一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染轉(zhuǎn)化蒙古柳的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及植物基因工程領(lǐng)域，特別是設(shè)及一種細(xì)菌介導(dǎo)侵染轉(zhuǎn)化蒙古柳的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蒙古柳（Salix mongolica)，楊柳科（Salicaceae )，柳屬（Salix)，屬種名定名： Salix mongolica f.sericea Qiang.et Skv。松嫩蘇打鹽堿草甸草原上的鄉(xiāng)±灌木樹種， 小枝細(xì)長，葉線形或線狀披針形，長5-15厘米，寬5-9毫米，幼葉有絨毛，后無毛，表面綠色， 背面蒼白色，邊緣有腺銀齒;葉柄長8-12毫米。花先葉開放，接近同時(shí)開放，無花序梗，基部 常有3個(gè)小葉；雄花序長2-3厘米，粗2-3毫米;雄蕊2個(gè)完全合生，雌花序長2.5-3.0厘米，粗 約4毫米;子房有毛，無柄，花柱無或極短，柱頭頭狀;巷片同雄花。分布:黑龍江、吉林、迂寧、 河北等省;蒙古，蘇聯(lián)也有。蒙古柳的粗蛋白的含量>15%，葉中賴氨酸含量在2%左右，接近 草木犀和首猜的水平，運(yùn)一特點(diǎn)表明可W作為木本飼料，也是青黃不接的冬春兩季草本飼 料缺陷時(shí)的重要補(bǔ)充。
[0003] 植物遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)是相應(yīng)外植體的離體再生，只有高頻的外植體離體再生系 統(tǒng)，才能建立高效率的遺傳轉(zhuǎn)化體系。自從1985年化rsh等人首創(chuàng)了農(nóng)桿菌葉盤轉(zhuǎn)化法，大 大推動(dòng)了農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法的應(yīng)用，并促使植物遺傳轉(zhuǎn)化的研究得到了迅速發(fā)展，而且 已成為現(xiàn)在廣為應(yīng)用的首選方法之一。目前國內(nèi)外已有關(guān)于樹木組織培養(yǎng)及離體再生方面 相關(guān)報(bào)道，自從化rson等于1986年證實(shí)楊樹可W進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化和外源基因在林木細(xì)胞中表 達(dá)W來，林木基因工程研究已經(jīng)取得很大進(jìn)展?，F(xiàn)已對(duì)楊樹、火炬松、花旗松、白云杉、檔木、 刺槐、麻棟、按樹、歐洲赤松、蘭伯氏松、挪威云杉等20多個(gè)樹種進(jìn)行了轉(zhuǎn)化研究。還有金絲 垂柳JlOlO和旱柳建立了農(nóng)桿菌侵染介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，并通過GUS組織化學(xué)染色轉(zhuǎn)基因 愈傷組織進(jìn)行了初步檢測(cè)。但是，仍未見蒙古柳的遺傳轉(zhuǎn)化受體再生體系建立的報(bào)道?；?工程的發(fā)展和應(yīng)用為林木育種開辟了一條新的途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中沒有蒙古柳的遺傳轉(zhuǎn)化受體再生體系的建 立方法，而提供了一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染轉(zhuǎn)化蒙古柳的方法。
[0005] 本發(fā)明利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染轉(zhuǎn)化外植體為葉片誘導(dǎo)愈傷組織，共培養(yǎng)和篩選轉(zhuǎn)化 愈傷組織，并誘導(dǎo)分化抗性叢生芽，在生根培養(yǎng)培養(yǎng)基上再生成植株，GUS染色檢測(cè)轉(zhuǎn)化再 生植株表明有35S啟動(dòng)下0-半乳糖巧酶活性。
[0006] 本發(fā)明的農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染轉(zhuǎn)化蒙古柳的方法按如下步驟進(jìn)行：
[0007] -、人工培育蒙古柳無菌苗的葉片愈傷組織的誘導(dǎo)：蒙古柳種子用體積分?jǐn)?shù)為 69%~71%的酒精和體積分?jǐn)?shù)為2%~4%的次氯酸鋼消毒、滅菌后，在1/2MS培養(yǎng)基上發(fā)芽 后，生長到4葉期或5葉期的無菌苗，剪取無菌苗長X寬為（0.5cm ±0.1 cm)X(0.5cm ± 0.1cm)的葉片在MSYDl培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織;27.5°C~28.5°C條件下，先光照條件下培養(yǎng) 14h，再暗條件下培養(yǎng)IOh，運(yùn)樣光暗條件交替培養(yǎng)20~25天，然后更換一次培養(yǎng)基，60~65 天誘導(dǎo)出愈傷組織；
