專利名稱：：用rna干擾提高青蒿中青蒿素含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種生物
技術(shù)領(lǐng)域：
的提高青蒿素含量的方法，具體是一種用RNA干擾提高青蒿中青蒿素含量的方法。
背景技術(shù)：
：青蒿素(artemisinin)作為一種有效的抗瘧藥物已經(jīng)得到全世界的認(rèn)同。目前，青蒿素的主要來源是從青蒿植株的地上部分提取。ArtemisiaannuaL.(青蒿)又名黃花蒿，是一年生草本藥用植物。由于青蒿中青蒿素的含量非常低(占干重的0.01°/。-1%)，使得這種藥物的大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)受到了限制。雖然現(xiàn)在已經(jīng)能夠人工合成青蒿素，但由于難度大，產(chǎn)量低，成本高，不具備商業(yè)化生產(chǎn)的可行性。利用組織培養(yǎng)及細(xì)胞工程來生產(chǎn)青蒿素是一種很有吸引力的方法。然而青蒿素在愈傷組織中含量低于干重的0.1%，在芽中最高也只有干重的0.16%，而大多數(shù)研究在根中沒有檢測到青蒿素。因此利用組織培養(yǎng)及細(xì)胞工程來生產(chǎn)青蒿素的可行性不高。利用基因工程技術(shù)獲得穩(wěn)定的青蒿素含量較高的青蒿新品種是一種比較可行的方法。目前主要是采用過量表達(dá)青蒿合成途徑中的關(guān)鍵酶法尼基焦磷酸合酶(farnesyldiphosphatesynthase,FPS)的方法，而對于本發(fā)明涉及的通過抑制青蒿素合成途徑的競爭性支路的研究尚未有成功報道。經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，DahuaChen等在《PlantScience》(《植物科學(xué)》，2000年155期179-185頁)發(fā)表了題為"ExpressionofachimericfarnesyldiphosphatesynthasegeneinArtemisiaannuaLtransgenicplantsviaAgrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformation,,("通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化在青蒿植株中表達(dá)法尼基焦磷酸合酶基因")的論文，報道通過過量表達(dá)FPS(法尼基焦磷酸合酶)在原有基礎(chǔ)上提高青蒿素含量2-3倍，但仍只有干重的1%左右。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種用RNA干擾提高青蒿中青蒿素含量的方法，使其用RNA干擾抑制青蒿素合成途徑競爭支路關(guān)鍵酶的表達(dá)從而提高青蒿中青蒿素含量。本發(fā)明涉及關(guān)鍵酶基因克隆、RNA干擾載體構(gòu)建、遺傳轉(zhuǎn)化、分子檢測、青蒿素提取及含量測定用于本發(fā)明，建立了提高青蒿中青蒿素含量的方法，為利用轉(zhuǎn)基因青蒿大規(guī)模生產(chǎn)青蒿素奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的^本發(fā)明從青蒿中克隆鯊烯合酶(squalenesynthase,SQS)基因sqs部分序列，通過構(gòu)建hairpin結(jié)構(gòu)建立用于RNA干擾的植物表達(dá)載體，用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將sqshairpin基因轉(zhuǎn)入青蒿植株中，通過PCR和RT-PCR檢測目的基因sqshairpin的整合和表達(dá)情況，高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器(HPLOELSD)測定青蒿中青蒿素含量，篩選獲得青蒿素含量提高的轉(zhuǎn)基因青蒿植株。本發(fā)明包括如下具體步驟(1)采用基因克隆方法獲得青蒿sqs基因部分序列；(2)將獲得青蒿sqs基因部分序列通過順反拼接構(gòu)建成發(fā)夾結(jié)構(gòu)并可操作性地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成含sqshairpin基因的植物表達(dá)載體；(3)將含sqshairpin基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌(為市場有公開出售的生物材料，可以從多家公司如澳大利亞CAMBIA公司購得)，獲得用于轉(zhuǎn)化青蒿的含sqshairpin基因的植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株；(4)利用所構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化青蒿外植體，獲得經(jīng)PGR檢測的轉(zhuǎn)基因青蒿植株；(5)RT-PCR測定青蒿中青蒿素合成競爭支路關(guān)鍵酶sqs基因的表達(dá)；(6)對獲得的轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿素含量進(jìn)行HPIX-ELSD測定，篩選獲得青蒿素含量顯著提高的轉(zhuǎn)基因青蒿植株。