用于鑒定小麥株高的分子標(biāo)記以及特異引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于鑒定小麥株高的分子標(biāo)記以及特異引物。本發(fā)明提供的引物組，由特異引物對(duì)甲和特異引物對(duì)乙組成；特異引物對(duì)甲由兩條引物組成，引物F1為序列1所示，引物R1為序列2所示；所述特異引物對(duì)乙由兩條引物組成，引物F2為序列3所示；引物R2為序列4所示。將本發(fā)明中的分子標(biāo)記或引物組運(yùn)用于分子標(biāo)記輔助選擇，能快速篩選出具有高株高或低株高表型的小麥品種(材料)，從而加速小麥新品種的育成步伐，具有重要的理論意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
【專利說明】
用于鑒定小麥株高的分子標(biāo)記以及特異引物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于鑒定小麥株高的分子標(biāo)記以及特異引物。
【背景技術(shù)】
[0002] 小麥?zhǔn)亲钪匾募Z食作物之一，其高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)是世界糧食安全的重要保障。隨著 人口增長(zhǎng)、耕地減少和全球氣候惡化，小麥高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)顯得更為重要。
[0003] 株高是影響小麥產(chǎn)量的一個(gè)重要因素。植株過高不僅容易引起倒伏，而且還會(huì)與 籽粒的發(fā)育競(jìng)爭(zhēng)光合產(chǎn)物。矮桿種質(zhì)資源的應(yīng)用引發(fā)了的"綠色革命"，大大促進(jìn)了小麥增 產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)。因此，株高控制基因的研究具有重要意義。
[0004] 李興茂等利用矮抗58和京冬8號(hào)的重組自交系群體(Recombinant inbred line, RIL)在8個(gè)環(huán)境下檢測(cè)到染色體4D和6A上兩個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的主效QTL，其中QPH.caas-6A是一 個(gè)控制株高的新位點(diǎn)，可解釋表型變異11.0%，因此具有重要的研究?jī)r(jià)值。開發(fā)與 QPH.caas-6A緊密連鎖的分子標(biāo)記不僅為輔助選擇育種提供良好工具，而且為圖位克隆該 位點(diǎn)的株高控制基因創(chuàng)造條件。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種用于鑒定小麥株高的分子標(biāo)記以及特異引物。
[0006] 本發(fā)明首先保護(hù)一個(gè)引物組，由特異引物對(duì)甲和特異引物對(duì)乙組成；
[0007] 所述特異引物對(duì)甲由兩條引物組成，其靶序列為特異DNA分子甲，所述特異DNA分 子甲中包括小麥的基因組中引物F1和引物R1的靶序列；
[0008] 引物F1為如下(al)或(a2):
[0009] (al)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子；
[0010] (a2)將序列1經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有 相同功能的DNA分子；
[0011]引物R1為如下(a3)或(a4):
[0012] (a3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子；
[0013] (a4)將序列2經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有 相同功能的DNA分子；
[0014]所述特異引物對(duì)乙由兩條引物組成，其靶序列為特異DNA分子乙，所述特異DNA分 子乙中包括小麥的基因組中引物F2和引物R2的靶序列；
[0015]引物F2為如下(al)或(a2):
[0016] (al)序列表的序列3所示的單鏈DNA分子；
[0017] (a2)將序列3經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有 相同功能的DNA分子；
[0018] 引物R2為如下(a3)或(a4):
[0019 ](a3)序列表的序列4所示的單鏈DNA分子；
[0020] (a4)將序列4經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有 相同功能的DNA分子。
[0021] 所述特異引物對(duì)甲具體可由引物F1和引物R1組成。
[0022] 所述特異引物對(duì)乙具體可由引物F2和引物R2組成。
