專利名稱：一種農桿菌侵染玉米幼胚的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種農桿菌侵染玉米幼胚的方法，屬于植物基因工程領域。
背景技術：
自上世紀90年代開始，科學家就開始轉基因玉米相關的研究。Gordon-Kamm等[Gordon-Kammet al.Plant Cell, 1990，2(7):603-618]和 Fromm 等[Fromm et al.Biotechnology (NY), 1990, 8(9): 833-839]最先報道通過基因槍轟擊法轉化玉米懸浮細胞并獲得再生植株。Grimsley 等[Grimsley et al.Nature, 1987, 325 (I): 177-179]最早嘗試通過使用根癌農桿菌作為介質將玉米條紋病毒浸染玉米。Gould等[Gould etal.Plant Physiol,1991, 95 (2):426-434]和 Shen 等[Shenet al.ProcNatlAcadSciUSA, 1993,90(4): 1488-1492]用根癌農桿菌浸染玉米莖尖并獲得少量轉基因玉米植株。相對于基因槍法，農桿菌轉化法的優(yōu)點是節(jié)省成本，外源基因多以單拷貝或低拷貝整合到植物基因組中，外源基因不易發(fā)生沉默，能穩(wěn)定遺傳表達。農桿菌介導的玉米轉化里程碑式的工作來自于 Ishida 等[Ishida et al.Nat Biotechnol, 1996，14 (6): 745-750]，他們使用超雙元載體通過農桿菌浸染玉米自交系A188幼胚，轉化效率達到5-30%，真正使通過農桿菌法獲得轉基因玉米成為可能。Zhao等[Zhao et al.Maize Genet CoopNewslett, 1998，72:34-37]使用普通雙元載體通過農桿菌轉化法浸染玉米雜交種HiII，獲得了較高的遺傳轉化效率。Frame 等[Frame et al.Plant Physiol, 2002，129 (I): 13-22]使用普通雙元載體轉化玉米HiII幼胚，其轉化效率穩(wěn)定在5%左右。但由于不同的受體材料所適用的轉化方法并不相同，上述轉化方法所采用的玉米受體材料是A188或HiII等易轉化的材料，對于我國目前所用的玉米自交系材料而言，需要有針對性的研究影響其遺傳轉化效率的因素。目前文獻報道中關于我國玉米自交系材料的侵染方法研究主要集中在調整乙酰丁香酮濃度、農桿菌濃度、培養(yǎng)基組分等，且轉化率較低，因此，提供一 種提高玉米幼胚侵染效率的方法具有重要意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種農桿菌侵染玉米幼胚的方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取如下技術方案:一種農桿菌侵染玉米幼胚的方法，在侵染過程中對玉米幼胚先進行熱激處理，再進行農桿菌侵染、共培養(yǎng)。所述熱激處理溫度為4(Γ50度，優(yōu)選為45度。所述熱激處理時間為3-7分鐘。本發(fā)明還在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加了半胱氨酸。所述半胱氨酸添加量為10(T400mg/L，優(yōu)選為300mg/L。本發(fā)明中熱激處理可以使玉米幼胚處于一種感受態(tài)的狀態(tài)，農桿菌更易于粘附于幼胚表面并進入細胞。進入幼胚細胞中的農桿菌數(shù)量的增加，相應的提高了侵染效率。但是熱激處理溫度越高，處理時間越長，幼胚生長受到的影響越大，甚至死亡，因此申請人經(jīng)大量實驗，確定熱激處理溫度范圍在40-50度，最終確定優(yōu)選溫度為45度。半胱氨酸是一種抗氧化劑，可以使玉米幼胚細胞在農桿菌侵染后不容易發(fā)生細胞程序化死亡，從而提高農桿菌侵染效率。低濃度的半胱氨酸作用有限，但高濃度半胱氨酸又會影響幼胚生長，因此申請人經(jīng)大量實驗，確定半胱氨酸濃度范圍在10(T400mg/L，最終確定優(yōu)選濃度為300mg/L。本發(fā)明提供的侵染方法通過熱激處理和添加半胱氨酸，使得玉米幼胚侵染率提高到98%，大大提高農桿菌侵染玉米幼胚的侵染效率。本發(fā)明方法簡單，操作方便，宜于推廣使用。