所述的經(jīng)PCR檢測的轉(zhuǎn)基因青蒿，分別設(shè)計合成sqshairpin的檢測引物，進(jìn)行DNA擴(kuò)增，紫外線下觀察到目的條帶的陽性植株即為轉(zhuǎn)基因青蒿植株。所述的HPLC-ELSD測定青蒿中青蒿素含量，方法如下色譜柱C-18反相硅膠柱，流動相為甲醇水，甲醇水的體積比為70:30，柱溫30°C，流速1.0mL/min，進(jìn)樣量10A，蒸發(fā)光散射檢測器漂移管溫度4(TC,放大系數(shù)(gain)為7，載氣壓力5bax。所述的RT-PCR測定青蒿中青蒿素合成競爭支路關(guān)鍵酶sqs基因的表達(dá)，方法為設(shè)計合成青蒿中sqs基因的引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，用相對定量法分析基因相對表達(dá)量。本發(fā)明的利用hairpinRNA介導(dǎo)的RNA干擾抑制青蒿素合成途徑的競爭支路關(guān)鍵酶的表達(dá)從而提高青蒿中青蒿素含量的方法，采用基因工程方法，將sqshairpin基因?qū)肭噍镏仓曛校@得了青蒿素含量顯著提高的轉(zhuǎn)基因青蒿植株，轉(zhuǎn)基因青蒿植株中青蒿素的含量最高可達(dá)到28mg/gDW(即干重的2.8%)，是非轉(zhuǎn)化普通青蒿(10mg/gDW，即干重的1%)的2.8倍，該發(fā)明對于為青蒿素的規(guī)?；a(chǎn)提供高產(chǎn)、穩(wěn)定新藥源具有重要意義。具體實(shí)施例方式下面對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1青蒿sqs基因片段的克隆1.青蒿基因組總RNA的提取取少量青蒿(采用產(chǎn)于重慶酉陽青蒿素含量較高的青蒿品種)幼嫩葉片，用液氮速凍后，迅速用研缽研碎，加入盛有1mLTRIzol(TRIzolReagents,GIBCOBRL,USA)的1.5mLEppendorf管中，充分振蕩后，于室溫下放置5min，加200叱氯仿，用力振蕩15sec，室溫放置2-3min后，于4。C、12，000g離心15min;將上清液(約600叱)吸入干凈的1.5mLEppendorf管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫下放置10min后，于4。C、12，000g離心10min;棄上清，加lmL75%乙醇清洗，振蕩后，于4。C、7,500g離心5min;室溫干燥15-20min后溶于適量(30-50WJRNAase-free水中；用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計上測定RNA含量。2.青蒿sqs基因片段的克隆將所獲的青蒿基因組總RNA通過反轉(zhuǎn)錄酶XL(AMV)反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA，根,據(jù)所述青蒿sqs基因的編碼序列(SEQIDNO.l)，設(shè)計擴(kuò)增出含有部分sqs編碼序列(序列表中序列1的1080bp到1406bp)的上下游引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以所述的第一鏈cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行測序。DNA序列測定由上海博亞或晶泰生物技術(shù)服務(wù)有限公司采用3730自動測序儀完成。測序結(jié)果表明，所克隆的部分序列與GenBank中所報道的青蒿sqs基因的編碼序列(序列表中序列1的1080bp到1406bp)—致。本實(shí)施例采用基因克隆方法從青蒿中獲得序列正確的青蒿中青蒿素合成競爭支路關(guān)鍵酶基因sqs的部分編碼序列，為通過RNA干擾抑制青蒿中鯊烯合酶sqs的表達(dá)從而提高青蒿素含量提供了基因片段。實(shí)施例2含sqshairpin基因的植物雙元表達(dá)載體的構(gòu)建1.中間載體pHANNIBAL::p35s-sqshairpin-ocs的構(gòu)建將實(shí)施例1中sqs基因片段的正向序列和反向序列(序列表中序列2的lbp到327bp和U46bp到1472bp)分別連接到克隆載體pHANNIBAL中的pdkintron兩端從而構(gòu)建出中間載體pHANNIBAL::p35s-sqshairpin-ocs。