本發(fā)明涉及低分子量海藻多糖制備的技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種低分子量泡葉藻聚糖的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

泡葉藻(ascophyllumnodosum)，又稱巖衣藻，是一種大型的海洋褐藻,主要在北大西洋沿岸生長繁殖。和其他褐藻(比如海帶)相似。泡葉藻含有豐富的褐藻膠(alginateacid)(約占藻體所含總糖質(zhì)的79％)，是工業(yè)生產(chǎn)褐藻膠、碘和甘露醇的主要原料之一。除褐藻膠外，泡葉藻還含有約占藻體總糖質(zhì)的13％的泡葉藻聚糖(ascophyllan)和8％的巖藻聚糖(fucoidan)。在我國，泡葉藻在工業(yè)上主要被用作提取褐藻膠的原料；農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上用來制作化肥、飼料等；在食品行業(yè)中主要用來制作海藻粉。

高分子量泡葉藻聚糖分子量大(平均分子量約390kda)且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其免疫誘導(dǎo)活性與糖分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系尚不明確，與此同時(shí),大分子多糖不利于人體消化吸收。目前,國內(nèi)外用于制備低分子量海藻聚糖的技術(shù)主要采用酸、堿水解法及氧化法。這些方法雖然能夠降低海藻聚糖的分子量,但化學(xué)反應(yīng)強(qiáng)烈,其后果是改變了多糖的立體結(jié)構(gòu)，同時(shí)引起活性基團(tuán)的部分脫落,最終降低了產(chǎn)品的生物活性甚至活性完全喪失。

有鑒于此，本發(fā)明人研究和設(shè)計(jì)了一種低分子量泡葉藻聚糖的制備方法及應(yīng)用，本案由此產(chǎn)生。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種低分子量泡葉藻聚糖的制備方法及應(yīng)用，以獲得高純度且具有強(qiáng)免疫誘導(dǎo)活性的低分子量泡葉藻聚糖，用以提高其在人體消化吸收效率及免疫誘導(dǎo)活性。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案是：

一種低分子量泡葉藻聚糖的制備方法,包括以下步驟：

步驟一、泡葉藻粉的制備：

將泡葉藻洗凈、烘干后、粉碎，過60目標(biāo)準(zhǔn)篩，制得泡葉藻粉；

步驟二、泡葉藻聚糖干粉的制備：

稱量30g泡葉藻粉，按重量體積比1:30g/ml的比例加入去離子水，100℃下提取，提取過程中不斷攪拌2h，冷卻后5000×g離心20min，取上清液，加入3mhcl使之終濃度為ph1.3，離心去除褐藻酸沉淀后收集上清液，加入無水乙醇使之終濃度為體積50％，過夜離心，取沉淀物，透析凍干后，制得泡葉藻聚糖干粉；

步驟三、酶解泡葉藻聚糖：

將0.5g泡葉藻聚糖干粉溶于0.02m的ph為3-7的醋酸鹽緩沖液，纖維素酶按照3-7u/ml添加到上述溶液中混合均勻，45-65℃下水解1-20h，在100℃滅活15min，終止水解反應(yīng)，制得不同分子量片段的泡葉藻聚糖水溶液；

步驟四、分離：將制得的不同分子量片段的泡葉藻聚糖水溶液經(jīng)過分子截留量為10kda的超濾膜分離，再經(jīng)分子量截留1kda的透析袋透析凍干，再經(jīng)凝膠色譜柱分離收集多糖組分，冷凍干燥后，制得泡葉藻聚糖片段as-c。

優(yōu)選地，所述纖維素酶添加量5u/ml。

優(yōu)選地，所述纖維素酶最適ph為6。

優(yōu)選地，所述纖維素酶最適溫度為55℃。

一種低分子量泡葉藻聚糖的應(yīng)用，所述泡葉藻聚糖具有免疫誘導(dǎo)活性，可用于功能性食品與藥品原料。

由于本發(fā)明采用了上述的技術(shù)方案，即通過纖維素酶降解泡葉藻聚糖，得到的小分子片段泡葉藻聚糖片段as-c的免疫誘導(dǎo)活性較原多糖活性，在特定濃度范圍內(nèi)提高了20％，同時(shí)酶降解法反應(yīng)條件溫和，切割位點(diǎn)固定，對(duì)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)及其生物活性的破壞作用弱。

附圖說明

圖1溫度對(duì)纖維素酶降解泡葉藻聚糖的影響；

圖2酶濃度對(duì)纖維素酶降解泡葉藻聚糖的影響；

圖3ph對(duì)纖維素酶降解泡葉藻聚糖的影響；

圖4酶解片段對(duì)raw264.7細(xì)胞免疫活性誘導(dǎo)no含量測定的結(jié)果。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

