本發(fā)明屬于功能性小分子制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種制備褐藻寡糖的方法。

背景技術(shù)：

褐藻膠是源自于褐藻植物的細(xì)胞壁的水溶性酸性多糖，其主要由α-l-古羅糖醛酸和β-d-甘露糖醛酸組成。在目前的研究中，褐藻膠主要用來降解制備褐藻寡糖。

海藻寡糖分子量低，水溶性強(qiáng)，穩(wěn)定性高，實(shí)驗(yàn)和臨床已經(jīng)發(fā)現(xiàn)海藻寡糖具有免疫調(diào)節(jié)、降血壓、降血脂、降血糖、抗腫瘤、抗凝血及抗病毒等多種生理活性，還可以作為糖尿病、肥胖癥、直腸結(jié)腸癌、習(xí)慣性便秘患者的療效食品。在藥物研制、功能食品開發(fā)、綠色農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。并且，褐藻寡糖具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種不同的生物學(xué)活性，且寡糖存在分子量小，容易被吸收利用的優(yōu)勢，因此在藥物制劑、功能食品、化工等多個(gè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，是一種最新一代的功能性低聚糖。

目前通過褐藻膠來制備褐藻寡糖有多種方法，例如酸法降解、超聲降解、氧化降解、酶降解法等。其中酶法降解相較于化學(xué)法制備反應(yīng)溫和、易于控制，耗能低，產(chǎn)物回收率較高以及不會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的污染等優(yōu)點(diǎn)。但是，現(xiàn)在使用褐藻膠酶降解褐藻膠制備的寡糖為二糖至五糖的混合物(p2-p5)，還需要通過凝膠柱層析分離才能獲得單一的寡糖組分(歐昌榮等，微生物發(fā)酵-膜分離法制備褐藻膠寡糖及其產(chǎn)物分析，微生物學(xué)報(bào)，45卷第2期，2005年4月)。但上述的分離方法避免不了會(huì)增加成本。因此，如何在酶解過程中控制酶解產(chǎn)物的均一性一直是褐藻膠寡糖制備領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種制備褐藻寡糖的方法，制備的褐藻寡糖主要為褐藻寡糖二糖和三糖，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。

本發(fā)明的方法，是使用具有褐藻膠降解活性的酶來降解褐藻膠，從而制備褐藻寡糖；其中使用的酶包含有：

1)氨基酸序列為seqidno:1的酶；

2)將seqidno:1所示氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，具有1)的酶活性的，由1)衍生的酶；

編碼上述酶的基因，其一種編碼核苷酸序列為seqidno:2；

本發(fā)明的方法，其一種具體的操作如下：將褐藻膠配成重量百分比濃度為1-2％的水溶液，將酶加入到褐藻膠水溶液中，在35-37℃下進(jìn)行培育反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行離心獲得上清液；將上清液進(jìn)行冷凍干燥后的褐藻寡糖。

上述的方法中，所述的離心條件是在4℃，12000rpm離心30min。

上述方法制備的褐藻寡糖通過凝膠柱層析分離獲得單一的組分。

本發(fā)明方法使用篩選獲得的蛋白酶來酶解褐藻膠，從而使反應(yīng)的副產(chǎn)物更少，有利于后續(xù)更方便的通過膠柱層析來分離單一寡糖，從而有效的提高了制備褐藻寡糖的效率，節(jié)省了成本。

附圖說明

圖1：本發(fā)明酶與ncbi編號(hào)為wp_017069952.1的海藻酸裂解酶的blstp結(jié)果圖；其中query為本發(fā)明的酶，subject為wp_017069952.1的海藻酸裂解酶；

圖2：本發(fā)明酶的基因擴(kuò)增圖；

圖3：本發(fā)明篩選的酶對褐藻膠的降解產(chǎn)物的層析電泳圖，其中1為ncbi編號(hào)為wp_017069952.1的酶的產(chǎn)物；2為本發(fā)明篩選酶的降解產(chǎn)物。