具體操作如下用Xhol和Kpnl雙酶切pMD18T::sqs和pHANNIBAL,回收sqs片段和pHA麗IBAL大片段，連接轉(zhuǎn)化，挑取單克隆，提取質(zhì)粒做PCR檢測和酶切驗(yàn)證，獲得pHANNIBAL::p35s-sqs-ocs;再用Clal和BamHI雙酶切pMD18T::sqs和pHANNIBAL::p35s_sqs-ocs，回收sqs片段和pHANNIBAL::p35s_sqs-ocs大片段，連接轉(zhuǎn)化，挑取單克隆，提取質(zhì)粒做PCR檢測和酶切驗(yàn)證，獲得中間載體pHANNIBAL::p35s-sqshairpin-ocs。2.植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA2300::p35s-sqshairpin-ocs的構(gòu)建以所述的pHA麗IBALr:p35s-sqshairpin-ocs為基礎(chǔ)，將含有sqshai了pin的pHANNIBAL表達(dá)盒(包括啟動子35s和終止子ocs)置于植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA2300中，構(gòu)建成含sqshairpin的植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA2300::p35s-sqshairpin-ocs。具體操作如下用Sacl和Pstl雙酶切p應(yīng)NIBAL::p35s-sqshairpin-ocs和pCAMBIA2300，回收p35s-sqshairpin-ocs片段和pCAMBIA2300大片段，連接轉(zhuǎn)化，挑取單克隆，提取質(zhì)粒做PCR檢測和酶切驗(yàn)證，獲得植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA2300::p35s-sqshairpin-ocs本實(shí)施例將青蒿素合成競爭支路關(guān)鍵酶基因sqs的部分編碼序列構(gòu)建成hairpin結(jié)構(gòu)后可操作性地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成含sqshairpin基因的植物表達(dá)載體，該表達(dá)載體可用于通過代謝工程策略來提高青蒿中青蒿素含量。實(shí)施例3根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)sqshairpin基因遺傳轉(zhuǎn)化青蒿獲得轉(zhuǎn)基因青蒿植株1.含sqshairpin基因雙元植物表達(dá)載體根癌農(nóng)桿菌工程菌的獲得將實(shí)施例2中含sqshairpin基因的植物雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌(如EHA105，為市場有公開出售的生物材料，可以從澳大利亞CAMBIA公司購得，菌株編號為Gambar1)，并進(jìn)行PCR驗(yàn)證。結(jié)果表明，含sqshairpin基因植物雙元表達(dá)載體已成功構(gòu)建到根癌農(nóng)桿菌菌株。2.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)sqshairpin基因轉(zhuǎn)化青蒿2.1.外植體的預(yù)培養(yǎng)青蒿種子用75%乙醇浸泡1min，再用20%NaCIO浸泡20min，無菌水沖洗3-4次，用無菌吸水紙吸干表面水分，接種于無激素的MS(MurashigeandSkoog，1962)固體培養(yǎng)基中，25°C、16h/8h(light/dark)光照培養(yǎng)，即可獲得青蒿無菌苗。待苗長至5cra左右后，剪取無菌苗葉片外植體用于轉(zhuǎn)化。2.2.農(nóng)桿菌與外植體的共培養(yǎng)將所述的葉片外植體，轉(zhuǎn)到共培養(yǎng)培養(yǎng)基(1/2MS+AS100Mmol/L)中，滴加含活化好的所述含sqshairpin基因植物雙元表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌工程菌的1/2MS懸液，使外植體與菌液充分接觸，28t:暗培養(yǎng)3d。以滴加在不帶有目的基因的根癌農(nóng)桿菌的1/2MS液體培養(yǎng)基懸液的葉片外植體為對照。2.3.抗性再生植株的篩選將所述的共培養(yǎng)3d的青蒿外植體轉(zhuǎn)入到發(fā)芽篩選培養(yǎng)基(MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+Kan50mg/L+Cb500mg/L)上于25。C、16h/8h光照培養(yǎng)，每兩周繼代培養(yǎng)一次，經(jīng)過2-3次繼代后即可獲得Kan抗性叢生芽。