Snp標(biāo)記及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了SNP標(biāo)記及其應(yīng)用。其中，該SNP標(biāo)記為SEQ ID NO：1所示核苷酸序列自5’端起第31位堿基A或G。本發(fā)明的SNP標(biāo)記與豬的繁殖性狀緊密相關(guān)，能夠有效用于豬的分子標(biāo)記輔助育種。
【專利說明】
SNP標(biāo)記及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及SNP標(biāo)記及其應(yīng)用。具體地，本發(fā)明涉及豬繁殖性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記， 一組用于檢測(cè)該SNP標(biāo)記的引物和試劑盒，前述SNP標(biāo)記、引物、試劑盒在豬選育中的用途， 以及檢測(cè)豬繁殖性狀的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國是豬肉消費(fèi)的第一大國，然而，豬的養(yǎng)殖繁育技術(shù)還不夠成熟，規(guī)?；B(yǎng)殖生 產(chǎn)效益低，無法滿足國民對(duì)豬肉產(chǎn)品的需求。因而，目前提高豬養(yǎng)殖技術(shù)，擴(kuò)大豬養(yǎng)殖規(guī)模， 迅速發(fā)展豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)，對(duì)于促進(jìn)養(yǎng)殖戶增收，滿足國民對(duì)豬肉產(chǎn)品需求，優(yōu)化豬養(yǎng)殖業(yè)結(jié)構(gòu) 有重要意義。其中，繁殖性能是豬養(yǎng)殖的一個(gè)重要經(jīng)濟(jì)性狀，其是決定規(guī)?；B(yǎng)豬生產(chǎn)效益 的關(guān)鍵因素之一。即及時(shí)、早期選擇繁殖性狀優(yōu)良的豬進(jìn)行育種、養(yǎng)殖，對(duì)豬育種和實(shí)際生 產(chǎn)來說非常重要。目前雖然傳統(tǒng)數(shù)量遺傳學(xué)在指導(dǎo)家畜育種中起到了重要作用，但是繁殖 性狀遺傳力低、性狀表現(xiàn)晚，通過常規(guī)選擇難以有所進(jìn)展。
[0003] 分子育種，即分子標(biāo)記輔助選擇育種，是指利用DNA分子標(biāo)記對(duì)育種材料進(jìn)行選 擇，綜合改良選育物種的重要經(jīng)濟(jì)性狀，是傳統(tǒng)遺傳育種與現(xiàn)代分子生物學(xué)有機(jī)結(jié)合的育 種方法。目前，針對(duì)繁殖性狀優(yōu)良的豬的選育，人們希望通過尋找影響繁殖性能的主效基 因，進(jìn)而篩選獲得與繁殖性狀密切相關(guān)的分子標(biāo)記輔助育種，以便實(shí)現(xiàn)早期選種、提高育種 準(zhǔn)確性，并有效加快育種進(jìn)展，提高豬的繁殖性能，獲得較大的經(jīng)濟(jì)效益。
[0004] 然而，現(xiàn)階段能夠有效用于豬育種的繁殖性狀相關(guān)的分子標(biāo)記仍有待挖掘。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的 在于提出一種與豬繁殖性狀相關(guān)，能夠有效用于豬選育的SNP標(biāo)記。
[0006] 其中，SNP (single nucleotide polymorphism, SNP，即單核苷酸多態(tài)性）是 1996 年由美國麻省理工學(xué)院的人類基因組研究中心學(xué)者Lander提出的一類分子遺傳標(biāo)記，主 要是指基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNP表現(xiàn)出的多態(tài)性 僅涉及到單個(gè)堿基的變異，表現(xiàn)是有轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失等。
[0007] 需要說明的是，本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：
[0008] 發(fā)明人利用候選基因法，選取可能與繁殖性狀相關(guān)的基因，通過NCBI的SNP數(shù) 據(jù)庫（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/snp/)，調(diào)取了這些基因相關(guān)的SNP位點(diǎn)，然后利用 Blast 方法，在 ensembl 數(shù)據(jù)庫中（http: //asia. ensembl. org/Multi/Tools/Blast ? db = core)獲取SNP位點(diǎn)周圍lOOObp的核苷酸序列，并設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，采用飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)， 以大白豬、長白豬、杜洛克豬共338頭的基因組DNA為樣本，直接檢測(cè)這些SNP的基因型數(shù) 據(jù)；并分析了這些SNP的基因型與豬繁殖性狀的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，豬17號(hào)染色體上BMP2 基因上的一個(gè)SNP - rs342665431 (即SEQ ID N0 :1所示核苷酸序列自5'端起第31位堿基 A或G)與豬的繁殖性能顯著相關(guān)。
