一種小麥種子休眠持續(xù)性顯著相關(guān)的snp標(biāo)記及其caps標(biāo)記和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種小麥種子休眠持續(xù)性顯著相關(guān)的SNP標(biāo)記及其CAPS標(biāo)記和應(yīng)用，所述SNP位于小麥2AL染色體且在遺傳圖譜中與SSR標(biāo)記Xwmc658緊密連鎖，為一種新的與種子休眠持續(xù)性主效位點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上開發(fā)的CAPS標(biāo)記為小麥抗穗發(fā)芽分子標(biāo)記輔助育種提供了一種新的方法，為培育抗穗發(fā)芽持續(xù)性較強(qiáng)的小麥品種奠定了基礎(chǔ)，彌補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)中在收獲后沒有連續(xù)進(jìn)行種子休眠/穗發(fā)芽抗性鑒定的空白，有助于小麥抗穗發(fā)芽多基因聚合育種。
【專利說明】
-種小麥種子休眠持續(xù)性顯著相關(guān)的SNP標(biāo)巧及其CAPS標(biāo)巧 和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及的是小麥分子育種的技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及的是一種小麥種子休眠持續(xù) 性顯著相關(guān)的SNP標(biāo)記及其CAI^標(biāo)記和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 小麥?zhǔn)斋@前遭遇連陰雨天氣容易發(fā)生穗發(fā)芽(Pre-harvest sproutingiPHS)。穗 發(fā)芽導(dǎo)致種子內(nèi)部儲(chǔ)藏物質(zhì)消耗，造成減產(chǎn)，同時(shí)劣化品質(zhì)。如果收獲前遭遇的陰雨或高濕 天氣持續(xù)時(shí)間較長，則穗發(fā)芽危害更嚴(yán)重。因此，培育穗發(fā)芽抗性持續(xù)性強(qiáng)的小麥品種有助 于降低因較長的陰雨高濕天氣所造成的穗發(fā)芽風(fēng)險(xiǎn)。種子休眠性被認(rèn)為是穗發(fā)芽抗性的主 要遺傳因素。種子休眠持續(xù)期長，則穗發(fā)芽抗性持續(xù)性強(qiáng)(蔣國梁等，1998)。因此，解析種子 休眠持續(xù)性遺傳機(jī)理，鑒定種子休眠持續(xù)性主效位點(diǎn)，開發(fā)相關(guān)標(biāo)記，不僅可W為培育具有 穗發(fā)芽抗性持續(xù)性較強(qiáng)的小麥品種提供基因資源，而且有助于加快小麥抗穗發(fā)芽多基因聚 合育種進(jìn)程。然而，控制種子休眠持續(xù)性相關(guān)位點(diǎn)/基因仍不清楚。
[0003] 總結(jié)前人研究結(jié)果表明，小麥種子休眠/穗發(fā)芽抗性受主效和微效多基因共同控 審IJ，設(shè)及小麥21條染色體，主效9化主要分布于小麥染色體2BS、3AS和4AL。其相應(yīng)候選基因 也被鑒定，如化S化，TaMFT，PM19-A1，TaMKK3-A。然而，運(yùn)些研究結(jié)果均是W收獲后短期內(nèi)進(jìn) 行種子休眠/穗發(fā)芽抗性鑒定為分析基礎(chǔ)的，并沒有在收獲后連續(xù)進(jìn)行種子休眠/穗發(fā)芽抗 性鑒定，所W目前鑒定的種子休眠/穗發(fā)芽抗性的主效位點(diǎn)對于種子休眠持續(xù)性的作用仍 不清楚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種小麥種子休眠持續(xù)性顯著相 關(guān)的SNP標(biāo)記及其CAI^標(biāo)記和應(yīng)用，W提供一種新的抗穗發(fā)芽分子標(biāo)記。