將生長良好的抗性叢生芽剪下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(1/2MS0+Cb125mg/L)上培養(yǎng)至生根，從而獲得Kan抗性再生青蒿植株。3.轉(zhuǎn)基因青蒿植株的PCR檢測根據(jù)目的基因所在表達(dá)盒p35s-sqshairpin-ocs序歹Up35s禾口sqshairpin(序列表中的序列2)分別設(shè)計正向引物設(shè)計和反向引物對轉(zhuǎn)基因青蒿植株中目的基因進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，利用所設(shè)計的PCR特異引物，能擴(kuò)增出768bp的特異DNA片段。而以非轉(zhuǎn)化青蒿基因組DNA為模板時，沒有擴(kuò)增出任何片段。本實(shí)施例將所述的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，獲得用于轉(zhuǎn)化青蒿的含sqshairpin基因植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株，利用所構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化青蒿，獲得經(jīng)PCR檢測的轉(zhuǎn)基因青蒿植株。實(shí)施例4RT-PCR檢測轉(zhuǎn)基因青蒿植株中sqs基因的表達(dá)1.引物的設(shè)計和合成根據(jù)青蒿sqs基因和看家基因actin全序列設(shè)計引物。引物擴(kuò)增基因片段長度分別為431、500bp。所用引物由上海生工生物工程公司合成。2.RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄參照實(shí)施例1中所述方法，從青蒿植株中提取RNA，用DNasel除去RNA中基因組DNA，用反轉(zhuǎn)錄酶XL(AMV)進(jìn)行第一鏈cDNA的合成。3.RT-PCR檢測轉(zhuǎn)基因青蒿中sqs基因和看家基因actin的表達(dá)為調(diào)整各樣品間在RNA抽提和逆轉(zhuǎn)錄過程中反應(yīng)效率的差異，檢測目的基因sqs表達(dá)量的同時需檢測看家基因actin基因的表達(dá)。檢測actin和目的基因的PCR的反應(yīng)體系如下反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>PCR反應(yīng)條件熱啟動和變性94。C5min，1個循環(huán)；94°C30s，54°C30s，72°C10s，35個循環(huán)；72°C8min，1個循環(huán)；4°C保存。電泳檢測結(jié)果。本實(shí)施例采用RT-PCR技術(shù)測定轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿素生物合成競爭支路關(guān)鍵酶sqs基因的表達(dá)，通過sqs基因表達(dá)量的高低可以初步篩選出可能的青蒿素高產(chǎn)的青蒿植株。實(shí)施例5利用HPLC-ELSD測定轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿素含量1.HPLC-ELSD條件及系統(tǒng)適用性以及標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制HPLC:采用wateralliance2695系統(tǒng)，色譜柱為C-18反相硅膠柱(Sy咖etryShieldTMC18，5|iim，250x4.6mm，Waters),流動相為甲醇水，甲醇水的體積比為70:30，柱溫30。C，流速1.0mL/min，進(jìn)樣量10pL，靈敏度(AUFS=1.0)，理論塔板數(shù)按青蒿素峰計算不低于2000。ELSD:采用wateralliance2420系統(tǒng)，蒸發(fā)光散射檢測器漂移管溫度40°C,放大系數(shù)(gain)為7，載氣壓力5bar;精密稱取青蒿素標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司)2.0mg用lmL甲醇完全溶解，得到2mg/mL青蒿素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，保存于-2(TC備用。本發(fā)明中流動相為甲醇(methanol):水，比例為70%:30%時，青蒿素的保留時間為5.1min,峰型良好。理論塔板數(shù)按青蒿素計算不低于2000。2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將所述對照品溶液在相應(yīng)色譜條件下分別進(jìn)樣2pl，4^1，6pl，8pl，10(al記錄圖譜及色譜參數(shù)，分別以峰面積(Y)對標(biāo)準(zhǔn)品含量(X,pg)進(jìn)行回歸分析。