圖1為TO代轉化體Bar蛋白的檢測圖。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。以下實施例中使用的試劑和材料，如無特殊說明，均為市售商品。實施例1一、侵染方法優(yōu)化1、玉米受體材料準備溫室或田間種植玉米自交系綜31，取授粉后9-12天的玉米穗(幼胚約1.0-1.2mm)，去掉外苞葉，用鑷子穿在穗子頂部在70%的乙醇中滅菌I分鐘，然后放在超凈臺上吹干，從穗上剝離1_左右新鮮的幼胚`，作為受體材料，備用。2、農桿菌準備將植物表達載體pCambia3301通過凍融法轉化到農桿菌EHA105中，_70°C保存菌株。將保存菌株在含100ug/ml卡那霉素和250ug/ml塞孢霉素的YEB固體培養(yǎng)基上劃線，28 °C暗培養(yǎng)，至長出單菌落；第一天，挑取單菌落接種到5-10ml含相應抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，于200rpm、28°C振蕩培養(yǎng)8小時；再以1:100的比例將震蕩培養(yǎng)后的菌液接種到新鮮的含相應抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，于200rpm、28°C振蕩過夜；第二天,將震蕩培養(yǎng)過夜的菌液分裝到2ml離心管中，于5000rpm、離心5min ;用含200uM乙酰丁香酮的侵染培養(yǎng)基(D-1nf-AS)重懸，調整0.D.600=0.3，備用；3、農桿菌侵染條件篩選I)樣品1:將受體材料玉米幼胚放到含Iml侵染培養(yǎng)基(配方見表I)溶液的1.5ml離心管中，一個小時后用移液器吸去侵染培養(yǎng)基并加入Iml新的侵染培養(yǎng)基，顛倒混勻I分鐘，充分清洗玉米幼胚表面的胚乳，再用移液器吸去侵染培養(yǎng)基溶液，加入Iml含200 μ M乙酰丁香酮的農桿菌菌液，放置5分鐘；取出，用滅菌濾紙吸干，放到共培養(yǎng)培養(yǎng)基(配方見表2)上，在26°C黑暗條件下共培養(yǎng)3天，待處理；2)樣品2:將受體材料玉米幼胚放到含Iml侵染培養(yǎng)基(配方見表I)溶液的1.5ml離心管中，一個小時后用移液器吸去侵染培養(yǎng)基并加入Iml新的侵染培養(yǎng)基，顛倒混勻I分鐘，充分清洗玉米幼胚表面的胚乳，再用移液器吸去侵染培養(yǎng)基溶液，加入0.2ml新的侵染培養(yǎng)基溶液。將裝有玉米幼胚的離心管放置在加熱器(杭州博日科技有限公司，型號CHB-100)上用48° C熱激5分鐘；用移液器吸去侵染培養(yǎng)基溶液，加入Iml含200 μ M乙酰丁香酮的農桿菌菌液，放置5分鐘；取出，用滅菌濾紙吸干，放到共培養(yǎng)培養(yǎng)基(配方見表2)上，在26°C黑暗條件下共培養(yǎng)3天，待處理；表I侵染培養(yǎng)基配方

權利要求
1.一種農桿菌侵染玉米幼胚的方法，其特征在于，在侵染過程中對玉米幼胚先進行熱激處理，再進行農桿菌侵染、共培養(yǎng)。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述熱激處理溫度為4(Γ50度。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，所述熱激處理溫度優(yōu)選為45度。
4.根據(jù)權利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述熱激處理時間為3-7分鐘。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加半胱氨酸。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，所述半胱氨酸添加量為10(T400mg/L。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法 ，其特征在于，所述半胱氨酸濃度優(yōu)選為300mg/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種農桿菌侵染玉米幼胚的方法，在侵染過程中對玉米幼胚先進行熱激處理，再進行農桿菌侵染、共培養(yǎng)。本發(fā)明提供的侵染方法通過熱激處理和在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加半胱氨酸，使得玉米幼胚侵染率提高到98%，大大提高農桿菌侵染玉米幼胚的侵染效率。本發(fā)明方法簡單，操作方便，宜于推廣使用。
文檔編號C12N15/82GK103114106SQ20131002213
公開日2013年5月22日 申請日期2013年1月21日 優(yōu)先權日2013年1月21日
發(fā)明者劉允軍, 王國英, 劉艷 申請人:中國農業(yè)科學院作物科學研究所