[0009] 為此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種豬繁殖性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記。 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該SNP標(biāo)記為SEQ ID N0 :1所示核苷酸序列自5'端起第31位堿 基A或G。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，SEQ ID N0:1所示核苷酸序列如下：TGACAGGCATCTCC TTCTACTGAATCAGGcjA Cj|TCTTCATATTTAAGTTTTGTGTGGGGACCATTTCCAACTGA A(SEQ ID NO ：1)〇
[0010] 需要說明的是，本文中所采用的表達(dá)方式"豬繁殖性狀"主要以豬的總產(chǎn)仔數(shù)，活 仔數(shù)和斷奶頭數(shù)來衡量。
[0011] 另外，如前所述，上述SNP標(biāo)記位于豬17號(hào)染色體的BMP2基因上。BMP基因家族 是一類骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因家族，最初能誘導(dǎo)軟骨的合成，后期能促進(jìn)骨組織的合成。到 目前為止，已有30多種BMP基因被克隆，除BMP1是蛋白酶外，其余都屬于轉(zhuǎn)移生長因子 0 (transforming growth factor-0，TGF0)超家族成員。除骨發(fā)育以外，BMP家族與多個(gè) 生物學(xué)過程相關(guān)，包括繁殖系統(tǒng)的發(fā)育與生理功能，一些基因甚至已被鑒定與家畜動(dòng)物繁 殖性能相關(guān)，如BMP15。BMP15在卵母細(xì)胞中表達(dá)，該基因可能涉及到卵泡細(xì)胞增殖、分化的 調(diào)節(jié)，其突變或失活可能影響動(dòng)物的繁殖性狀。2000年Galloway SM等發(fā)現(xiàn)BMP15基因?qū)?Cambridge、Inverdale、Belclare等品種綿羊高繁殖力有顯著的影響。BMP2基因是BMP基 因家族一員，該基因的表達(dá)對(duì)于成骨細(xì)胞分化是必不可少的，已有文獻(xiàn)證明其與豬的生長 性能相關(guān)。然而，BMP2基因與豬繁殖性能的關(guān)系還未見報(bào)道。
[0012] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，該SNP標(biāo)記的位點(diǎn)處基因型為AG的豬繁殖能力顯著高于此處基因型 為純合AA的豬，而低于此處基因型為純合GG的豬。進(jìn)而，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，通過檢測(cè) 豬的上述SNP，能夠有效地確定其繁殖性狀，具體地，如前所述，該SNP位點(diǎn)為純合GG的豬繁 殖性能顯著優(yōu)于此處基因型為AG的豬，而該SNP位點(diǎn)為AG的豬繁殖性能顯著優(yōu)于此處基 因型為純合AA的豬，從而當(dāng)該SNP位點(diǎn)的基因型為GG時(shí)，能夠確定待測(cè)豬屬于繁殖性能非 常好的個(gè)體；當(dāng)該SNP位點(diǎn)的基因型為AG時(shí)，能夠確定待測(cè)豬的繁殖性能一般；而當(dāng)該SNP 位點(diǎn)的基因型為AA時(shí)，能夠確定待測(cè)豬的繁殖性能較差。由此，發(fā)明人確定，本發(fā)明的SNP 標(biāo)記與豬的繁殖性狀緊密相關(guān)，能夠有效用于豬的分子標(biāo)記輔助育種。進(jìn)而能夠根據(jù)實(shí)際 育種需求早日選擇具有相應(yīng)繁殖性能的豬育種材料，即對(duì)育種材料進(jìn)行早期選擇，進(jìn)而能 夠有效提高育種的效率和準(zhǔn)確性，提高豬繁殖群體的遺傳水平，從而能夠準(zhǔn)確、高效地選育 出豬優(yōu)良品種，提高養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。此外，根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，利用本發(fā)明的 SNP標(biāo)記進(jìn)行豬分子標(biāo)記輔助育種，具有早期篩選、節(jié)省時(shí)間、成本低廉、準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一組用于檢測(cè)前面所述的本發(fā)明的SNP 標(biāo)記的引物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該組引物具有SEQ ID N0 :2-4所示的核苷酸序列，具 體如下：