具體實(shí)施方式

目前褐藻膠寡糖的制備包括化學(xué)方法和酶解方法，其中一種操作方法是通過篩選能產(chǎn)生褐藻膠酶的微生物，然后以褐藻膠為唯一碳源誘導(dǎo)產(chǎn)生具有褐藻膠裂解活性的酶，從而降解褐藻膠來制備寡糖。申請人的單位一直從事制備醫(yī)藥領(lǐng)域使用的褐藻膠寡糖。通過從海帶中篩選具有褐藻膠降解活性的菌；再以海藻酸鈉為唯一碳源，通過馴化培養(yǎng)、初篩、復(fù)篩獲得了一株能特異性的降解褐藻膠制備寡糖的菌(實(shí)驗(yàn)室命名為pxy-1)。對產(chǎn)物進(jìn)行薄層層析后發(fā)現(xiàn)相比于已有的能夠產(chǎn)生褐藻膠酶的菌株，該篩選菌株中二糖和三糖的產(chǎn)量有顯著的增加。在對該菌進(jìn)行了全基因組測序后，對序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，獲得了一種酶蛋白，對該酶蛋白進(jìn)行重組表達(dá)，降解褐藻膠后，確定其為能特異性的降解褐藻膠，產(chǎn)物主要為褐藻膠二糖和三糖的酶。

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。

實(shí)施例1：蛋白酶的篩選及酶學(xué)性質(zhì)分析

一、通過商業(yè)測序基因公司對pxy-1菌株的通過鳥槍法進(jìn)行全基因測序，測序進(jìn)行拼接后獲得了全基因組序列。再對全基因組進(jìn)行注釋后，將序列與已公布的褐藻膠酶進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)了疑似具有褐藻膠降解功能的序列，其核苷酸序列如下(序列表中編號(hào)為seqidn0：2)：

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其翻譯過的氨基酸序列如下(序列表中編號(hào)為seqidn0：1)：

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將上述的序列與ncbi中進(jìn)行blastp比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與ncbi編號(hào)為wp_017069952.1的海藻酸裂解酶序列上最接近。但是，通過alignment比較發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所篩選的酶與ncbi編號(hào)為wp_017069952.1的海藻酸裂解酶相比，很多位點(diǎn)上存在氨基酸的差異。更重要的是，本發(fā)明的酶與海藻酸裂解酶存在大段的氨基酸序列的插入缺失差異(圖1)。

為了驗(yàn)證本發(fā)明篩選的氨基酸序列為seqidno:1的酶的功能，對該酶進(jìn)行了重組表達(dá)，并驗(yàn)證了酶學(xué)性質(zhì)及降解褐藻膠的能力。

實(shí)施例2、酶的重組表達(dá)

1)根據(jù)酶基因的序列設(shè)計(jì)上游引物和下游引物，用pcr擴(kuò)增得到基因全序列。pcr條件為：94℃預(yù)變性3min，隨后以94℃30s、55℃30s、72℃2min進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后在72℃延伸5min。以上游引物和下游引物擴(kuò)增酶編碼基因的全序列(圖1)，用t4連接酶連接擴(kuò)增的片段和表達(dá)載體pproexhta用ecorⅰ和hindⅲ酶切，用t4連接酶連接表達(dá)質(zhì)粒pgex6p-1，熱激轉(zhuǎn)入大腸桿菌bl21中。

隨機(jī)挑取單克隆菌落，測序分析獲得陽性克隆重組菌株。

2)重組酶的制備

將篩選后的的陽性重組菌株單克隆接種在含有氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，在37℃搖床培養(yǎng)12h后制成種子液。再取種子液接入含有氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)至od600值為0.5-0.6時(shí)，加入iptg進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。繼續(xù)培養(yǎng)后，4℃6000rpm離心10分鐘得到發(fā)酵粗酶液。

粗酶液硫酸銨沉淀

離心得到的發(fā)酵粗酶液進(jìn)行70％硫酸銨沉淀。冰水浴保溫，磁力攪拌的條件下均勻緩慢地向發(fā)酵粗酶液加入粉碎并干燥的硫酸銨。4℃靜置過夜后離心收集沉淀，用20mmph8.0tris-hcl緩沖液復(fù)溶沉淀，并在此緩沖液中透析。用ph8.0的20mmtris-hcl緩沖液充分平衡deaesepharoseff離子交換柱(10cmx1.2cm)，上樣吸附。然后用ph8.0的20mmtris-hcl含有nacl(0.1-0.6mofnacl)進(jìn)行梯度洗脫,收集od280出峰的平衡液及洗脫液。對收集管中的溶液進(jìn)行冷凍干燥后獲得重組酶。