[0023] 所述特異DNA分子甲具體可為下述分子標(biāo)記AP2。
[0024] 所述特異DNA分子乙具體可為下述分子標(biāo)記FAR。
[0025]所述引物組的用途為如下（1)或（2)或（3)或（4): (1)輔助鑒定待測(cè)小麥的株高； (2)輔助篩選具有低株高的小麥品種；（3)輔助篩選具有高株高的小麥品種；（4)輔助比較不 同待測(cè)小麥品種的株尚。
[0026]本發(fā)明還保護(hù)一種試劑盒，包括以上任一所述引物組、限制性內(nèi)切酶Msel和限制 性內(nèi)切酶Nlalll。所述試劑盒中還可包括其他常規(guī)用于PCR擴(kuò)增的試劑和/或其他常規(guī)用于 基因組提取的試劑和/或其他常規(guī)用于聚丙烯酰胺凝膠電泳的試劑。
[0027]本發(fā)明還保護(hù)以上任一所述特異引物對(duì)甲。所述特異引物對(duì)甲的用途為如下（1) 或(2)或(3)或(4): (1)輔助鑒定待測(cè)小麥的株高；（2)輔助篩選具有低株高的小麥品種；（3) 輔助篩選具有高株高的小麥品種；（4)輔助比較不同待測(cè)小麥品種的株高。
[0028]本發(fā)明還保護(hù)組合物甲，由以上任一所述特異引物對(duì)甲和限制性內(nèi)切酶Msel組 成。所述組合物甲的用途為如下（1)或(2)或(3)或(4): (1)輔助鑒定待測(cè)小麥的株高；（2)輔 助篩選具有低株高的小麥品種；（3)輔助篩選具有高株高的小麥品種；（4)輔助比較不同待 測(cè)小麥品種的株尚。
[0029]本發(fā)明還保護(hù)以上任一所述特異引物對(duì)乙。所述特異引物對(duì)乙的用途為如下（1) 或(2)或(3)或(4): (1)輔助鑒定待測(cè)小麥的株高；（2)輔助篩選具有低株高的小麥品種；（3) 輔助篩選具有高株高的小麥品種；（4)輔助比較不同待測(cè)小麥品種的株高。
[0030] 本發(fā)明還保護(hù)組合物乙，由以上任一所述特異引物對(duì)乙和限制性內(nèi)切酶Nlalll組 成。所述引物組乙的用途為如下（1)或(2)或(3)或(4): (1)輔助鑒定待測(cè)小麥的株高；（2)輔 助篩選具有低株高的小麥品種；（3)輔助篩選具有高株高的小麥品種；（4)輔助比較不同待 測(cè)小麥品種的株尚。
[0031] 本發(fā)明還保護(hù)以上任一所述引物組或試劑盒的應(yīng)用，為如下（1)或（2)或（3)或 (4) :(1)輔助鑒定待測(cè)小麥的株高；（2)輔助篩選具有低株高的小麥品種；（3)輔助篩選具有 尚株尚的小麥品種；（4)輔助比$父不同待測(cè)小麥品種的株尚。
[0032] 所述應(yīng)用中，鑒定待測(cè)小麥的株高的方法如下：
[0033]①以待測(cè)小麥的基因組DNA為模板，采用引物F1和引物R1組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，然后采用限制性內(nèi)切酶Msel進(jìn)行酶切，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，如果顯示不具有 104bp的條帶、待測(cè)小麥為基于分子標(biāo)記AP 2的AP2-a基因型，如果顯示具有104bp的條帶、待 測(cè)小麥為基于分子標(biāo)記AP2的AP 2-b基因型；
[0034]②以待測(cè)小麥的基因組DNA為模板，采用引物F2和引物R2組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，然后采用限制性內(nèi)切酶Nlalll進(jìn)行酶切，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，如果顯示具有 278bp的條帶、待測(cè)小麥為基于分子標(biāo)記FAR的FAR-a基因型，如果顯示不具有278bp的條帶、 待測(cè)小麥為基于分子標(biāo)記FAR的FAR-b基因型；
[0035] 如果待測(cè)小麥為基于分子標(biāo)記AP2的AP2_a基因型且基于分子標(biāo)記FAR的FAR-a基因 型，待測(cè)小麥為候選的低株高小麥;如果待測(cè)小麥為基于分子標(biāo)記AP2的AP2-b基因型且基于 分子標(biāo)記FAR的FAR-b基因型，待測(cè)小麥為候選的高株高小麥。
[0036]步驟①和步驟②無(wú)先后順序。
[0037]所述步驟②還可替換為如下步驟③：以待測(cè)小麥的基因組DNA為模板，采用引物F2 和引物R2組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后采用限制性內(nèi)切酶Nlalll進(jìn)行酶切，然后進(jìn)行聚 丙烯酰胺凝膠電泳，如果顯示不具有250bp的條帶、待測(cè)小麥為基于分子標(biāo)記FAR的FAR-a基 因型，如果顯示具有250bp的條帶、待測(cè)小麥為基于分子標(biāo)記FAR的FAR-b基因型。