[0014] 5' -ACGTTGGATGAAGTAGCCTACCTTCTTGAG-3r (SEQ ID NO :2)，其中橫線標(biāo)注序列 為該引物攜帶的10個(gè)堿基標(biāo)簽；
[0015] 5' -ACGTTGGATGGCTTTTTGTCCACTCAGAGC-3r (SEQ ID NO :3)，其中橫線標(biāo)注序列 為該引物攜帶的10個(gè)堿基標(biāo)簽；
[0016] 5' -CACACAAAACTTAAATATGAAGA-3r (SEQ ID NO ：4)〇
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的上述引物具有非常好的特異性，利用本發(fā)明的引 物能夠準(zhǔn)確有效地對(duì)待測(cè)豬的上述與繁殖性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記所在的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 進(jìn)而通過測(cè)序或飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)能夠有效實(shí)現(xiàn)對(duì)該SNP標(biāo)記的檢測(cè)，確定待測(cè)豬該SNP 標(biāo)記位點(diǎn)的基因型，進(jìn)而能夠有效確定待測(cè)豬的繁殖性狀。具體地，利用SEQ ID NO :2-3所 示的引物將待測(cè)豬的基因組DNA進(jìn)行第一 PCR擴(kuò)增，然后利用SEQ ID N0:4所示的延伸引 物對(duì)第一 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行第二PCR擴(kuò)增，其中SEQ ID NO :4所示的延伸引物可以識(shí)別該 SNP標(biāo)記位點(diǎn)，向后延伸1個(gè)堿基（ddntp)終止，這樣不同基因型均可擴(kuò)增出來，利用飛行時(shí) 間質(zhì)譜檢測(cè)第二擴(kuò)增產(chǎn)物即可容易地區(qū)分該SNP標(biāo)記位點(diǎn)處任意2個(gè)堿基的區(qū)別，從而實(shí) 現(xiàn)SNP基因分型。進(jìn)一步，該SNP標(biāo)記的AG基因型個(gè)體的繁殖能力顯著高于AA基因型個(gè) 體，而低于GG基因型個(gè)體。從而當(dāng)該SNP位點(diǎn)的基因型為GG時(shí)，能夠確定待測(cè)豬屬于繁殖 性能非常好的個(gè)體；當(dāng)該SNP位點(diǎn)的基因型為AG時(shí)，能夠確定待測(cè)豬的繁殖性能一般；而 當(dāng)該SNP位點(diǎn)的基因型為AA時(shí)，能夠確定待測(cè)豬的繁殖性能較差。由此，用于檢測(cè)前面所 述的本發(fā)明的SNP標(biāo)記的一組引物，能夠有效用于豬的分子標(biāo)記輔助育種，進(jìn)而能夠輔助 早期實(shí)現(xiàn)短時(shí)間、低成本、高準(zhǔn)確性地選育豬優(yōu)良品種。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)前面所述的SNP標(biāo)記的試 劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒包含：前面所述的用于檢測(cè)本發(fā)明的SNP標(biāo)記的引 物。即本發(fā)明的試劑盒中包含具有SEQ ID N0 :2-4所示的核苷酸序列的引物。根據(jù)本發(fā)明 的實(shí)施例，利用本發(fā)明的試劑盒中所包含的引物，能夠有效實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)豬的上述與繁殖性 狀相關(guān)的SNP標(biāo)記的多態(tài)性檢測(cè)，確定待測(cè)豬該SNP標(biāo)記位點(diǎn)的基因型，進(jìn)而能夠有效確定 待測(cè)豬的繁殖性狀。具體地，SNP標(biāo)記的AG基因型個(gè)體的繁殖能力顯著高于AA基因型個(gè) 體，而低于GG基因型個(gè)體。從而當(dāng)該SNP位點(diǎn)的基因型為GG時(shí)，能夠確定待測(cè)豬屬于繁殖 性能非常好的個(gè)體；當(dāng)該SNP位點(diǎn)的基因型為AG時(shí)，能夠確定待測(cè)豬的繁殖性能一般；而 當(dāng)該SNP位點(diǎn)的基因型為AA時(shí)，能夠確定待測(cè)豬的繁殖性能較差。由此，本發(fā)明的用于檢 測(cè)前面所述的本發(fā)明的SNP標(biāo)記的試劑盒，能夠有效用于豬的分子標(biāo)記輔助育種，進(jìn)而能 夠輔助早期實(shí)現(xiàn)短時(shí)間、低成本、高準(zhǔn)確性地選育豬優(yōu)良品種。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明還提供了前面所述的本發(fā)明的SNP標(biāo)記、引物或 試劑盒，在豬選育中的用途。如前所述，通過能夠用于檢測(cè)本發(fā)明的與豬繁殖性狀相關(guān)的 SNP標(biāo)記的試劑例如前述的一組引物或包含該組引物的試劑盒等，能夠有效地檢測(cè)確定待 測(cè)豬的上述SNP標(biāo)記的基因型，進(jìn)而基于獲得的基因型能夠有效確定待測(cè)豬的繁殖性狀， 從而能夠有效輔助豬選育。