通過研究，本發(fā)明中青蒿素在4-20pg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的log-log線性關(guān)系。青蒿素對照品的log-log線性回歸方程為Y=l.28e+000X+4.71e+000，R=0.9795463.樣品的制備和青蒿素含量的測定青蒿素的提取過程基于VanNieuwerburghetal.(2006)中報道的方法取少量新鮮的青蒿葉片(l-2g鮮重)，于50ml試管中將其浸沒在10ml氯仿中搖蕩1分鐘，將浸出液倒入新的試管中使氯仿?lián)]發(fā)完全，取3ml無水乙醇充分溶解提取物，用于HPLC檢測。同時，氯仿提取后的葉片收集放入60度烘箱進(jìn)行烘干，稱重(計算青蒿葉片的干重)；采用HPLOELSD測定青蒿素含量，樣品進(jìn)樣體積為20ul，根據(jù)峰面積代入線形回歸方程計算出樣品中的青蒿素含量(mg)，再除以樣品的青蒿葉干重(g)，從而計算出青蒿植株中青蒿素的含量。在本發(fā)明中轉(zhuǎn)sqshairpin基因顯著提高青蒿中青蒿素含量。轉(zhuǎn)sqshairpin基因青蒿中青蒿素的含量最高可達(dá)到28mg/gDW(即干重的2.8%)，是非轉(zhuǎn)化普通青蒿(10mg/gDW，即干重的1%)的2.8倍。本實(shí)施例采用HPLC-ELSD法測定了轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿素含量。采用RNA干擾策略獲得了青蒿素高產(chǎn)的青蒿植株，為規(guī)?；a(chǎn)青蒿素提供了一種理想方法。本發(fā)明涉及的序列和記號分列如下-〈110〉上海交通大學(xué)〈120〉用RNA干擾提高青蒿中青蒿素含量的方法〈130〉〈160〉2〈170〉Patentlnversion3.4〈210〉1〈211〉1509〈212〉■〈213〉青蒿(Artemisiaannua)〈220〉〈222〉(1080)…(1406)〈223〉所克隆的用于構(gòu)建hairpin的sqs基因片段〈400〉1gg3tttgg3tcttgaag38gaa^tgagtagtttgaB3gc3gt3ttg犯3acttttstcc3tta^ttg3agttgaa犯tggctgca^gaaagccgsaaascacaacctcactgggctttctcttattccatgcttcataaagtttctagattgttattcaacaacttaatccccagcttcgtgatgctgtctgcatctttttcgcgctcttgatactgttgaggatgatacaagcatagctgctgatatcttctgatcgcctttcataagcatatctacaatcgtgattggcactttgcaaggaatacaaagttctcatggaccagttccaccatgtttctactgcctttag3g3ggtt3tC3ggaggC33ttgggg3tat犯CC3tgagEl￡ltg3gCgCtaatttatatgtaaagaggttgagacagttgatgattatgatgagttttgtcgggacttgttgg犯tagggttgtcaaagctcttccattcttcaggcacgcacccaga/tg60cagatcccat120agtttcgctc180tatttggttc240aaagtaccca300tgtggtoc幼360ctggaactta420ggg3tggcaa480cattatgttg540gaaattttgt600tttctgattctatctccaattcgatgggtttatttcttcagaagacaaatatcattagag660attatctcgaggatattaatgagatacctaagtcacgcatgttttggcctcgtgagatcc720ggagt犯at3tgttaat^gcttga^ggacctg犯atatg33gagg3ctctg8g3犯gccg了80ttcagtgcttaaatgatatggtgacaaatgctttgatacacattg犯gactgcttaaagt840atatgtctcagttga犯gatccagccatcttcaggttttgtgcaataccacagatcatgg900caattggaacacttgctttatgctacaataacattgaggttttcaggggtgtagtcaaat960tgagacgtggtctaactgcca犯gtaattgatcggactaaaacaatggctga^gtgtacc1020aggctttttctgatttttctgacatgcttaagtccaaggttgacatgcatgatccc犯tg1080cccaaacgaccatcactaggttagaagcagctcagaaaatttgcaaagactctggcaccc1140ttagcaacaggaaatcttacatagtt犯gagagagtcaagctacagtgcagctttgcttg1200ctctgcttttcactatactggctattctttatgcttatctctctgctaatcgacccaata1260aaatcaaattcactttgtaagaatctcgcggtgatacgtaagcaaagaagatccagtctt1320gaaatgtaaaaggtattgtttttatattgttggggttgctatgtttattatctctatatgttttgtggttggtatggttggtggtaggatattattgtaaatgtaagtagttgcaatctc1440atttgcgatttatgtggaatacaaatgccaacatttaagaacttaatatcaccaattgta1500ctgtttgtt1509〈210〉.2〈211>1472〈212〉腿〈213〉人工序列〈220〉〈222〉(1)…(327)〈223〉所克隆的sqs基因片段的正向序列〈220〉〈222〉(327)…(1146)<223〉載體pHANNIBAL中的pdk內(nèi)含子序列〈220〉〈222〉(1146)..,(1472)〈223〉所克隆的sqs基因片段的反向序列<400〉2gcccaaacgaccatcactaggttagaagcagctcagaaaatttgcaaagactctggcaccG0cttagcaacaggaaatcttacatagttaagagagagtcaagctacagtgcagctttgctt120gctctgcttttcactatactggctattctttatgcttatctctctgctaatcgacccaat180aaaatcaaattcactttgtaagaatctcgcggtgstacgtaagcaaagaagatccagtct240tgaaatgtaaaaggtattgtttttatattgttggggttgctatgtttattatctctatat300gttttgtggttggtatggttggtggtaggtaccccaa/ttggtaaggaaataattattttc360ttttttcctttteigtataaaatagttaagtgatgttaattagtatgattataataatata420gttgttataattgtgaaaaaataatttataaatatattgtttacataaacaacatagtaa480tgt冊a犯犯t3tgsc犯gtgatgtgt33g3cg犯g^g3t犯^gttgagagt犯gtat540attatttttaatgaatttgatcgaacatgtaagatgatatactagcattaatatttgttt600taatcataatagt犯ttctagctggtttgatgaattaaateitcaatgataaaatactata郎0gtaaaaataagaataaataaattaaaataatatttttttatgattaatagtttattatat720aattaaatatctataccattactaaatattttagtttaaaagttaataaatattttgtta780gaaattccaatctgcttgta>atttatcaataaacaaa^tettaa^taaca^agctaaagta840acaaata^tatcaaactaatagaa^cagtaatct犯tgt3ac犯a^cataatctaatgct900aatataa_ca_￡iagcgcaagatctatcattttatatagtattattttcaatcaacattctta960ttaatttctaaataatacttgtagttttattaacttctaaatggattgactattaattaa1020atgaattagtcgaacatgaataaacaaggtaacatgatagatcatgtcattgtgttatca1080ttgatcttacatttggattgattacagttgggaaattgggttcgaaatcgataagctgta1140ccccttaccaccaaccataccaaccacaaaacatatagagataataaacatagcaacccc1200aacaatataaaaacaataccttttacatttcaagactggatcttctttgcttacgtatca1260ccgcgagattcttac犯agtgaatttgattttattgggtcgattagcagagagataagca1320ta犯g犯tagccagtatagtga犯agcagagcaagc犯agctgcactgtagcttgactct1380ctcttaactatgtaagatttcctgttgctaagggtgccagagtctttgcaaattttctga1440gctgcttctaacctagtgatggtcgtttgggc147權(quán)利要求1.