本發(fā)明揭示了一種低分子量泡葉藻聚糖的制備方法,包括以下步驟：

步驟一、泡葉藻粉的制備：

將泡葉藻洗凈、烘干后、粉碎，過60目標(biāo)準(zhǔn)篩，制得泡葉藻粉；

步驟二、泡葉藻聚糖干粉的制備：

稱量30g泡葉藻粉，按重量體積比1:30g/ml的比例加入去離子水，100℃下提取，提取過程中不斷攪拌2h，冷卻后5000×g離心20min，取上清液，加入3mhcl使之終濃度為ph1.3，離心去除褐藻酸沉淀后收集上清液，加入無水乙醇使之終濃度為體積50％，過夜離心，取沉淀物，透析凍干后，制得泡葉藻聚糖干粉；

步驟三、酶解泡葉藻聚糖：

將0.5g泡葉藻聚糖干粉溶于0.02m的ph為3-7的醋酸鹽緩沖液，纖維素酶按照3-7u/ml添加到上述溶液中混合均勻，45-65℃下水解1-20h，在100℃滅活15min，終止水解反應(yīng)，制得不同分子量片段的泡葉藻聚糖水溶液；

步驟四、分離：

將制得的不同分子片段的泡葉藻聚糖水溶液經(jīng)過分子截留量為10kda的超濾膜分離，再經(jīng)分子量截留1kda的透析袋透析凍干，再經(jīng)凝膠色譜柱分離收集多糖組分，冷凍干燥后，制得泡葉藻聚糖片段as-c。

實(shí)施例2單因素酶解實(shí)驗(yàn)

2.1溫度對(duì)纖維素酶降解泡葉藻聚糖的影響

在實(shí)施例1的步驟三中，考查不同溫度45℃，50℃，55℃，60℃，65℃對(duì)纖維素酶降解泡葉藻聚糖的影響，如圖1所示，在55℃時(shí)，還原糖濃度最高，即酶解效率最高。

2.2酶濃度對(duì)纖維素酶降解泡葉藻聚糖的影響

在實(shí)施例1的步驟三中，考查不同酶濃度3u/ml，4u/ml，5u/ml，6u/ml，7u/ml對(duì)纖維素酶降解泡葉藻聚糖的影響，如圖2所示，在酶濃度5u/ml時(shí)，還原糖濃度最高，即酶解效率最高。

2.3ph對(duì)纖維素酶降解泡葉藻聚糖的影響

在實(shí)施例1的步驟三中，考查ph為3,ph為4，ph為5，ph為6，ph為7對(duì)纖維素酶降解泡葉藻聚糖的影響，如圖2所示，在ph為6時(shí)，還原糖濃度最高，即酶解效率最高。

實(shí)施例3

將實(shí)施例1步驟二制得的0.5g泡葉藻聚糖干粉分別通過纖維素酶、褐藻膠裂解酶、木聚糖酶降解得到低分子量泡葉藻聚糖片段，分別將含有所述不同分子片段的低聚泡葉藻聚糖水溶液采用小型超濾膜分離裝置進(jìn)行不同分子量低聚泡葉藻聚糖的分離，蠕動(dòng)泵以5.3l/min的流量將所述不同分子片段的低聚泡葉藻聚糖水溶液輸送到分子截留量為10kda的中空改性聚氯乙烯膜進(jìn)行分離，壓力，當(dāng)溶液體積濃縮至1/6時(shí)，停止超濾，收集分子截留量10kda以下的溶液，旋蒸濃縮至1/6時(shí)，停止?jié)饪s，并收集濃縮液，得到分子截留量為10kda以下的低聚泡葉藻聚糖組分，將該濃縮液經(jīng)(100da分子量截留透析膜)透析凍干后經(jīng)凝膠色譜柱進(jìn)行純化得到低分子量泡葉藻聚糖as-c、as-a、as-x，分別用as-c、as-a、as-x對(duì)raw264.7細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)并測定細(xì)胞產(chǎn)生no含量。

將raw264.7細(xì)胞按3×10⁴cell/well，100μl加入到96孔板，6-8h貼壁后棄上清，將as-c、as-a、as-x、as(泡葉藻聚糖)分別用細(xì)胞培養(yǎng)基配制成0～200μg/ml的濃度樣品溶液，按照100μl/孔加到上述96孔板每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)重復(fù)孔。培養(yǎng)24h后取50μl上清，加入griess試劑100μl，避光反應(yīng)20min后540nm下測其吸光度。以已知濃度的no2^-標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算培養(yǎng)上清中no2^-的含量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，as-x對(duì)raw264.7細(xì)胞幾乎沒有no誘導(dǎo)活性，其上清中no2^-濃度為9.2μm，as-a、as在200μg/ml濃度下誘導(dǎo)raw264.7細(xì)胞產(chǎn)生的no(37.5μm、40.2μm)含量明顯低于as-c(47.6μm)。進(jìn)而，篩選出as-c作為理想的免疫誘導(dǎo)活性片段

以上所述，僅為本發(fā)明較佳實(shí)施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實(shí)施的范圍，即依本發(fā)明專利范圍及說明書內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。