[0020] 進(jìn)而，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)豬繁殖性狀的方法。根據(jù) 本發(fā)明的實(shí)施例，該方法通過對(duì)待測(cè)豬進(jìn)行前面所述的SNP標(biāo)記的檢測(cè)，確定所述待測(cè)豬 的繁殖性狀。具體地，可以通過能夠用于檢測(cè)本發(fā)明的與豬繁殖性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記的試 劑例如前述的一組引物或包含該組引物的試劑盒等，對(duì)待測(cè)豬進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序或飛行 時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)，以便檢測(cè)確定待測(cè)豬的上述SNP標(biāo)記的基因型，進(jìn)而基于獲得的基因型能 夠有效確定待測(cè)豬的繁殖性狀。其中，如前所述，SNP標(biāo)記的AG基因型個(gè)體的繁殖能力顯 著高于AA基因型個(gè)體，而低于GG基因型個(gè)體。從而當(dāng)該SNP位點(diǎn)的基因型為GG時(shí)，能夠 確定待測(cè)豬屬于繁殖性能非常好的個(gè)體；當(dāng)該SNP位點(diǎn)的基因型為AG時(shí)，能夠確定待測(cè)豬 的繁殖性能一般；而當(dāng)該SNP位點(diǎn)的基因型為AA時(shí)，能夠確定待測(cè)豬的繁殖性能較差。由 此，利用本發(fā)明的檢測(cè)豬繁殖性狀的方法，能夠快速、高效、準(zhǔn)確地檢測(cè)豬繁殖性狀，進(jìn)而該 方法能夠有效用于豬的分子標(biāo)記輔助育種，從而能夠輔助早期實(shí)現(xiàn)短時(shí)間、低成本、高準(zhǔn)確 性地選育豬優(yōu)良品種。
[0021] 另外，根據(jù)本發(fā)明上述實(shí)施例的檢測(cè)豬繁殖性狀的方法還可以具有如下附加的技 術(shù)特征：
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)待測(cè)豬進(jìn)行SNP標(biāo)記檢測(cè)的方法不受特別限制。測(cè)序、 單鏈構(gòu)象多態(tài)性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR single strand conformation polymorphism， PCR-SSCP)、限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR-restriTCion fragment length polymorphism，PCR-RFLP)及飛行時(shí)間質(zhì)譜等技術(shù)均可以實(shí)現(xiàn)SNP的檢測(cè)。其中，飛行時(shí)間 質(zhì)譜是一種準(zhǔn)確性高、靈活性強(qiáng)，步驟簡(jiǎn)單、操作方便、檢測(cè)周期短的檢測(cè)技術(shù)。只需在SNP 位點(diǎn)的兩側(cè)設(shè)計(jì)一對(duì)引物，擴(kuò)增目的片段，再用延伸引物緊鄰SNP位點(diǎn)匹配，單堿基延伸 SNP位點(diǎn)，之后利用飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（Sequenom公司質(zhì)譜儀MT09)即可直接檢測(cè)該SNP位 點(diǎn)的基因型。因而，本發(fā)明采用飛行時(shí)間質(zhì)譜法進(jìn)行SNP標(biāo)記檢測(cè)。根據(jù)本發(fā)明的一些具 體示例，通過對(duì)待測(cè)豬進(jìn)行前面所述的SNP標(biāo)記的檢測(cè)，確定所述待測(cè)豬的繁殖性狀，進(jìn)一 步包括：提取待測(cè)豬的基因組DNA ;利用SEQ ID N0 :2-3所示的引物，將所述待測(cè)豬的基因 組DNA進(jìn)行第一 PCR擴(kuò)增，以便獲得第一 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；利用延伸引物對(duì)所述第一 PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物進(jìn)行第二PCR擴(kuò)增，以便獲得第二PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其中所述延伸引物具有SEQ ID N0 :4 所示的核苷酸序列：CACACAAAACTTAAATATGAAG(SEQ ID N0:4);對(duì)所述第二PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn) 行飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)，以便確定所述待測(cè)豬的所述SNP標(biāo)記的基因型；以及基于所述待測(cè) 豬的所述SNP標(biāo)記的基因型，確定所述待測(cè)豬的繁殖性狀。