[0038]所述步驟②還可替換為如下步驟④：以待測(cè)小麥的基因組DNA為模板，采用引物F2 和引物R2組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后采用限制性內(nèi)切酶Nlalll進(jìn)行酶切，然后進(jìn)行聚 丙烯酰胺凝膠電泳，如果顯示具有278bp的條帶且不具有250bp的條帶、待測(cè)小麥為基于分 子標(biāo)記FAR的FAR-a基因型，如果顯示具有250bp的條帶且不具有278bp的條帶、待測(cè)小麥為 基于分子標(biāo)記FAR的FAR-b基因型。
[0039] 所述應(yīng)用中，輔助篩選具有低株高的小麥品種的方法如下:采用上述方法鑒定待 測(cè)小麥的株尚，篩選具有低株尚的小麥品種。
[0040] 所述應(yīng)用中，輔助篩選具有高株高的小麥品種的方法如下:采用上述方法鑒定待 測(cè)小麥的株尚，篩選具有尚株尚的小麥品種。
[0041] 所述應(yīng)用中，比較不同待測(cè)小麥品種的株高的方法如下：
[0042]①以待測(cè)小麥的基因組DNA為模板，采用引物F1和引物R1組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，然后采用限制性內(nèi)切酶Msel進(jìn)行酶切，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，如果顯示不具有 104bp的條帶、待測(cè)小麥為基于分子標(biāo)記AP 2的AP2-a基因型，如果顯示具有104bp的條帶、待 測(cè)小麥為基于分子標(biāo)記AP2的AP 2-b基因型；
[0043]②以待測(cè)小麥的基因組DNA為模板，采用引物F2和引物R2組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，然后采用限制性內(nèi)切酶Nlalll進(jìn)行酶切，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，如果顯示具有 278bp的條帶、待測(cè)小麥為基于分子標(biāo)記FAR的FAR-a基因型，如果顯示不具有278bp的條帶、 待測(cè)小麥為基于分子標(biāo)記FAR的FAR-b基因型；
[0044] 基于分子標(biāo)記AP2為AP2_a基因型且基于分子標(biāo)記FAR為FAR-a基因型的待測(cè)小麥的 株高低于基于分子標(biāo)記AP2為AP2-b基因型且基于分子標(biāo)記FAR為FAR-b基因型的待測(cè)小麥。
[0045] 步驟①和步驟②無(wú)先后順序。
[0046] 所述步驟②還可替換為如下步驟③：以待測(cè)小麥的基因組DNA為模板，采用引物F2 和引物R2組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后采用限制性內(nèi)切酶Nlalll進(jìn)行酶切，然后進(jìn)行聚 丙烯酰胺凝膠電泳，如果顯示不具有250bp的條帶、待測(cè)小麥為基于分子標(biāo)記FAR的FAR-a基 因型，如果顯示具有250bp的條帶、待測(cè)小麥為基于分子標(biāo)記FAR的FAR-b基因型。
[0047]所述步驟②還可替換為如下步驟④：以待測(cè)小麥的基因組DNA為模板，采用引物F2 和引物R2組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后采用限制性內(nèi)切酶Nlalll進(jìn)行酶切，然后進(jìn)行聚 丙烯酰胺凝膠電泳，如果顯示具有278bp的條帶且不具有250bp的條帶、待測(cè)小麥為基于分 子標(biāo)記FAR的FAR-a基因型，如果顯示具有250bp的條帶且不具有278bp的條帶、待測(cè)小麥為 基于分子標(biāo)記FAR的FAR-b基因型。
[0048]本發(fā)明還保護(hù)以上任一所述特異引物對(duì)甲或組合物甲或特異引物對(duì)乙或組合物 乙的應(yīng)用，為如下（1)或(2)或(3)或(4): (1)輔助鑒定待測(cè)小麥的株高；（2)輔助篩選具有低 株高的小麥品種；（3)輔助篩選具有高株高的小麥品種；（4)輔助比較不同待測(cè)小麥品種的 株尚。
[0049] 本發(fā)明還保護(hù)分子標(biāo)記AP2,一種多態(tài)形式為(bl)或(b2)，另一種多態(tài)形式為(b3) 或(b4);
[0050] (bl)序列表的序列5所示的DNA分子；
[00511 (b2)序列表的序列5自5'末端第47-305位核苷酸所示的DNA分子；
[0052] (b3)序列表的序列6所示的DNA分子；
[0053] (b4)序列表的序列6自5'末端第47-305位核苷酸所示的DNA分子。
[0054] (bl)或(b2)為低株高標(biāo)記。(b3)或(b4)為高株高標(biāo)記。