[0005] 本發(fā)明是通過W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0006] 一種小麥種子休眠持續(xù)性顯著相關(guān)的SNP標(biāo)記，所述SNP標(biāo)記為堿基A或G，位于小 麥2AL染色體且在遺傳圖譜中與SSR標(biāo)記Xwmc658緊密連鎖。
[0007] -種W上述SNP標(biāo)記開發(fā)的CAPS標(biāo)記，所述CAPS標(biāo)記為小麥2AL染色體上包含所述 SNP標(biāo)記的延伸序列，命名為CAPS-2AL，其中，當(dāng)所述SNP為A時(shí)，命名為CAPS-2Aka，當(dāng)所述 SNP為G時(shí)，命名為CAPS-2Akb。
[000引進(jìn)一步地，所述CAPS標(biāo)記具有如SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列，其中，所述SEQ ID NO. 1的核巧酸序列中，自5'端起的第85位堿基即為所述SNP。
[0009] -種利用上述CAI^標(biāo)記鑒定小麥休眠持續(xù)性的方法，包括W下步驟：
[0010] (1)提取待測小麥基因組DNA;
[0011] (2)WSEQ ID N0.2、SEQ ID ^.3所述的序列為引物，對小麥基因組0臟進(jìn)行口〇?擴(kuò) 增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，引物序列如下所示：
[0012] SEQ ID N0.2：F：CCCTGATGTCAAATACGGC
[0013] SEQ ID N0.3：R：CAACTTGTAGTGCTCGGTGA；
[0014] (3)將擴(kuò)增產(chǎn)物用NsiI內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，獲得酶切產(chǎn)物，若酶切產(chǎn)物包含一條主 帶，則待測小麥為小麥種子休眠持續(xù)性較長的品種，若酶切產(chǎn)物包含兩條主帶，則待測小麥 為小麥種子休眠持續(xù)性較短的品種。
[0015] 一種用于檢測CAPS-2AL的引物對，所述引物對的核巧酸序列如SEQ ID N0.2、SEQ ID NO.3所示，具體為：
[0016] 沈Q ID N0.2:F:CCCTGATGTCAAATACGGC;
[0017] SEQ ID N0.3:R:CAACTTGTAGTGCTCGGTGA。
[001引與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明基于全基因組關(guān)聯(lián)分析，在小麥2AL染色體上鑒定出種子 休眠持續(xù)性主效位點(diǎn)，通過連鎖分析證實(shí)該位點(diǎn)與種子休眠持續(xù)性緊密相關(guān)后，提供了一 種小麥種子休眠持續(xù)性顯著相關(guān)的SNP標(biāo)記及其CAPS標(biāo)記和應(yīng)用，W提供一種新的用于小 麥抗穗發(fā)芽分子標(biāo)記輔助育種方法，培育抗穗發(fā)芽持續(xù)性較強(qiáng)的小麥品種，彌補(bǔ)了現(xiàn)有技 術(shù)中在收獲后沒有連續(xù)進(jìn)行種子休眠/穗發(fā)芽抗性鑒定的空白，有助于小麥抗穗發(fā)芽多基 因聚合育種。
【附圖說明】
[0019] 圖1為CAPS-2AL標(biāo)記檢測11種小麥品種的瓊脂糖電泳圖，其中，泳道1-11依次為安 農(nóng)8455、許科1號、濟(jì)麥20、遂寧巧巧麥、周麥25、紫0706、曉農(nóng)606、龍科0901、矮豐早8、京 411、萬縣白麥子；
[0020] 圖2為小麥2AL染色體主效位點(diǎn)在京411/萬縣白麥子和濟(jì)麥20/遂寧巧巧麥群體中 的有效性驗(yàn)證。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 實(shí)施例1
[0022] 1 材料
[0023] 本實(shí)施例所用方法如無特別說明均為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知曉的常規(guī)方法，所用 的試劑等材料，如無特別說明，均為市售購買產(chǎn)品，所用種質(zhì)資源，均可從國家種質(zhì)資源庫 獲得。