由此，能夠有效提尚檢測(cè)豬繁殖 性狀的效率。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，提取待測(cè)豬的基因組DNA的方法不受特別限制，可以采用 任何已知的基因組DNA提取方法或試劑盒進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，采用常規(guī)酚 氯仿方法抽提待測(cè)豬的基因組DNA。由此，能夠有效獲得質(zhì)量好、純度高的基因組DNA，便于 后續(xù)步驟進(jìn)行。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述SNP標(biāo)記的AG基因型個(gè)體的繁殖能力顯著高于AA基 因型個(gè)體，而低于GG基因型個(gè)體。即本發(fā)明前面所述的SNP標(biāo)記與豬的繁殖性狀緊密相 關(guān)。由此，基于確定的待測(cè)豬的該SNP標(biāo)記的基因型，能夠準(zhǔn)確有效地確定待測(cè)豬的繁殖性 狀，例如當(dāng)該SNP位點(diǎn)的基因型為GG時(shí)，能夠確定待測(cè)豬屬于繁殖性能非常好的個(gè)體；當(dāng)該 SNP位點(diǎn)的基因型為AG時(shí)，能夠確定待測(cè)豬的繁殖性能一般；而當(dāng)該SNP位點(diǎn)的基因型為 AA時(shí)，能夠確定待測(cè)豬的繁殖性能較差。進(jìn)而本發(fā)明的方法能夠有效用于豬的分子標(biāo)記輔 助育種，從而能夠輔助早期實(shí)現(xiàn)短時(shí)間、低成本、高準(zhǔn)確性地選育豬優(yōu)良品種。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用質(zhì)譜儀進(jìn)行所述飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)。優(yōu)選地，所述飛行 時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)是利用Sequenom公司質(zhì)譜儀MT09進(jìn)行的。由此，能夠快速、準(zhǔn)確地確定待測(cè) 豬的目標(biāo)SNP標(biāo)記的基因型，進(jìn)而能夠有效確定待測(cè)豬的繁殖性狀，從而能夠?yàn)樨i的優(yōu)良 品種選育提供科學(xué)依據(jù)。
[0026] 需要說明的是，本發(fā)明的與豬繁殖相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0027] (1)本發(fā)明提供的SNP標(biāo)記不受豬的品種、年齡等限制，可用于豬的早期選育，可 顯著促進(jìn)豬的育種進(jìn)程；
[0028] (2)檢測(cè)豬如SEQ ID N0 :1所示自5'端起第31位SNP位點(diǎn)的方法，準(zhǔn)確可靠，操 作方便；
[0029] (3)豬如SEQ ID NO. 1所示自5'端起第31位的SNP位點(diǎn)的檢出，為豬繁殖性狀的 標(biāo)記輔助選擇提供了科學(xué)依據(jù)。
[0030] 本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變 得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。
【附圖說明】
[0031] 本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變 得明顯和容易理解，其中：
[0032] 圖1-3依次顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，本發(fā)明的SNP標(biāo)記位點(diǎn)處AA、AG和GG 三種基因型的飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)峰圖。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。下面通過參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，僅 用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0034] 實(shí)施例1
[0035] 1、豬繁殖相關(guān)SNP標(biāo)記的檢測(cè)
