一種裸鼴鼠皮層神經(jīng)元培養(yǎng)方法
【技術領域】：
[0001 ]本發(fā)明設及細胞生物學技術領域，具體設及一種細胞的分離純化及培養(yǎng)方法，特 別設及一種裸廳鼠皮層神經(jīng)元的分離純化和培養(yǎng)方法。
【背景技術】：
[0002] 神經(jīng)元雖然不是是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中比例最高的，但卻是功能最重要的一 類細胞，神經(jīng)元在突觸形成、突觸信號傳遞，W及突觸可塑性中發(fā)揮著至關重要的作用。而 大腦皮層神經(jīng)元在機體諸多功能，包括視覺、聽覺、嗅覺、語言、運動、體表感覺等方面發(fā)揮 著控制中樞的作用。
[0003] 裸廳鼠是一種變溫哺乳動物，在氧氣濃度僅有6%左右的不通風桐穴中能夠保持 腦結(jié)構(gòu)和功能的完整無損并進行正常的生命活動。裸廳鼠常年生活與地下黑暗狹窄的桐穴 中，裸廳鼠視覺功能嚴重退化，只能感受到無定形的光線信號，但無法接收清晰的圖像信 號，視覺中樞萎縮，遠不及其他視力正常的曬齒類動物（Mills SL，Catania KS(2004) Identification of retinal neurons in a regressive rodent eye(the naked mole-rat) .Vis Neurosci 21:107-117.；Nikitina N,Maughan-Brown B,民iain MO,Kidson S (2004)Postnatal development of the eye in the naked mole rat(Heterocephalus glaber).Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol 277:317-337.；Hetling JR,Baig-Silva MS,Comer CM，et al.(2005)Features of visual function in the naked mole-rat Heterocephalus glaber.J Comp Physiol ANeuroethol Sens Neural Behav Physiol 191:317-330.)。聽覺系統(tǒng)及聽力也到了一定程度的削弱。首先外耳廓在進化過程 中消失，在耳開口處只有由皮膚組成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。其次，其聲源定位能力障礙，只能辨識W 泥上為傳播介質(zhì)的化頻聲音化effner RS，Heffner HE(1993)Degenerate hearing and sound localization in naked mole-rats(Heterocephalus glaber)with an overview of central auditory struc化res .J Comp Neurol331:418-433.) D 另外其對空氣中傳播 的氣味分子的嗅覺能力嚴重受限。但是，裸I晏贏其他功能則代償性增強:其發(fā)達的終生保持 增生能力且功能強大的切牙可^從事高強度的挖掘工作;在與其身體直徑相當?shù)亩囱ㄖ校?裸黯贏主要依賴其體表數(shù)根觸須發(fā)揮的觸覺功能代償其嚴重退化的視力和聽力。這些生理 功能的變化可能主要是其腦內(nèi)對應腦區(qū)的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能出現(xiàn)適應性的變化造成的 (Catania KC,Remple MS(2002)Somatosensory cortex dominated by the representation of teeth in the naked mole-rat brain.Proc Natl Acad Sci U S A99:5692-5697.；Crish SD,Rice FL,Park TJ,Comer CM(2003)Somatosensory organization and behavior in naked mole-rats I: vibrissa-1 ike body hairs comprise a sensory array that mediates orientation to tactile stimuli.Brain Behav Evol 62:141-151.;Park TJ,Comer C,Carol A，et al.