[0055] 本發(fā)明還保護(hù)分子標(biāo)記FAR，一種多態(tài)形式為(cl)或(c2)或(c3)，另一種多態(tài)形式 為(c4)或(c5)或(c6);
[0056] (cl)序列表的序列7所示的DNA分子；
[0057] (c2)序列表的序列7自5'末端第1-548位核苷酸所示的DNA分子；
[0058] (c3)序列表的序列7自5'末端第271-548位核苷酸所示的DNA分子；
[0059] (c4)序列表的序列8所示的DNA分子；
[0060] (c5)序列表的序列8自5 '末端第1 -548位核苷酸所示的DNA分子；
[00611 (c6)序列表的序列8自5'末端第271-548位核苷酸所示的DNA分子。
[0062] (cl)或(C2)或(c3)為低株高標(biāo)記。（c4)或(c5)或(c6)為高株高標(biāo)記。
[0063] 本發(fā)明還保護(hù)所述分子標(biāo)記AP2和/或所述分子標(biāo)記FAR的應(yīng)用，為如下（1)或（2) 或(3)或(4): (1)輔助鑒定待測(cè)小麥的株高；（2)輔助篩選具有低株高的小麥品種；（3)輔助 篩選具有尚株尚的小麥品種；（4)輔助比$父不同待測(cè)小麥品種的株尚。
[0064] 所述應(yīng)用中，鑒定待測(cè)小麥的株高的方法如下：
[0065]①如果待測(cè)小麥攜帶(bl)或(b2)、待測(cè)小麥為基于分子標(biāo)記AP2的AP2_a基因型，如 果待測(cè)小麥攜帶(b3)或(b4)、待測(cè)小麥為基于分子標(biāo)記AP2的AP2-b基因型；
[0066]②如果待測(cè)小麥攜帶(c 1)或(c2)或(c3)、待測(cè)小麥為基于分子標(biāo)記FAR的FAR-a基 因型，如果待測(cè)小麥攜帶(c4)或(c5)或(c6)、待測(cè)小麥為基于分子標(biāo)記FAR的FAR-b基因型； [0067] 如果待測(cè)小麥為基于分子標(biāo)記AP2的AP2_a基因型且基于分子標(biāo)記FAR的FAR-a基因 型，待測(cè)小麥為候選的低株高小麥;如果待測(cè)小麥為基于分子標(biāo)記AP 2的AP2-b基因型且基于 分子標(biāo)記FAR的FAR-b基因型，待測(cè)小麥為候選的高株高小麥。
[0068]步驟①和步驟②無(wú)先后順序。
[0069] 所述應(yīng)用中，輔助篩選具有低株高的小麥品種的方法如下:采用上述方法鑒定待 測(cè)小麥的株尚，篩選具有低株尚的小麥品種。
[0070] 所述應(yīng)用中，輔助篩選具有高株高的小麥品種的方法如下:采用上述方法鑒定待 測(cè)小麥的株尚，篩選具有尚株尚的小麥品種。
[0071] 所述應(yīng)用中，比較不同待測(cè)小麥品種的株高的方法如下：
[0072]①如果待測(cè)小麥攜帶(bl)或(b2)、待測(cè)小麥為基于分子標(biāo)記AP2的AP2_a基因型，如 果待測(cè)小麥攜帶(b3)或(b4)、待測(cè)小麥為基于分子標(biāo)記AP2的AP2-b基因型；
[0073]②如果待測(cè)小麥攜帶(c 1)或(c2)或(c3)、待測(cè)小麥為基于分子標(biāo)記FAR的FAR-a基 因型，如果待測(cè)小麥攜帶(c4)或(c5)或(c6)、待測(cè)小麥為基于分子標(biāo)記FAR的FAR-b基因型；
[0074] 基于分子標(biāo)記AP2為AP2_a基因型且基于分子標(biāo)記FAR為FAR-a基因型的待測(cè)小麥的 株高低于基于分子標(biāo)記AP 2為AP2-b基因型且基于分子標(biāo)記FAR為FAR-b基因型的待測(cè)小麥。 [0075]步驟①和步驟②無(wú)先后順序。
[0076]以上任一所述待測(cè)小麥具體可為小麥栽培種。
[0077]以上任一所述低株高指的是株高小于82cm。
[0078] 以上任一所述尚株尚指的是株尚大于82cm。
[0079] 將本發(fā)明中的分子標(biāo)記或引物組運(yùn)用于分子標(biāo)記輔助選擇，能快速篩選出具有高 株高或低株高表型的小麥品種(材料），從而加速小麥新品種的育成步伐，具有重要的理論 意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
【附圖說明】
[0080] 圖1小麥株高主效位點(diǎn)QPH. caas-6A在6A染色體上的作圖區(qū)間。
[0081] 圖2采用實(shí)施例2的方法檢測(cè)基于分子標(biāo)記AP2的基因型，部分實(shí)驗(yàn)材料的結(jié)果。
[0082] 圖3采用實(shí)施例2的方法檢測(cè)基于分子標(biāo)記FAR的基因型，部分實(shí)驗(yàn)材料的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0083] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平 均值。
[0084] 實(shí)施例1、分子標(biāo)記以及引物對(duì)的發(fā)現(xiàn)