[0036] 發(fā)明人利用候選基因法，選取可能與繁殖性狀相關(guān)的基因，通過NCBI的SNP數(shù) 據(jù)庫（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/snp/)，調(diào)取了這些基因相關(guān)的SNP位點(diǎn)，然后利用 Blast 方法，在 ensembl 數(shù)據(jù)庫中（http: //asia. ensembl. org/Multi/Tools/Blast ? db = core)獲取SNP位點(diǎn)周圍lOOObp的核苷酸序列，并設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，采用飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)， 以大白豬、長白豬、杜洛克豬共338頭的基因組DNA為樣本，直接檢測(cè)這些SNP的基因型數(shù) 據(jù)；并分析了這些SNP的基因型與豬繁殖性狀的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，豬17號(hào)染色體上BMP2 基因上的一個(gè)SNP - rs342665431 (即SEQ ID N0 :1所示核苷酸序列自5'端起第31位堿基 A或G)與豬的繁殖性能顯著相關(guān)。具體如下：
[0037] 首先，以豬BMP2的包含SNP - rs342665431的部分序列為依據(jù)，在ensembl數(shù)據(jù) 庫中（http://asia.ensembl.org/Multi/Tools/Blast ? db = core)獲取 SNP 位點(diǎn)周圍 lOOObp的核苷酸序列，以獲取的lOOObp序列為模板設(shè)計(jì)引物，引物序列如下：
[0038] lst-PCRP ：5r -ACGTTGGATGAAGTAGCCTACCTTCTTGAG-3r (SEQ ID NO :2)，其中橫 線標(biāo)注序列為該引物攜帶的10個(gè)喊基標(biāo)簽；
[0039] 2nd-PCRP:5' -ACGTTGGATGGCTTTTTGTCCACTCAGAGC-3r (SEQ ID NO :3)，其中橫 線標(biāo)注序列為該引物攜帶的10個(gè)喊基標(biāo)簽；
[0040] UEP-PCRP：5, -CACACAAAACTTAAATATGAAGA-3r (SEQ ID NO ：4) 〇
[0041] 接著，分別以大白豬、長白豬、杜洛克豬共338頭的基因組DNA為模板（SNPs檢測(cè) 的群體和樣品數(shù)見表5)，以lst-PCRP和2nd-PCRP為引物進(jìn)行第一 PCR擴(kuò)增，以便獲得第一 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其中，模板DNA為50ng，第一 PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系見表1，反應(yīng)程序見表2 :
[0042] 表1第一 PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系
[0043]
[0044] 表2.第一 PCR擴(kuò)增的程序：
[0045] 94。(：，2 分
[0046] 94°C, 20 秒卩 56°C, 30秒40個(gè)循環(huán) 72°C, 60 秒 j
[0047] 72。。，5 分
[0048] 12。(：，保存。
[0049] 第一 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物片段序列如 SEQ ID N0 :5 所示(ACGTTGGATGTGACAGGCATC TCCTTCTACTGAATCAGGC '!\AKj\ TCTTCATATTTAAGTTTTGTGTGGGGACCATTTCCAAC TGAACATCCAACGT)，長 93bp。
[0050] 接下來，利用AP (Alkaline Phosphatse，堿性磷酸酶，用于純化PCR產(chǎn)物）將第一 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中未反應(yīng)dNTP消化后，對(duì)第一 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行第二PCR擴(kuò)增，即用延伸引物 UEP-PCRP緊鄰SNP位點(diǎn)匹配，單堿基延伸SNP位點(diǎn)，以便獲得第二PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。其中，第 二PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系見表3 ;第二PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序見表4。
[0051] 表3.第二PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系
[0052]
[0053] 表4?第二PCR擴(kuò)增的程序：
[0054] 94°C，2 分
[0055] 941, 20 秒〕 5(TC，30秒卜35個(gè)循環(huán) 72SC, 20粆 j
[0056] 72°C，5 分
[0057] 12°C，保存。