[0008] 二、農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化和共培養(yǎng):挑取含PBI121質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，單克隆培養(yǎng)于含有 50mg/L± 2mg/L卡那霉素和100mg/L± 2mg/L利福平的YEP液體培養(yǎng)基中；在27.5°C~28.5°C 條件下，W20化pm/min培養(yǎng)，至農(nóng)桿菌菌株濃度為在7101紫外分光光度計(jì)A = 600下，測(cè)得參 數(shù)OD值為0.5~0.別寸，在YEP液體培養(yǎng)基中加入50化± 濃度為lOOmM/L ± 5mM/L的乙酷下 香酬繼續(xù)培養(yǎng)1~2小時(shí);將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無菌的離屯、管中，常溫下，45(K)rpm/分鐘，離屯、15min ~20min收集農(nóng)桿菌；W液體MS培養(yǎng)基重新懸浮農(nóng)桿菌，調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌菌株濃度為在7101紫外 分光光度計(jì)A = 600下，測(cè)得參數(shù)OD值為0.5~0.別寸;無菌操作臺(tái)中，用綴子將步驟一誘導(dǎo)出 的愈傷組織夾成直徑為3mm~5mm的塊狀，加入懸浮好的農(nóng)桿菌菌液10~20ml，同時(shí)加入20]i L± 濃度為lOOmM/L的乙酷下香酬，在侵染5min~15min后，常溫下，W50巧m/min培養(yǎng) 5min~IOmin;棄去全部農(nóng)桿菌菌液，用無菌濾紙吸去愈傷組織表面殘留的菌液，然后將愈 傷組織轉(zhuǎn)入鋪有用MS培養(yǎng)液體充分浸透過的無菌濾紙的愈傷組織篩選培養(yǎng)基MSYDl上，在 24°C~26°C條件，全天黑暗培養(yǎng)2-3天，得到共培養(yǎng)的愈傷組織；
[0009] =、脫菌與抗性叢生芽的分化:將步驟二共培養(yǎng)的愈傷組織放到無菌蒸饋水中洗 去表面的菌，然后加入濃度為1000mg/L±10mg/L的簇節(jié)青霉素的溶液中振蕩洗菌20min~ 3〇min，再用無菌蒸饋水洗2~3次，放在滅菌濾紙上吸干，接種到篩選愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基 MSYD2,在24°C~26°C下，先光照條件下培養(yǎng)lOh，再暗條件下培養(yǎng)1地，運(yùn)樣光暗條件交替培 養(yǎng)21天~22天;將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)接到篩選分化培養(yǎng)基MSFH3上，在7101紫外分光光度計(jì)入 = 600下，測(cè)得的OD值為0.5~0.別寸，在24°C~26°C條件，先光照條件下培養(yǎng)lOh，再暗條件 下培養(yǎng)1地，運(yùn)樣光暗條件交替培養(yǎng)20~25天，繼代培養(yǎng)1次~2次，直到分化出抗性叢生芽；
[0010] 四、抗性叢生芽生根培養(yǎng)獲得抗性轉(zhuǎn)化子:取在濃度為50mg/L±2mg/L的卡那霉素 上抗性生長的單個(gè)芽接種到生根培養(yǎng)基上MSSG4,在24°C~26°C條件，先光照條件下培養(yǎng) IOh，再暗條件下培養(yǎng)Hh，運(yùn)樣光暗條件交替培養(yǎng)20天~22天長出主根;進(jìn)一步接種到狀苗 培養(yǎng)基MSSG5,在22°C~24°C條件下，先光照條件下培養(yǎng)化，再暗條件下培養(yǎng)16h，運(yùn)樣光暗 條件交替培養(yǎng)20~25天，得到轉(zhuǎn)化植株;通風(fēng)煉苗后，移栽至溫室花盆中培養(yǎng)成一年生苗， 即獲得了抗性轉(zhuǎn)化子。
[0011] 本發(fā)明的含PBI121質(zhì)粒的農(nóng)桿菌是將PBI121質(zhì)粒通過常規(guī)方法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中獲 得的。
[0012] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：
[0013] 本發(fā)明建立的蒙古柳的遺傳轉(zhuǎn)化方法，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到10%左右，為采用轉(zhuǎn)基因方 法對(duì)耐蘇打鹽堿植物蒙古柳的遺傳改良和獲得新品系奠定了基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0014] 圖1為由蒙古柳愈傷組織誘導(dǎo)出的葉片；