[0085]進(jìn)行大量序列分析、比對(duì)以及預(yù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了小麥株高主效位點(diǎn)QPH.caas-6A的兩 個(gè)分子標(biāo)記(分子標(biāo)記AP2和分子標(biāo)記FAR)，以及用于鑒定分子標(biāo)記的引物對(duì)。
[0086]分子標(biāo)記AP2的兩種多態(tài)形式分別如序列表的序列5和序列表的序列6所示。分子 標(biāo)記FAR的兩種多態(tài)形式分別如序列表的序列7和序列表的序列8所示。
[0087]小麥株高主效位點(diǎn)QPH. caas_6A在6A染色體上的作圖區(qū)間見圖1。右側(cè)是分子標(biāo)記 的名稱，左側(cè)數(shù)字是標(biāo)記之間的遺傳距離，單位是cM。黑色三角顯示QPH.caas-6A的位置。分 子標(biāo)記AP2和分子標(biāo)記FAR將目標(biāo)QTL定位在1.8cM區(qū)間內(nèi)。
[0088]用于鑒定分子標(biāo)記AP2的引物對(duì)如下：
[0089] F1 (序列表的序列 1): 5' -GGTTAGAACATTATATTATTAATTACTGGTTGATTTCTTATATTG-3，；
[0090] Rl(序列表的序列2) :5'-CTCGTATGAACAAGTAAITCAAITCAAITATAAATAAGTC-3'。
[0091] F1和R1的靶序列為分子標(biāo)記AP2。
[0092] 分子標(biāo)記AP2的靶序列如
[0093]用于鑒定分子標(biāo)記FAR的引物對(duì)如下：
[0094] F2(序列表的序列3) :5'-CCCATACTACTCTGGAACTTGCCCATCTC-3' ；
[0095] R2(序列表的序列4) :5'-ATAITTACCAACTCCTGGGATGTCCCAApV-3'。
[0096] F2和R2的靶序列為分子標(biāo)記FAR的第1至548位核苷酸。
[0097]實(shí)施例2、方法的建立
[0098] 1、提取待測(cè)小麥的基因組DNA，得到DNA濃度為1 OOng/yl的模板溶液。
[0099] 2、以步驟1提取的基因組DNA為模板，采用F1和R1組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0100] 3、取步驟2得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，采用限制性內(nèi)切酶Msel進(jìn)行酶切，然后進(jìn)行聚丙 烯酰胺凝膠電泳，如果顯示具有259bp的條帶、待測(cè)小麥為基于分子標(biāo)記AP 2的AP2-a基因型 (矮桿基因型），如果顯示具有l(wèi)〇4bp和155bp的條帶、待測(cè)小麥為基于分子標(biāo)記AP 2的AP2-b基 因型(高桿基因型）。以上判斷標(biāo)準(zhǔn)是基于酶切完全的情況，但在實(shí)際操作中，經(jīng)常發(fā)生酶切 不完全的現(xiàn)象，AP 2-b基因型的待測(cè)小麥也可能顯示具有259bp的條帶，因此不建議通過 259bp的條帶進(jìn)行基因型判斷。實(shí)際操作中，由于單雙鏈DNA泳動(dòng)速度不同，155bp條帶附近 存在干擾條帶，因此不建議通過155bp的條帶進(jìn)行基因型判斷。
[0101] 因此，實(shí)際應(yīng)用中建議通過以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷:取步驟2得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，采用 限制性內(nèi)切酶Msel進(jìn)行酶切，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，如果顯示不具有104bp的條 帶、待測(cè)小麥為基于分子標(biāo)記AP 2的AP2-a基因型(矮桿基因型），如果顯示具有104bp的條帶、 待測(cè)小麥為基于分子標(biāo)記AP 2的AP2-b基因型(高桿基因型）。
[0102] PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系：2XTaq PCR Mix 7.5沿，卩1(1〇1111)1沿，1?1(1〇1111)叫1，模板溶 液Uyl，無(wú)菌H2O 4ul。
[0103] PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性3min;94°C變性15s、56°C退火20s、72°C延伸30s， 35個(gè)循環(huán);最后72°C延伸5min。
[0104] 酶切體系（20yl):限制性內(nèi)切酶0 ? 5yl，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10yl，10 XNEB buffer2yl， ddH207.5yl。