[0024] 2 方法
[00巧]取11種小麥品種：安農(nóng)8455，許科1號，濟(jì)麥20，遂寧巧巧麥，周麥25，紫0706，曉農(nóng) 606,龍科0901，矮豐早8,京411，萬縣白麥子，進(jìn)行種子休眠持續(xù)性能力鑒定，具體包括W下 步驟：
[0026] 2. ISDS-Tris飽和酪法抽提小麥基因組DNA
[0027] (1)取2-3粒小麥種子置于2mL滅菌離屯、管，利用電動(dòng)粉碎機(jī)將種子研磨成粉末； [002引（2)加入 1.2mL DNA提取緩沖液（200mM Tris-Cl，250mM NaCl，25mM 抓TA，0.5% 805,2%0-16新鮮加入）；
[0029] (3) 60°C水浴45min，期間間歇振蕩7-8次W充分萃取DNA;
[0030] (4)室溫下 12000巧 m 離屯、lOmin;
[0031] (5)轉(zhuǎn)移上清液至新的2血滅菌離屯、管中，加入預(yù)冷的等體積Tris飽和酪/氯仿異/ 戊醇(體積比為25:24:1)，于冰上顛倒混勻15min，期間間歇振蕩謹(jǐn)防出現(xiàn)分層；
[0032] (6)室溫下 12000巧 m 離屯、lOmin;
[0033] (7)轉(zhuǎn)移上清液至新的2mL滅菌離屯、管中，重復(fù)步驟(5)、（6)，W充分去除蛋白；
[0034] (8)轉(zhuǎn)移上清液至新的1.5mL滅菌離屯、管中，加入0.6倍異丙醇和0.1倍體積化Ac (P冊.2)，輕輕顛倒混勻后于冰上靜置20min或更久，使DM白色沉淀充分析出；
[0035] (9)4°C10000巧m 離屯、lOmin;
[0036] (10)棄上清，加入預(yù)冷的70%乙醇漂洗2遍，然后用無水乙醇漂洗1遍，室溫驚干， 加入lOOuL其中含化L lOmg/mL RNase酶的1XTE緩沖液(或雙蒸水)過夜溶解；
[0037] (11)在化noVue Plus微量分光光度計(jì)上檢測DNA濃度，并統(tǒng)一稀釋成50-6化gAiL 工作液，-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[003 引 2.2PCR 擴(kuò)增
[0039] WSEQ ID NO . 2 (F : CCCTGATGTCAAATACGGC)、SEQ ID NO . 3 ( R ： CAACTTGTAGTGCTCGGTGA)為引物，對小麥基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得SNP擴(kuò)增產(chǎn)物。其中， PCR擴(kuò)增體系為 10化，包括lOXbuffer(含有2.0mmol/L Mg2+)1.0iiL，2.5mmol/L dNTPs 0.祉 L，抓/化 hgONA polymerase 0.1 化L，10皿ol/L引物各0.4化，2.0化模板DNA巧0~60ng/ii L)，ddH20 5.29化。？〔3反應(yīng)程序?yàn)椋?4°(：預(yù)變性5111111，40個(gè)循環(huán)（94°(：變性305,57°(：退火 30S，每循環(huán)降0. rC，72°C延伸30S)，72°C延伸8miru4°C保存，用5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò) 增產(chǎn)物。
[0040] 2.3酶切檢測
[0041 ]將SNP擴(kuò)增產(chǎn)物用化i I內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，獲得酶切產(chǎn)物，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝 膠電泳檢測，獲得如圖1所示的結(jié)果。由于Nsil內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)為ATGCA/T，因此，當(dāng)酶切 產(chǎn)物僅包含一條主帶時(shí)，說明待測小麥的CAPS-2AL基因型為CAPS-2Akb，待測小麥為種子 休眠持續(xù)性較長的品種；當(dāng)酶切產(chǎn)物包含兩條主帶，說明待測小麥的CAPS-2AL基因型為 CAPS-2AL-a，則待測小麥為小麥種子休眠持續(xù)性較短的品種。