[0058] 然后，利用飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（Sequenom公司質(zhì)譜儀MT09)對(duì)上述第二PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物進(jìn)行SNP多態(tài)性檢測(cè)，各基因型的代表性檢測(cè)結(jié)果見圖1-3。其中，圖1為本發(fā)明的SNP 標(biāo)記位點(diǎn)處AA基因型的飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)峰圖，圖2為本發(fā)明的SNP標(biāo)記位點(diǎn)處AG基因 型的飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)峰圖，圖3為本發(fā)明的SNP標(biāo)記位點(diǎn)處GG基因型的飛行時(shí)間質(zhì)譜 檢測(cè)峰圖。結(jié)果顯示在各第二擴(kuò)增產(chǎn)物中均包含該突變位點(diǎn)，即各第二擴(kuò)增產(chǎn)物的SEQ ID NO :1所示核苷酸序列自5'端起第31位堿基A或G。由此，表明上述SNP標(biāo)記與豬的繁殖 性狀顯著相關(guān)。
[0059] 由此，獲得的3個(gè)豬品種的338個(gè)樣本的基因型，然后對(duì)基因型檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì) 分析，分析結(jié)果如下表6所示。由表6確定了 BMP2多態(tài)性在3個(gè)豬品種中的分布情況。
[0060] 表5. SNPs檢測(cè)的群體和樣品數(shù)
[0061]
[0062] 表6. BMP2多態(tài)性在3個(gè)豬品種中的分布
[0064] 注：Df = 2, x 2= 5. 991，p>0. 05哈代溫伯格檢驗(yàn)平衡。
[0065] 2、豬不同基因型與其繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析
[0066] 試驗(yàn)豬群：該研究有3種國外豬品種共338頭，即大白169頭，長白96頭，杜洛克 73頭（見表5)。
[0067] 具體方法如下：
[0068] 首先，對(duì)該338頭豬的繁殖性狀相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行記錄，包括初配日齡、受胎率、分娩 率、總產(chǎn)仔數(shù)、活仔數(shù)、胎產(chǎn)總仔、胎產(chǎn)活仔、胎產(chǎn)死胎、胎木乃伊、斷奶頭數(shù)、每胎斷奶數(shù)、平 均胎間距、年產(chǎn)胎數(shù)、年產(chǎn)活仔、年斷奶頭數(shù)、出生窩重、斷奶窩重等。
[0069] 接著，采集該338頭豬提取基因組DNA，按照步驟1所述的方法，通過飛行時(shí)間質(zhì)譜 技術(shù)檢測(cè)各頭豬的該SNP標(biāo)記的基因型。
[0070] 然后，將試驗(yàn)豬群基因型與上繁殖性狀即經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。其中，該關(guān)聯(lián)分 析是應(yīng)用SAS 6. 0GLM程序?qū)Ψ敝承誀畹牟煌蛐椭g的差異進(jìn)行最小二乘方差分析。
[0071] 所采用的線性模型為：
[0072] Y = u +Breed+Farm+Mar ker+e
[0073] 其中，Y是性狀觀察值，y為總體均值，Sex為性別效應(yīng)，Breed為品種效應(yīng)，F(xiàn)arm 為豬場(chǎng)效應(yīng)，Marker為標(biāo)記效應(yīng)，e為隨機(jī)誤差，假定服從N(0, 〇 2)分布。
[0074] 應(yīng)用模型根據(jù)最小二乘分析法直接分析基因型的效應(yīng)，同時(shí)進(jìn)行基因型間的兩兩 比較?；蛐烷g性狀的簡(jiǎn)單均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差分析結(jié)果總結(jié)于表7。
[0075] 表7.豬的基因型與豬群體繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析
[0077] 注表示差異顯著P〈0. 05, **表示差異極顯著P〈0. 01。
[0078] 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，此SNP位點(diǎn)的不同基因型豬在總產(chǎn)仔數(shù)、活產(chǎn)仔數(shù)、斷奶頭數(shù)上差異極 顯著（P〈0. 01)，GG基因型豬的總產(chǎn)仔數(shù)、活產(chǎn)仔數(shù)、斷奶頭數(shù)均明顯比AG基因型和AA基因 型豬的高，并且GG基因型豬與AA基因型豬在總產(chǎn)仔數(shù)、活產(chǎn)仔數(shù)、斷奶頭數(shù)上均差異極顯 著（P〈0. 01) ;AG基因型豬的總產(chǎn)仔數(shù)、活產(chǎn)仔數(shù)、斷奶頭數(shù)明顯高于AA基因型豬，即GG基 因型豬的繁殖性能比AA基因型和AG基因型豬的繁殖性能好，AG基因型豬比AA基因型豬 的繁殖性能好。表明該SNP標(biāo)記的AG基因型豬的繁殖能力顯著高于AA基因型豬，而低于 GG基因型豬。進(jìn)一步證明了上述SNP標(biāo)記與豬的繁殖性狀顯著相關(guān)。