[0105] 酶切條件:37°C，3h。
[0106] 4、取步驟2得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，采用限制性內(nèi)切酶Nlalll進(jìn)行酶切，然后進(jìn)行聚 丙烯酰胺凝膠電泳，如果顯示具有278bp的條帶、待測(cè)小麥為基于分子標(biāo)記FAR的FAR-a基因 型(矮桿基因型），如果顯示具有28bp和250bp的條帶、待測(cè)小麥為基于分子標(biāo)記FAR的FAR-b 基因型（高桿基因型）。實(shí)際操作中，由于28bp條帶太小，不便于電泳后的觀察，因此不建議 通過28bp的條帶進(jìn)行基因型判斷。
[0107]因此，實(shí)際應(yīng)用中建議通過以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷:取步驟2得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，采用 限制性內(nèi)切酶Nlalll進(jìn)行酶切，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，如果顯示具有278bp的條 帶、待測(cè)小麥為基于分子標(biāo)記FAR的FAR-a基因型(矮桿基因型），如果顯示不具有278bp的條 帶、待測(cè)小麥為基于分子標(biāo)記FAR的FAR-b基因型(高桿基因型）。
[0108]因此，實(shí)際應(yīng)用中建議通過以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷:取步驟2得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，采用 限制性內(nèi)切酶Nlalll進(jìn)行酶切，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，如果顯示不具有250bp的條 帶、待測(cè)小麥為基于分子標(biāo)記FAR的FAR-a基因型（矮桿基因型），如果顯示具有250bp的條 帶、待測(cè)小麥為基于分子標(biāo)記FAR的FAR-b基因型(高桿基因型）。
[0109]因此，實(shí)際應(yīng)用中建議通過以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷:取步驟2得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，采用 限制性內(nèi)切酶Nlalll進(jìn)行酶切，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，如果顯示具有278bp的條帶 且不具有250bp的條帶、待測(cè)小麥為基于分子標(biāo)記FAR的FAR-a基因型(矮桿基因型），如果顯 示具有250bp的條帶且不具有278bp的條帶、待測(cè)小麥為基于分子標(biāo)記FAR的FAR-b基因型 (尚桿基因型）。
[0110] PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系：2XTaq PCR Mix 7.5沿，卩2(1〇1111)1沿，1?2(1〇1111)叫1，模板溶 液Uyl，無(wú)菌H2O 4ul。
[0111] PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性3min;94°C變性15s，63°C退火20s，72°C延伸30s， 35個(gè)循環(huán);最后72°C延伸5min。
[0112] 酶切體系（20yl):限制性內(nèi)切酶0.5yl，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 10yl，10XNEB buffer2yl， ddH207.5yl。
[0113] 酶切條件：37°C，3h。
[0114] 實(shí)施例3、引物對(duì)的應(yīng)用
[0115] 實(shí)驗(yàn)材料為166個(gè)小麥品種(均為中國(guó)黃淮麥區(qū)麥主推品種），具體見表1。
[0116] 1、將各個(gè)實(shí)驗(yàn)材料分別種置于安陽(yáng)和濉溪兩個(gè)地點(diǎn)，每個(gè)地點(diǎn)設(shè)置三個(gè)重復(fù)處理 (每個(gè)重復(fù)處理的試驗(yàn)用地為350平米），常規(guī)管理，得到各個(gè)試驗(yàn)材料的株高平均值。
[0117] 2、采用實(shí)施例2提供的方法檢測(cè)各個(gè)實(shí)驗(yàn)材料基于分子標(biāo)記AP2的基因型和基于 分子標(biāo)記FAR的基因型。