實(shí)施例3、酶學(xué)性質(zhì)分析

1、酶活測定

采用紫外吸收法測定本發(fā)明篩選的酶的比活力，測定本發(fā)明的酶對褐藻酸鈉(檢測的時(shí)候用于替代褐藻膠)降解的比活力值為20-22unit/ml，能滿足生產(chǎn)的需要。

2、ph對酶活的影響

每一試管中加入3ml粗酶液和15ml濃度分別為1.5％的褐藻膠水溶液，置放于不同的ph條件下，反應(yīng)30分鐘后，加熱使酶失活，測定235nm處吸光度。結(jié)果表明酶的最適反應(yīng)ph為7.5。ph過高或過低都會(huì)對酶活性產(chǎn)生影響,使酶活降低。

3、溫度對酶活的影響

每一個(gè)試管中加入3ml粗酶液和15ml濃度分別為1.5％的褐藻膠水溶液，調(diào)節(jié)ph為7.5，置于不同溫度條件下，反應(yīng)30分鐘后，加熱使酶失活，測定235nm處吸光度。結(jié)果酶的最適應(yīng)溫度為34-37℃。初始階段著溫度的升高酶活性逐漸增高，至37℃時(shí)隨著溫度的升高酶活性開始降低。

實(shí)施例4：用重組表達(dá)的酶降解褐藻膠制備褐藻寡糖

將本發(fā)明重組表達(dá)的氨基酸序列為seqidno:1的酶來降解褐藻膠來制備褐藻寡糖，將褐藻膠(平均分子量20000)配成重量百分比濃度為1％的水溶液，按照重量比1:80的比例將酶加入到褐藻膠水溶液中作為實(shí)驗(yàn)組。同時(shí)，將編號(hào)為wp_017069952.1的酶(氨基酸序列為seqidno:3)按照實(shí)施例1中的步驟進(jìn)行重組表達(dá)，作為實(shí)驗(yàn)組；對照組和實(shí)驗(yàn)組各做三個(gè)平行試驗(yàn)。

將對照組和實(shí)驗(yàn)組在35℃下進(jìn)行培育，培育時(shí)間為12h。反應(yīng)結(jié)束后12000rpm離心5min，取上清通過薄層層析方法(tlc法)對上清液中的降解產(chǎn)物進(jìn)行分析。具體就是分別取實(shí)驗(yàn)組和對照組的上清液3μl，點(diǎn)樣于硅膠板上(silicagel60f254，merck)。吹干后將硅膠板置于展開劑中開始層析，展開劑按以下比例配置：正丁醇/甲酸/水(v/v)＝4:6:1。層析結(jié)束后，取出硅膠板并吹干，在硅膠板上噴灑顯色劑(苯胺-二苯胺顯色劑)，吹干，再將硅膠板置于高溫條件下顯色，直至出現(xiàn)明顯的斑點(diǎn)。檢測結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明，相比于編號(hào)為wp_017069952.1的酶，本發(fā)明篩選的酶對褐藻膠的降解產(chǎn)物主要是褐藻膠寡糖的二糖和三糖；經(jīng)過質(zhì)譜鑒定，降解產(chǎn)物為dp1和dp2(褐藻寡糖的二到五寡糖的分子量分別為175da、351da、527da、703da)；而wp_017069952.1酶降解的產(chǎn)物從褐藻寡糖二糖到五糖都有相應(yīng)的產(chǎn)物。

上述結(jié)果表明本發(fā)明篩選的酶能特異性的降解褐藻膠為二糖和三糖，有利于后續(xù)更方便的通過膠柱層析來分離單一寡糖。

實(shí)施例5：制備褐藻寡糖

將褐藻膠配成重量百分比濃度為1-2％的水溶液，將實(shí)施例2制備的重組酶加入到褐藻膠水溶液中，在35-37℃下進(jìn)行培育反應(yīng)；采用dns法測定反應(yīng)液中寡糖含量的變化，在酶解5h后，反應(yīng)液中寡糖含量已達(dá)到最高峰。然后通過100℃水浴使酶失活，再在4℃，12000g離心30min離心獲得上清液,tlc法測定結(jié)果表明上清液中成分為褐藻寡糖二糖和三糖的混合物。將上清液進(jìn)行冷凍干燥后獲得褐藻寡糖；計(jì)算結(jié)果表明寡糖的回收率在80％以上。

制備獲得的寡糖可進(jìn)一步采用凝膠柱層析方法分離獲得單一的二糖和三糖。

sequencelisting

<110>陳藝燕

<120>一種制備褐藻寡糖的方法

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