轉(zhuǎn)ics1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種生物技術(shù)領(lǐng)域的提高青葛素含量的方法，特別是一種轉(zhuǎn)ICSl基因 提高青葛中青葛素含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 青葛(Artemisia annua L.)是菊科葛屬的一年生草本植物。其地上部分所提取的 含有過氧橋的倍半祗內(nèi)醋氧化物一一青葛素，是目前應(yīng)用最廣泛，療效最好的抗追疾藥物， 特別是對腦型追疾和抗氯哇追疾更加有效。目前，青葛素聯(lián)合療法(ACTS)是世界衛(wèi)生組織 推薦的最有效的治療追疾的方法。隨著對青葛素藥理研究的逐步深入，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)青葛素 及其衍生物還具有抗炎、抗腫瘤、抗癌W及免疫調(diào)節(jié)的功能。
[0003] 然而青葛素在植物青葛中的含量非常低，大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)受到了限制，無法完 全滿足全球的市場需求。由于青葛素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，人工合成難度大，產(chǎn)量低，成本高，不具可行 性。通過酵母工程生產(chǎn)青葛素，前期投入成本大，且產(chǎn)量有限不能滿足需求?，F(xiàn)有技術(shù)表明 植物基因工程為提高青葛中青葛素的含量提供了一個可行的方法。
[0004] 青葛具有分泌型腺毛（g 1 a n d U 1 a r t r i C h O m e S )和非分泌型腺毛 (nonglanduladrichomes)。在青葛葉片的正面和背面、莖桿、花上都大量存在分泌型腺毛， 運里是大量次生代謝物的累積場所，青葛素也被認(rèn)為儲存于此處。
[0005] 水楊酸（Salicylic acid, SA)是重要的植物激素，在植物的生長發(fā)育上起了非常 重要的作用，并與植物的抗病防御密切相關(guān)。異分支酸合成酶（Isochorismate synthase, ICS)是植物水楊酸合成途徑的其中一個關(guān)鍵酶，負(fù)責(zé)將分支酸轉(zhuǎn)化為異分支酸，然后進(jìn)一 步合成最終產(chǎn)物水楊酸。ICSl基因水楊酸調(diào)控的抗逆有關(guān)聯(lián)。對icsl突變體研究發(fā)現(xiàn)，缺失 ICSl基因的植株內(nèi)源水楊酸含量也極低。因此，克隆ICSl基因并轉(zhuǎn)化青葛，對探究水楊酸合 成途徑和青葛素途徑的代謝協(xié)調(diào)及基因工程育種具有重要意義。
[0006] 本發(fā)明致力于采用基因工程手段，獲得青葛素高產(chǎn)的青葛植株，為規(guī)?；a(chǎn)青 葛素提供一條新途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種轉(zhuǎn)ICSl基因提高青葛中青葛 素含量的方法。本發(fā)明設(shè)及的基因克隆、載體構(gòu)建、遺傳轉(zhuǎn)化、分子檢測、青葛素提取及含量 測定用于本發(fā)明，建立了穩(wěn)定提高青葛中青葛素含量的方法，為利用青葛大規(guī)模生產(chǎn)青葛 素奠定了基礎(chǔ)。
[000引本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)ICSl基因提高青葛中青葛素含量的方法，包括W下步驟：
[0009] (1)采用基因克隆方法獲得ICSi基因；
[0010] (2)把所述ICSl基因連接于表達(dá)調(diào)控序列，構(gòu)建含ICSl基因的植物表達(dá)載體；
[0011] (3)將所述含ICSl基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，獲得含所述ICSl基因植 物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株；
[0012] (4)利用所述含ICSl基因植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化青葛，獲得經(jīng)PCR檢 測的整合外源目的基因ICSl的轉(zhuǎn)基因青葛植株。
[0013] 進(jìn)一步地，所述I雌1基因的DNA序列如沈Q ID NO. 1所示。
[0014] 進(jìn)一步地，所述ICSl基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0015] 進(jìn)一步地，在所述步驟（1)中，所述基因克隆方法包括W下步驟:提取青葛基因組 總RNA，將所獲的青葛基因組總RNA通過反轉(zhuǎn)錄酶化反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA，W所述第一鏈 CDNA為模板，W上游引物和下游引物為引物對，進(jìn)行PCR擴增，其中所述上游引物的DNA序列 如SEQ ID NO.3所示，所述下游引物的DNA序列如SEQ ID NO.4所示。
[0016] 優(yōu)選地，在所述步驟（1)中，所述基因克隆方法包括W下步驟:提取青葛基因組總 RNA，將所獲的青葛基因組總RNA通過反轉(zhuǎn)錄酶化反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA，根據(jù)SEQ ID NO. 1 所示的DNA序列，設(shè)計擴增出完整編碼框的上游引物和下游引物，所述上游引物為SEQ ID NO. 3所示的DNA序列，所述下游引物為SEQ ID NO. 4所示的DNA序列，W所述的第一鏈CDNA為 模板，W所述上游引物和所述下游引物為引物對，經(jīng)PCR擴增后進(jìn)行測序。