[0042] 3兩個(gè)連鎖群體在小麥染色體2AL上連鎖作圖和的1分析
[0043] 取京411/萬縣白麥子群體和濟(jì)麥20/遂寧巧巧麥群體，分別測定其群體在2015年 收獲后5天、15天的種子萌芽指數(shù)，定義為15GI5-JW和15GI15-JW，15GI5-JS和15GI15-JS，具 體測定方法為：
[0044] 于小麥蠟熟期分別收獲小麥主莖穗材料，室內(nèi)風(fēng)干2天，立即存放于-20°C冰箱W 維持種子的休眠性，待全部試驗(yàn)材料收獲完畢，一并進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。選取10個(gè)成熟期一致的 主莖穗，手工脫粒，每個(gè)材料取50粒進(jìn)行種子發(fā)芽試驗(yàn)，2次重復(fù)。巧粒腹溝朝下擺放在培養(yǎng) 皿內(nèi)，培養(yǎng)皿內(nèi)加9ml無菌水，置于人工氣候培養(yǎng)箱(20°C，光照14h，黑暗lOh，濕度80% )，24 小時(shí)候后開始統(tǒng)計(jì)每個(gè)培養(yǎng)皿萌發(fā)種子數(shù)，于每天同一時(shí)間統(tǒng)計(jì)萌芽數(shù)并剔除發(fā)芽種子 (W胚部露白為萌芽鑒定標(biāo)準(zhǔn)），3天后計(jì)算種子萌芽指數(shù)(GI)。
[0045] 種子萌芽指數(shù)(GI)計(jì)算公式:GI = [(3Xnl+2Xn2+lXn3)/(3XN)]X100%
[0046] 其中nl、n2、n3是種子第訪、第2天、第3天每天所萌芽的巧粒數(shù)，姆旨總粒數(shù)。
[0047] 另外，2015年小麥?zhǔn)斋@期，京411/萬縣白麥子群體材料遇到自然降雨天氣，每份家 系在田間保留10個(gè)小麥主莖穗進(jìn)行自然降雨整穗發(fā)芽率測定，定義為15FS-JW，用于輔助驗(yàn) 證小麥染色體2AL新主效位點(diǎn)。收獲后置于電熱恒溫干燥箱中，15(TC快速烘干，手工脫粒， 統(tǒng)計(jì)發(fā)芽種子數(shù)和總粒數(shù)，計(jì)算田間整穗發(fā)芽率(field sproutingiFS)。
[004引田間整穗發(fā)芽率(。5)計(jì)算公式:!^5=(10穗發(fā)芽數(shù)今10穗總粒數(shù)）X100%
[0049] 同時(shí)，對京411/萬縣白麥子群體和濟(jì)麥20/遂寧巧巧麥群體，利用IciMapping 3.3 軟件化ttp://www. isbreeding.net)對群體進(jìn)行連鎖圖譜構(gòu)建，遺傳距離單位為cM，連鎖標(biāo) 準(zhǔn)為L0D值大于3.0,利用軟件中完備區(qū)間作圖法對群體進(jìn)行OTL定位，L0D值設(shè)為2.5。
[0050] 結(jié)果如圖2所示，其中圖a為京411/萬縣白麥子群體的連鎖圖譜，圖b為濟(jì)麥20/遂 寧巧巧麥群體的連鎖圖譜。圖中可W看出，與主效QTL緊密連鎖標(biāo)記分別為Xwmc658- 甜arc377和CAPS-2AkXwmc658，可解釋表型變異的9.1 % -38.8 %。
[0化1 ] 4CAPS標(biāo)記在中國微核屯、材料中的驗(yàn)證
[0化2] 對205份中國微核屯、種質(zhì)材料(Qiinese mini-core collection，CMCC)，分別測定 其2014和2015年收獲后5天、15天的種子萌芽指數(shù)，定義為14GI5-CMCC、14GI15-CMCC、 15GI5-CMCC和15GI15-CMCC。利用CAPS-2AL標(biāo)記對205份中國微核屯、種質(zhì)材料進(jìn)行基因型分 析，共存在兩種基因型CAPS-2Aka和CAPS-2Akb，其中攜帶CAPS-2Akb帶型的材料其種子 休眠持續(xù)性較強(qiáng)，攜帶CAPS-2AL-a帶型的材料其種子休眠持續(xù)性較弱，結(jié)果如表1所示：