[0079] 在本說明書的描述中，參考術(shù)語"一個(gè)實(shí)施例"、"一些實(shí)施例"、"示例"、"具體示 例"、或"一些示例"等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特 點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對(duì)上述術(shù)語的示意性表述不 一定指的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任何 的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。
[0080] 盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不 脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本 發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種豬繁殖性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記，其特征在于，所述SNP標(biāo)記為SEQ ID NO : 1所示 核苷酸序列自5'端起第31位堿基A或G。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的SNP標(biāo)記，其特征在于，所述SNP標(biāo)記的AG基因型個(gè)體的繁 殖能力顯著高于AA基因型個(gè)體，而低于GG基因型個(gè)體。3. -組用于檢測(cè)權(quán)利要求1或2所述的SNP標(biāo)記的引物，其特征在于，具有SEQ ID NO: 2-4所示的核苷酸序列。4. 一種用于檢測(cè)權(quán)利要求1或2所述的SNP標(biāo)記的試劑盒，其特征在于，包含： 權(quán)利要求3所述的引物。5. 權(quán)利要求1或2所述的SNP標(biāo)記、權(quán)利要求3所述的引物或權(quán)利要求4所述的試劑 盒，在豬選育中的用途。6. -種檢測(cè)豬繁殖性狀的方法，其特征在于，通過對(duì)待測(cè)豬進(jìn)行權(quán)利要求1或2所述的 SNP標(biāo)記的檢測(cè)，確定所述待測(cè)豬的繁殖性狀。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，通過對(duì)待測(cè)豬進(jìn)行權(quán)利要求1或2所述的 SNP標(biāo)記的檢測(cè)，確定所述待測(cè)豬的繁殖性狀，進(jìn)一步包括： 提取待測(cè)豬的基因組DNA; 利用SEQ ID N0:2-3所示的引物，將所述待測(cè)豬的基因組DNA進(jìn)行第一PCR擴(kuò)增，以便 獲得第一 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； 利用延伸引物對(duì)所述第一 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行第二PCR擴(kuò)增，以便獲得第二PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物，其中所述延伸引物具有SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列； 對(duì)所述第二PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)，以便確定所述待測(cè)豬的所述SNP標(biāo) 記的基因型；以及 基于所述待測(cè)豬的所述SNP標(biāo)記的基因型，確定所述待測(cè)豬的繁殖性狀。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述SNP標(biāo)記的AG基因型個(gè)體的繁殖能 力顯著高于AA基因型個(gè)體，而低于GG基因型個(gè)體。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，利用質(zhì)譜儀進(jìn)行所述飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)。10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)是利用Sequenom 公司質(zhì)譜儀MT09進(jìn)行的。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK105821037SQ201510003761
【公開日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2015年1月4日
【發(fā)明人】崔京京, 何祝君, 張清峰, 李勇, 杜玉濤, 肖麗萍, 孫達(dá)
【申請(qǐng)人】深圳華大基因研究院