[0017] 進(jìn)一步地，在所述步驟(2)中，所述構(gòu)建含ICSl基因的植物表達(dá)載體包括W下步 驟:先構(gòu)建中間載體PJET-ICS1，再酶切中間載體PJET-ICSl和表達(dá)載體P皿-n-f lag,回收 ICSl基因片段和P皿-n-f lag載體大片段，連接轉(zhuǎn)化，挑取單克隆，提取質(zhì)粒做PCR檢測和酶 切驗證，得到含ICSl基因的植物表達(dá)載體。P皿-n-flag是對P皿201表達(dá)載體在35s啟動子后 插入flag改造獲得并保存的表達(dá)載體。
[0018] 進(jìn)一步地，在所述步驟(2)中，所述構(gòu)建含ICSl基因的植物表達(dá)載體包括W下步 驟:先通過連接酶將所述步驟(1)中基因克隆獲得的ICSl基因片段連接到載體IMET中，得到 中間載體UET-ICSl;再設(shè)計引入酶切位點SacI的上下游引物，所述引入酶切位點SacI的上 游引物的DNA序列如SEQ ID NO. 5所示，所述引入酶切位點Sac I的下游引物的DNA序列如SEQ ID NO.6所示，W所述中間載體UET-ICSl為模板，W所述引入酶切位點SacI的上下游引物 為引物對進(jìn)行PCR擴增，得產(chǎn)物1;再用SacI酶切所述產(chǎn)物1和表達(dá)載體P皿-n-flag，得到帶 酶切位點SacI的ICSl基因片段和P皿-n-flag載體大片段；回收所述帶酶切位點SacI的ICSl 基因片段和所述PHB-n-f lag載體大片段，連接轉(zhuǎn)化，挑取單克隆，提取質(zhì)粒做PCR檢測和酶 切驗證，得到含ICSl基因的植物表達(dá)載體。
[0019] 進(jìn)一步地，在所述步驟(4)中，所述轉(zhuǎn)化包括W下步驟:外植體的預(yù)培養(yǎng);農(nóng)桿菌與 外植體的共培養(yǎng);抗性再生植株的篩選;其中，
[0020] 所述預(yù)培養(yǎng)包括W下步驟:青葛種子用75%乙醇浸泡Imin,再用20%化Cio浸泡 20min，無菌水沖洗3-4次，用無菌吸水紙吸干表面水分，接種于無激素的MS固體培養(yǎng)基中， 25°C光照培養(yǎng)，即可獲得青葛無菌苗，待苗長至5cm左右后，剪取無菌苗葉片外植體用于轉(zhuǎn) 化；
[0021] 所述共培養(yǎng)包括W下步驟:將所述葉片外植體轉(zhuǎn)到共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，滴加含活化 好的所述含ICSl基因植物雙元表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌工程菌的1/2MS懸液，使外植體與菌 液充分接觸，28°C暗培養(yǎng)3天，W滴加在不帶有目的基因的根癌農(nóng)桿菌的1/2MS液體培養(yǎng)基 懸液的葉片外植體為對照；
[0022] 所述篩選包括W下步驟:將所述共培養(yǎng)3天的青葛外植體轉(zhuǎn)入到發(fā)芽篩選基上于 25°C光照培養(yǎng)，每兩周繼代培養(yǎng)一次，經(jīng)過2-3次繼代培養(yǎng)后即可獲得潮霉素化yg)抗性叢 生芽，將所述生長良好的Hyg抗性叢生芽剪下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)至生根，即可獲得Hyg 抗性再生青葛植株。
[0023] 進(jìn)一步地，在所述步驟(4)中，所述PCR檢測包括W下步驟:根據(jù)目的基因所在表達(dá) 盒p35s-ICSl-nos序列p35s和ICSl分別設(shè)計正向引物和反向引物;進(jìn)行DNA擴增；紫外線下 觀察，若目的條帶為陽性，則該株系即為所述轉(zhuǎn)基因青葛植株;所述正向引物的DNA序列如 SEQ ID NO.5所示，所述反向引物的DNA序列如SEQ ID NO.4所示。
[0024] 進(jìn)一步地，還包括步驟(5)對所述轉(zhuǎn)基因青葛中青葛素含量進(jìn)行高效液相色譜法 及蒸發(fā)光散射檢測器測定化PLC-ELSD)測定，篩選獲得青葛素含量提高的轉(zhuǎn)基因青葛植株。
[0025] 優(yōu)先地，在所述步驟(5)中，所述HPLC-ELSD測定包括W下條件:所用色譜柱為C-18 反相硅膠柱，流動相選用體積比為70:30的甲醇和水，柱溫30°C，流速1.OmL/min，進(jìn)樣量20y L，蒸發(fā)光散射檢測器漂移管溫度40°C，放大系數(shù)為7，載氣壓力化ar。
[0026] 本發(fā)明的轉(zhuǎn)ICSl基因提高青葛中青葛素含量的方法，采用基因工程方法，將異分 支酸合成酶ICSl基因?qū)肭喔鹬仓曛?，獲得了青葛素高含量顯著提高的轉(zhuǎn)基因青葛株系， 轉(zhuǎn)ICSl基因青葛中青葛素的含量最高可達(dá)到干重的15.2mg/g，是非轉(zhuǎn)化普通青葛(8mg/g) 的1.90倍，該發(fā)明對于為青葛素的規(guī)?；a(chǎn)提供高產(chǎn)、穩(wěn)定新藥源具有重要意義。
【附圖說明】
[0027] 圖1是攜帶有轉(zhuǎn)ICSl基因的青葛與非轉(zhuǎn)化普通青葛的青葛素含量檢測結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0028] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容做進(jìn)一