[0053]表1:CAPS-2AL不同等位基因間種子休眠持續(xù)性的差異顯著性分析
[0化4]
[0055] a指對cAPS-2Aka和CAPS-2Akb對應(yīng)的表型值均值進(jìn)行t測驗(yàn)；
[0化6] **表示在0.01水平上差異顯著;b表示表型變異解釋率。
[0化7] 表1中，t測驗(yàn)結(jié)果表明，兩種等位基因型在2014年GI5和GI15W及2015年GI5和 GI15表型上差異達(dá)極顯著水平(P<0.01)，驗(yàn)證了該標(biāo)記與種子休眠持續(xù)性顯著相關(guān)。
[005引 W上為本發(fā)明一種詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，是W本發(fā)明技術(shù)方案為前 提下進(jìn)行實(shí)施，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于上述的實(shí)施例。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種小麥種子休眠持續(xù)性顯著相關(guān)的SNP標(biāo)記，其特征在于，所述SNP標(biāo)記為堿基A或 G，位于小麥2AL染色體且在遺傳圖譜中與SSR標(biāo)記Xwmc658緊密連鎖。2. -種以如權(quán)利要求1所述的SNP標(biāo)記開發(fā)的CAPS標(biāo)記，其特征在于，所述CAPS標(biāo)記為 小麥2AL染色體上包含所述SNP標(biāo)記的延伸序列。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種CAPS標(biāo)記，其特征在于，所述CAPS標(biāo)記具有如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，其中，所述SEQ ID NO. 1的核苷酸序列中，自5'端起的第85位堿基 為所述SNP。4. 一種利用如權(quán)利要求3所述的CAPS標(biāo)記鑒定小麥休眠持續(xù)性的方法，其特征在于，包 括以下步驟： (1) 提取待測小麥基因組DNA; (2) 以SEQ ID N0.2、SEQ ID如.3所述的序列為引物，對小麥基因組0嫩進(jìn)行？0財(cái)廣增， 獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，引物序列如下所示： SEQ ID N0.2：F：CCCTGATGTCAAATACGGC SEQ ID N0.3：R：CAACTTGTAGTGCTCGGTGA； (3) 將擴(kuò)增產(chǎn)物用Nsi I內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，獲得酶切產(chǎn)物，若酶切產(chǎn)物包含一條主帶，則 待測小麥為小麥種子休眠持續(xù)性較長的品種，若酶切產(chǎn)物包含兩條主帶，則待測小麥為小 麥種子休眠持續(xù)性較短的品種。5. -種用于檢測CAPS標(biāo)記的引物對，其特征在于，所述引物對的核苷酸序列如SEQ IDN0.2、SEQIDN0.3所示，具體為 ： SEQ ID N0.2：F：CCCTGATGTCAAATACGGC； SEQ ID N0.3:R:CAACTTGTAGTGCTCGGTGA。
【文檔編號】C12Q1/68GK106048056SQ201610640924
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月5日 公開號201610640924.7, CN 106048056 A, CN 106048056A, CN 201610640924, CN-A-106048056, CN106048056 A, CN106048056A, CN201610640924, CN201610640924.7
【發(fā)明人】朱玉磊, 王升星, 張海萍, 常成, 吳曾云, 曹佳佳, 姜昊, 劉凱, 秦朦, 盧杰, 司紅起, 馬傳喜
【申請人】安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)