[0118] 采用實(shí)施例2的方法檢測(cè)基于分子標(biāo)記AP2的基因型，部分實(shí)驗(yàn)材料的結(jié)果見圖2。 圖2中，泳道1至17依次為石家莊15、小偃6號(hào)、淮麥18、濟(jì)麥20、中育9號(hào)、蘭考2號(hào)、高優(yōu)503、 花培5號(hào)、內(nèi)鄉(xiāng)5號(hào)、良星99、皖麥29、魯麥21、洛旱2號(hào)、煙農(nóng)18、陜715、矮抗58、蘭考24。
[0119] 采用實(shí)施例2的方法檢測(cè)基于分子標(biāo)記FAR的基因型，部分實(shí)驗(yàn)材料的結(jié)果見圖3。 圖3中，泳道1至14依次為石家莊15、矮豐3號(hào)、小偃6號(hào)、矮抗58、淮麥18、濟(jì)麥20、濟(jì)南17、蘭 考2號(hào)、良星99、臨麥4號(hào)、魯麥23、洛旱2號(hào)、內(nèi)鄉(xiāng)188、山農(nóng)20。
[0120] 結(jié)果見表1。166個(gè)小麥品種中：138個(gè)品種顯示為AP2-a基因型且FAR-a基因型，株 高平均值為80.7cm; 20個(gè)品種顯示為AP2-b基因型且FAR-b基因型，株高平均值為84. lcm; 8 個(gè)品種顯示為AP2-a基因型且FAR-b基因型或AP2-b基因型且FAR-a基因型，株高平均值為 82.4〇11;統(tǒng)計(jì)測(cè)驗(yàn)顯示0?11.〇338-64的基因效應(yīng)達(dá)到了顯著差異(？〈0.05)。將82〇11作為閾 值，如果待測(cè)小麥的基于分子標(biāo)記AP 2的基因型為AP2-a基因型且基于分子標(biāo)記FAR的基因型 為FAR-a基因型，可以將其判斷為候選的具有低株高表型的小麥（即株高小于82cm的小麥）， 準(zhǔn)確度為71.3%。將82cm作為閾值，如果待測(cè)小麥的基于分子標(biāo)記AP 2的基因型為AP2-b基因 型且基于分子標(biāo)記FAR的基因型為FAR-b基因型，可以將其判斷為候選的具有高株高表型的 小麥（即株高大于82cm的小麥），準(zhǔn)確度為55%。經(jīng)測(cè)序，AP 2-a基因型品種采用F1和R1組成 的引物對(duì)時(shí)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物均與序列表的序列5中的相應(yīng)預(yù)期靶區(qū)域一致，AP 2-b基因型品 種采用F1和R1組成的引物對(duì)時(shí)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物均與序列表的序列6中的相應(yīng)預(yù)期靶區(qū)域一 致。經(jīng)測(cè)序，F(xiàn)AR-a基因型品種采用F2和R2組成的引物對(duì)時(shí)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物均與序列表的序 列7中的相應(yīng)預(yù)期靶區(qū)域一致，F(xiàn)AR-b基因型品種采用F2和R2組成的引物對(duì)時(shí)得到的擴(kuò)增產(chǎn) 物均與序列表的序列8中的相應(yīng)預(yù)期靶區(qū)域一致。
[0121]表1各個(gè)小麥品種的基因型檢測(cè)結(jié)果和株高測(cè)量結(jié)果




【主權(quán)項(xiàng)】
1. 引物組，由特異引物對(duì)甲和特異引物對(duì)乙組成； 所述特異引物對(duì)甲由兩條引物組成，其靶序列為特異DNA分子甲，所述特異DNA分子甲 中包括小麥的基因組中引物F1和引物R1的靶序列； 引物F1為如下(al)或(a2): (al)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子； (a2)將序列1經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同 功能的DNA分子； 弓丨物R1為如下(a3)或(a4): (a3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子； (a4)將序列2經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同 功能的DNA分子； 所述特異引物對(duì)乙由兩條引物組成，其靶序列為特異DNA分子乙，所述特異DNA分子乙 中包括小麥的基因組中引物F2和引物R2的靶序列； 引物F2為如下(al)或(a2): (al)序列表的序列3所示的單鏈DNA分子； (a2)將序列3經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有相同 功能的DNA分子； 引物R2為如下(a3)或(a4): (a3)序列表的序列4所示的單鏈DNA分子； (a4)將序列4經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相同 功能的DNA分子。