(2003)Somatosensory organization and behavior in naked mole-r過ts:II.Peripher過I structures， innervation, and selective lack of neuropeptides associated with thermoregulation and pain.J Comp Neurol 465:104-120.；Henry EC,Remple MS,0' Riain MJ,Catania KC(2006)Organization of somatosensory cortical areas in the naked mole-rat巧eterocephalus glaber).J Comp 化urol 495:434-452.)。裸廳鼠大腦 皮層功能及其機制的闡明除了需要在體功能的研究，還需要對其特定大腦皮層神經(jīng)元的研 究，運就依賴于其大腦皮層純化培養(yǎng)的神經(jīng)元。
[0004] 目前，研究人員已經(jīng)建立出大鼠及小鼠皮層神經(jīng)元的培養(yǎng)方法化in Gang,化-chen Yao,Ying-fu Liu,Yi-peng Li,Kai Yang,Lei Lu,Yuan-chi Cheng,Xu-yi Chen,and Yue Tu.Co-culture of oligodendrocytes and neurons can be used to assess drugs for axon regeneration in the central nervous system.Neural Regen Res.2015； 10 (10):1612-1616.)。
[0005] 中國專利申請CN201110164446.4,申請公布號為CN102839151A，公開了一種胎鼠 皮層神經(jīng)元的原代無血清培養(yǎng)方法，所述的培養(yǎng)基為膜島素一轉(zhuǎn)鐵蛋白一亞砸酸鋼無血清 培養(yǎng)基，其中含有0.5g/L膜島素、0.5g/L轉(zhuǎn)鐵蛋白和0.5mg/L亞砸酸鋼。
[0006] 中國專利申請CN201510072161.6,申請公布號為CN104611294A，公開了一種大鼠 視皮層神經(jīng)元體外培養(yǎng)方法，貼壁培養(yǎng)時先用接種培養(yǎng)基，1化后用維持培養(yǎng)基全換液;所 述的接種培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基中加入體積比為10%的馬血清、2 X IO5IVL的青鏈霉素 和0.5111111〇1/1的心谷氨酷氨;所述的維持培養(yǎng)基指化urobasal Medium無血清培養(yǎng)基中加入 體積比為2%的B27血清替代物和2X105U/L的青鏈霉素W及0.5臟〇1/1^化-谷氨酷氨。
[0007] 但是現(xiàn)有技術中無論小鼠還是大鼠的皮層神經(jīng)元分離純化和培養(yǎng)方法均不適用 于裸廳鼠，目前國內(nèi)外文獻尚無有關裸廳鼠皮層神經(jīng)元分離純化和培養(yǎng)方法的相關報道。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種裸廳鼠皮層神經(jīng)元的分離純化和培養(yǎng)方法，W便捷、 高效的獲得純度高、狀態(tài)好的裸廳鼠皮層神經(jīng)元，為體外建立裸廳鼠皮層神經(jīng)元提供技術 支持，同時為體外研究裸廳鼠皮層神經(jīng)元的活化、W及低氧耐受能力、W及裸廳鼠皮層神經(jīng) 元低氧耐受機制的闡述和相應治療藥物或祀分子的篩選提供強大的保障。
[0009] 我們試用了目前小鼠、大鼠的皮層神經(jīng)元分離純化和培養(yǎng)方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均無法 培養(yǎng)獲得純度高、狀態(tài)好的裸廳鼠皮層神經(jīng)元，而且裸廳鼠皮層神經(jīng)元增殖的數(shù)量也較少。
[0010] 關于裸廳鼠皮層神經(jīng)元的培養(yǎng)尚沒有建立出可行的實驗方法，我們分析其原因， 主要是：1)裸廳鼠是一種變溫動物，其體細胞離體培養(yǎng)的溫度有待摸索，并且其不恒定的機 體代謝速率導致其體細胞體外培養(yǎng)基區(qū)別于普通的大鼠或小鼠；2)裸廳鼠生存在較為陰暗 潮濕的環(huán)境中，其體細胞的培養(yǎng)對濕度有較高的要求;3)裸廳鼠已經(jīng)適應了外界低氧的環(huán) 境，所W其體細胞離體培養(yǎng)環(huán)境中的氧氣濃度區(qū)別于常氧環(huán)境中生活的動物，并且需要摸 索。4)裸廳鼠妊娠周期長達兩個月W上，而大鼠及小鼠僅需3周，因此在選擇胎鼠進行實驗 的時間需要仔細摸索。