[0015] 圖2為由蒙古柳葉片誘導(dǎo)出的愈傷組織；
[0016] 圖3為篩選分化到的抗性胚芽；
[0017] 圖4為篩選分化到的抗性叢生芽；
[0018] 圖5為由蒙古柳葉片愈傷組織分化成再生植株
[0019] 圖6為由蒙古柳葉片愈傷組織分化成再生植株盆苗
[0020] 圖7為工作菌液侵染時(shí)間對(duì)Kana抗性轉(zhuǎn)化子的分化率的影響
[002。 圖8為轉(zhuǎn)gus基因抗性Tl代植株的PCR檢測(cè)電泳結(jié)果，其中，1為DNA Marker 化2000、2為陽性對(duì)照株系、3為陰性對(duì)照株系、4~11為抗性Tl代植株；
[0022] 圖9為轉(zhuǎn)gus基因抗性Tl代植株的PCR檢測(cè)電泳結(jié)果，其中，1為DNA Marker 化2000、2為陽性對(duì)照株系、3為陰性對(duì)照株系、4~10為抗性Tl代植株；
[0023] 圖10為2 XCTAB法提取轉(zhuǎn)化GUS基因的幼苗葉片基因組DNA，用BamHI/HindIII酶切 1 Oyg基因組DNA電泳圖；其中，1為DNA Marker，ADNA的HindIII酶切、2為陰性對(duì)照株系，3~7 為轉(zhuǎn)gus基因抗性植株的DNA;
[0024] 圖11為2 XCTAB法提取轉(zhuǎn)化GUS基因的幼苗葉片基因組DNA，用BamHI/HindllI酶切 IOyg基因組DNA圖；其中，1~為陰性對(duì)照株系、2~6為轉(zhuǎn)gus基因抗性植株DNA的Southern雜 交結(jié)果；
[0025] 圖12為取Biozol法制備的轉(zhuǎn)GUS基因蒙古柳Tl代株系的總RNA變性，甲醒-瓊脂糖 變性膠RNA電泳結(jié)果;其中，1為陰性對(duì)照株系、2~6為轉(zhuǎn)gus基因抗性植株2~6植株的RNA;
[0026] 圖13為用Biozol法制備的轉(zhuǎn)gus基因蒙古柳Tl代株系的總RNA變性，甲醒-瓊脂糖 變性，Nouthern雜交結(jié)果其中，其中，1為陰性對(duì)照株系、2~6為轉(zhuǎn)gus基因抗性植株2~6號(hào) 植株；
[0027] 圖14為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的GUS染色分析圖，愈傷組織GUS瞬時(shí)表達(dá)的染色圖片；
[0028] 圖15為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的GUS染色分析，分化的胚的染色圖片；
[0029] 圖16為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的GUS染色分析，抗性芽GUS染色圖片；
[0030] 圖17為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的GUS染色分析，再生植株GUS染色圖片；
[0031] 圖18為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的GUS染色分析，再生植株GUS染色圖片；
[0032] 圖19為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的GUS染色分析，野生型對(duì)照，脫色后的圖片。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 本發(fā)明技術(shù)方案不局限于W下所列舉【具體實(shí)施方式】，還包括各【具體實(shí)施方式】間的 任意組合。
【具體實(shí)施方式】 [0034] 一:本實(shí)施方式的農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染轉(zhuǎn)化蒙古柳的方法按如下步驟進(jìn) 行：
[0035] -、人工培育蒙古柳無菌苗的葉片愈傷組織的誘導(dǎo)：蒙古柳種子用體積分?jǐn)?shù)為 69%~71%的酒精和體積分?jǐn)?shù)為2%~4%的次氯酸鋼消毒、滅菌后，在1/2MS培養(yǎng)基上發(fā)芽 后，生長到4葉期或5葉期的無菌苗，剪取無菌苗長X寬為（0.5cm ±0.1 cm)X(0.5cm ± 0.1cm)的葉片在MSYDl培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織;于27.5°C~28.5°C，先光照條件下培養(yǎng)14h， 再暗條件下培養(yǎng)lOh，運(yùn)樣光暗條件交替培養(yǎng)20~25天，然后更換一次培養(yǎng)基，60~65天誘 導(dǎo)出愈傷組織；
[0036] 二、農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化和共培養(yǎng):挑取含PBI121質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，單克隆培養(yǎng)于含有 50mg/L± 2mg/L卡那霉素和10