2. 如權(quán)利要求1所述的引物組，其特征在于：所述特異引物對(duì)甲由引物F1和引物R1組 成，所述特異引物對(duì)乙由引物F2和引物R2組成。3. -種試劑盒，包括特異引物組、限制性內(nèi)切酶Msel和限制性內(nèi)切酶Nlalll;所述特異 引物組為權(quán)利要求1或2所述的引物組。4. 特異引物對(duì)甲或組合物甲； 所述特異引物對(duì)甲由兩條引物組成，其靶序列為特異DNA分子甲，所述特異DNA分子甲 中包括小麥的基因組中引物F1和引物R1的靶序列； 引物F1為如下(al)或(a2): (al)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子； (a2)將序列1經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同 功能的DNA分子； 弓丨物R1為如下(a3)或(a4): (a3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子； (a4)將序列2經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同 功能的DNA分子； 所述組合物甲由所述特異引物對(duì)甲和限制性內(nèi)切酶Msel組成。5. 特異引物對(duì)乙或組合物乙； 所述特異引物對(duì)乙由兩條引物組成，其靶序列為特異DNA分子乙，所述特異DNA分子乙 中包括小麥的基因組中引物F2和引物R2的靶序列； 引物F2為如下(al)或(a2): (al)序列表的序列3所示的單鏈DNA分子； (a2)將序列3經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有相同 功能的DNA分子； 引物R2為如下(a3)或(a4): (a3)序列表的序列4所示的單鏈DNA分子； (a4)將序列4經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相同 功能的DNA分子； 所述組合物乙由所述特異引物對(duì)乙和限制性內(nèi)切酶Nlalll組成。6. 權(quán)利要求1所述特異引物組或權(quán)利要求2所述特異引物組或權(quán)利要求3所述試劑盒的 應(yīng)用，為如下（1)或(2)或(3)或(4): (1) 輔助鑒定待測(cè)小麥的株高； (2) 輔助篩選具有低株高的小麥品種； (3) 輔助篩選具有尚株尚的小麥品種； (4) 輔助比較不同待測(cè)小麥品種的株高。7. 權(quán)利要求4所述特異引物對(duì)甲或權(quán)利要求4所述組合物甲或權(quán)利要求5所述特異引物 對(duì)乙或權(quán)利要求5所述組合物乙的應(yīng)用，為如下（1)或(2)或(3)或(4): (1) 輔助鑒定待測(cè)小麥的株高； (2) 輔助篩選具有低株高的小麥品種； (3) 輔助篩選具有尚株尚的小麥品種； (4) 輔助比較不同待測(cè)小麥品種的株高。8. 分子標(biāo)記AP2,一種多態(tài)形式為(bl)或(b2)，另一種多態(tài)形式為(b3)或(b4); (bl)序列表的序列5所不的DNA分子； (b2)序列表的序列5自5 '末端第47-305位核苷酸所不的DNA分子； (b3)序列表的序列6所不的DNA分子； (b4)序列表的序列6自5 '末端第47-305位核苷酸所不的DNA分子。9. 分子標(biāo)記FAR，一種多態(tài)形式為(cl)或(c2)或(c3)，另一種多態(tài)形式為(c4)或(c5)或 (c6)； (cl)序列表的序列7所示的DNA分子； (c2)序列表的序列7自5 '末端第1-548位核苷酸所不的DNA分子； (c3)序列表的序列7自5 '末端第271-548位核苷酸所示的DNA分子； (c4)序列表的序列8所示的DNA分子； (c5)序列表的序列8自5'末端第1-548位核苷酸所不的DNA分子； (c6)序列表的序列8自5'末端第271-548位核苷酸所不的DNA分子。10. 權(quán)利要求8所述分子標(biāo)記AP2和/或權(quán)利要求9所述分子標(biāo)記FAR的應(yīng)用，為如下⑴或 (2)或⑶或(4): (1) 輔助鑒定待測(cè)小麥的株高； (2) 輔助篩選具有低株高的小麥品種； (3) 輔助篩選具有1?株1?的小麥品種； (4) 輔助比較不同待測(cè)小麥品種的株高。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105821038SQ201610347796
【公開日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2016年5月24日
【發(fā)明人】何中虎, 田秀苓, 曹雙河
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所