一種用RNA干擾提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，從青蒿中克隆鯊烯合酶SQS基因sqs片段，構(gòu)建含sqshairpin的植物表達(dá)載體，用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將sqshairpin基因轉(zhuǎn)入青蒿中獲得再生植株，PCR和RT-PCR檢測目的基因sqshairpin的整合和表達(dá)情況，高效液相色譜法及蒸發(fā)光散射檢測器測定青蒿中青蒿素的含量，篩選獲得青蒿素含量提高的轉(zhuǎn)基因青蒿植株。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用RNA干擾提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，包括如下具體步驟(1)采用基因克隆方法獲得青蒿素合成競爭性之路關(guān)鍵酶sqs基因片段；(2)把sqs基因片段構(gòu)建成hairpin結(jié)構(gòu)后可操作性地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成含sqshairpin基因的植物表達(dá)載體；(3)將含sqshairpin基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，獲得用于轉(zhuǎn)化青蒿的含sqshairpin基因植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株；(4)利用所構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化青蒿，獲得經(jīng)PCR檢測的轉(zhuǎn)基因青蒿植株；(5)RT-PCR測定長青蒿中sqs基因的表達(dá)；(6)對獲得的轉(zhuǎn)基因青蒿植株中青蒿素含量進(jìn)行高效液相色譜法及蒸發(fā)光散射檢測器測定，獲得青蒿素含量提高的轉(zhuǎn)基因青蒿植株。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用RNA干擾提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，所述的經(jīng)PCR檢測的轉(zhuǎn)基因青蒿植株，設(shè)計合成sqshairpin基因的引物，進(jìn)行DNA擴(kuò)增，紫外線下觀察到目的條帶的陽性植株即為轉(zhuǎn)基因青蒿植株。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用RNA干擾提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，所述的高效液相色譜法及蒸發(fā)光散射檢測器測定青蒿植株中青蒿素含量，方法為色譜柱C-18反相硅膠柱，流動相為甲醇:水，甲醇:水的體積比為70:30，柱溫3(TC，流速l.OmL/min，進(jìn)樣量10叱，蒸發(fā)光散射檢測器漂移管溫度40°C，放大系數(shù)為7，載氣壓力5bar。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用.RNA干擾提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，所述的RT-PCR測定青蒿中sqs基因表達(dá)，方法為分別設(shè)計合成sqs基因和看家基因actin的引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，用相對定量法分析基因相對表達(dá)量。全文摘要本發(fā)明是一種生物
技術(shù)領(lǐng)域：
的用RNA干擾提高青蒿中青蒿素含量的方法。本發(fā)明從青蒿中克隆鯊烯合酶SQS基因sqs片段，構(gòu)建含sqshairpin的植物表達(dá)載體，用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將sqshairpin基因轉(zhuǎn)入青蒿中獲得再生植株，PCR和RT-PCR檢測目的基因sqshairpin的整合和表達(dá)情況，高效液相色譜法及蒸發(fā)光散射檢測器測定青蒿中青蒿素的含量，篩選獲得青蒿素含量提高的轉(zhuǎn)基因青蒿植株。本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿素的含量顯著提高，最高達(dá)到非轉(zhuǎn)化對照植株的2.8倍，從而提供了一種提高青蒿中青蒿素含量的方法，為利用轉(zhuǎn)基因青蒿大規(guī)模生產(chǎn)青蒿素打下了基礎(chǔ)。文檔編號C12N15/82GK101182546SQ20071017042公開日2008年5月21日申請日期2007年11月15日優(yōu)先權(quán)日2007年11月15日發(fā)明者唐克軒,凌張,景福遠(yuǎn),王國豐申請人:上海交通大學(xué)