(chǎn)生煙嘧黃隆抗性的原因。進(jìn)一步對(duì)該基因進(jìn) 行蛋白表達(dá)和功能驗(yàn)證，結(jié)果表明該基因可正常表達(dá)出目的大小的蛋白，與野生型野草相 比，NiALS轉(zhuǎn)基因煙草具有煙嘧黃隆抗性。從分子水平水闡釋該基因的功能，為該基因在谷 子抗除草劑育種及在其他作物中通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗除草品種奠定基礎(chǔ)。
[0056]以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技 術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修 改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種抗煙嘧黃隆基因，其特征在于，由SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2所示的核苷酸序 列組成。2. -種抗煙嘧黃隆基因在培育抗除草劑谷子中的應(yīng)用，其特征在于，該基因由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列組成。3. -種抗煙嘧黃隆除草劑的植物培育方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 抗煙嘧黃隆除草劑基因(NiALS)擴(kuò)增： 引物序列FI :ACGAACGAGTGTGGCCTAAG; Rl：GTCAAAGAAAGGCAAGGGCG； (2) 植物表達(dá)載體構(gòu)建： 以克隆基因 NiALS為模板設(shè)計(jì)引物，正向引物序列5端加 Spel酶切位點(diǎn)，反向引物序列5 端加 Sac頂每切位點(diǎn)，序列為： F2:GactagtACGAACGAGTGTGGCCTAAG， R2：CgagctcGTCAAAGAAAGGCAAGGGCG, PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)Spel-Sac頂每切后與Xbal-SacI酶切的pBI121連接獲得表達(dá)載體，命名 為pBI121-NiALS。 (3) 植物轉(zhuǎn)化:采用葉盤(pán)法，經(jīng)卡那霉素篩選獲得再生植株。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗煙嘧黃隆除草劑的植物培育方法，其特征在于， 步驟（1)中，PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為：50yL,含 lOXbuffer 5yL、250ymol L-MNTP 各 4yL、 lOmmol L-1引物各4yL、PrimerStar HS高保真聚合酶lyL(TakaRa)、模板DNA lyL;反應(yīng)條件 為：98°C預(yù)變性5s;98°C變性1〇8,58°(：退火3〇8,72°(：延伸2111丨11，40個(gè)循環(huán) ；最后72°(：延伸 10min〇5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗煙嘧黃隆除草劑的植物培育方法，其特征在于， 步驟（2)中，PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為：50yL,含 lOXbuffer 5yL、250ymol L-MNTP 各 4yL、 lOmmol L-1引物各4yL、PrimerStar HS高保真聚合酶lyL(TakaRa)、模板DNA lyL;反應(yīng)條件 為：98°C預(yù)變性5s;98°C變性1〇8,58°(：退火3〇8,72°(：延伸2111丨11，40個(gè)循環(huán) ；最后72°(：延伸 10min〇6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗煙嘧黃隆除草劑的植物培育方法，其特征在于， 步驟(3)中，轉(zhuǎn)化方法如下： 表達(dá)載體質(zhì)粒pBI121-NiALS，通過(guò)電擊法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌AGL1中，用于煙草轉(zhuǎn)化； 剪取新鮮葉子70%乙醇漂洗111^11，10%似(：10消毒101^11;切掉葉片葉脈和葉片邊緣，5-6個(gè)外植體葉片，置于預(yù)培養(yǎng)基中（MS+O.lmg L-hAA+lmg L-1 6-BA)，光照下，預(yù)培養(yǎng)2天； 預(yù)培養(yǎng)2天后，取外植體置于提前準(zhǔn)備好的0D600 = 1.0的農(nóng)桿菌菌液中，輕輕晃動(dòng)，侵 染3-5min;用濾紙吸除殘留菌液后，置于新的預(yù)培養(yǎng)基中，避光共培養(yǎng)2天； 2天后將外植體轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中（MS+O.lmg L-UAA+lmg L-1 6-BA+160mg L- ^imentin+lOOmg L-lKan)； 待抗性芽長(zhǎng)到約lcm左右時(shí)，移到生根培養(yǎng)基上(MS+lOOmg L-lKan)，獲得轉(zhuǎn)基因再生 植株。7. -種檢測(cè)權(quán)利要求3所述抗煙嘧黃隆除草劑的植物的方法，其特征在于，包括如下步 驟： T 0代再生植株提取D N A，進(jìn)行P C R檢測(cè)：設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)引物F 4 : GCTCCATCACCAAGCACAAC，R4:CAGAGACAGTGGGTCGTCAC; 電泳觀察，陽(yáng)性植株可擴(kuò)出392bp大小的電泳條帶，陰性植株無(wú)擴(kuò)增條帶。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗煙嘧黃隆除草劑的植物培育方法，其特征在于： PCR檢測(cè)的反應(yīng)體系20yL,含2XMix 10yL、10mmol L-1引物各0.5yL、模板DNA lyL。反應(yīng) 條件為94°C預(yù)變性4min;94°C變性40s，59°C退火40s，72°C延伸2〇8,35個(gè)循環(huán)；最后72°(：延 伸5min〇
【文檔編號(hào)】C12N15/29GK105837673SQ201610436009
【公開(kāi)日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年6月17日
【發(fā)明人】程汝宏, 王根平, 張婷, 師志剛
【申請(qǐng)人】河北省農(nóng)林科學(xué)院谷子研究所