[0011] 因此，裸廳鼠皮層神經(jīng)元的培養(yǎng)中最重要的摸索到合適的溫度、濕度和氧氣濃度， W及摸索到適合的妊娠周期和培養(yǎng)基。
[0012] 為達到此目的，本發(fā)明的裸廳鼠皮層神經(jīng)元的分離純化方法包括W下步驟：
[0013] A、收集裸廳鼠皮層混合神經(jīng)細胞：
[0014] 分離65-70天的胚胎裸廳鼠大腦皮層組織，將大腦皮層組織剪碎，加入組織消化液 混勻之后，于35-37°C消化15-30分鐘;然后用混合神經(jīng)細胞培養(yǎng)基終止消化，離屯、去除上清 之后，在混合神經(jīng)細胞培養(yǎng)基中將沉淀重懸并吹打成單細胞懸液;將單細胞懸液種于無菌 且預先包被有基質(zhì)層的24孔板中；
[0015] 所述的組織消化液，可W為常規(guī)的蛋白水解酶類消化液，例如膜蛋白酶、木瓜蛋白 酶等，輔WDNA酶IW解除DNA片段粘連所致的細胞聚集。優(yōu)選的組織消化液:含有所述組織 消化液為含有質(zhì)量濃度0.25%的膜酶和終濃度為0.08mg/ml DNA酶的混合液。
[0016] 所述的基質(zhì)層，可W為常規(guī)的左旋多聚賴氨酸、右旋多聚賴氨酸等。優(yōu)選的基質(zhì)層 為laminin。
[0017] B、裸廳鼠大腦皮層混合神經(jīng)細胞的培養(yǎng)：
[0018] 將步驟A得到的混合神經(jīng)細胞，用混合神經(jīng)細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)于=氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 6-10個小時，待其完全貼壁之后，更換為神經(jīng)元純化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2-4天，然后將培養(yǎng)基 更換為神經(jīng)元維持培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2-4天，如此為一個循環(huán)，培養(yǎng)2-4個循環(huán)。
[0019] 所述的混合神經(jīng)細胞培養(yǎng)基可W為常規(guī)含血清混合神經(jīng)細胞培養(yǎng)液，例如低糖 DMEM等。優(yōu)選為含有體積百分數(shù)為10 %胎牛血清的低糖DMEM。
[0020] 所述的神經(jīng)元純化培養(yǎng)基為含有IOiiM 5-氣尿喀晚的化robasal培養(yǎng)基并添加體 積分數(shù)為2%的B27。
[0021] 所述的神經(jīng)元維持培養(yǎng)基為含有體積百分數(shù)為2%B27的化urobasal培養(yǎng)基，同時 添加lOOng/ml NGF。
[0022] 所述的=氣培養(yǎng)箱的參數(shù)設置為:溫度控制在35±2°C，氧濃度為5%，二氧化碳濃 度為5±1%，濕度為96±2%。
[0023] 進一步，步驟A中，分離65-70天的胚胎裸廳鼠大腦皮層組織的方法如下：取懷孕 65-70天的雌性裸廳鼠，將其在C〇2中作窒息處理后立即將其浸泡于75%的乙醇中進行消 毒，然后將其置于無菌玻璃平皿中，小屯、剖腹并將其含有胎鼠的子宮完整取出，剪開子宮膜 并小屯、取出胎鼠。將胎鼠煩骨剪開，于體式顯微鏡下將左右大腦從正中線分成兩半，然后小 屯、剝離皮層，并剝除皮層表面的腦膜結(jié)構(gòu)。
[0024] 進一步，步驟A中，用顯微剪將皮層組織剪碎至Imm3,加入組織消化液混勻之后，于 37°C 消化 20min。
[0025] 進一步，步驟B中，于=氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8小時，待其完全貼壁之后，更換為神經(jīng)元 純化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2天，然后將培養(yǎng)基更換為神經(jīng)元維持培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2天，如此為一 個循環(huán)，培養(yǎng)2個循環(huán)。
[00%]進一步，所述=氣培養(yǎng)箱的參數(shù)設置為:溫度控制在35°C，氧濃度為5 %，二氧化碳 濃度為5%，濕度為96 %。
[0027] 中國專利申請201410066546.7,申請公布號為103789266A中公開了一種大腦皮層 神經(jīng)元分離和原代培養(yǎng)方法，其中細胞維持液用于大鼠皮層神經(jīng)元的培養(yǎng)。但是考慮到從 皮層中獲取的神經(jīng)細胞包括皮