6. 27, 87. 13, 83. 92, 73. 88, 70. 88, 71. 08, 66. 43.32P NMR(DimethylsuLfoxide-d6, 100MHz) δ =0. 〇4(s)
[0033] 實(shí)施例2
[0034] 如圖4所示，（熒光探針GH與熒光團(tuán)HBT水溶液的紫外可見(jiàn)吸收光譜（a)、熒光激 發(fā)光譜（b)、發(fā)射光譜（c)):
[0035] 將GH溶于100mM的PB緩沖液中，配置成20 μ Μ的溶液。取3mL溶液加入 lcm X lcm X 4cm的比色皿中，測(cè)量該工作液的紫外可見(jiàn)吸收光譜（a)、GH與堿性磷酸酶作 用后產(chǎn)生的熒光團(tuán)HBT水溶液的熒光激發(fā)光譜（b)、發(fā)射光譜（c));結(jié)果顯示探針GH/HBT 的最大激發(fā)波長(zhǎng)為318nm/330nm。探針GH最大發(fā)射波長(zhǎng)為370nm，熒光團(tuán)HBT在水溶液中 隨濃度不同而有兩個(gè)發(fā)射峰460nm/512nm。
[0036] 實(shí)施例3 (GH對(duì)堿性磷酸酶的選擇性）：
[0037] 配置堿性磷酸酶，酸性磷酸酶，腺苷酸環(huán)化酶，3' -5'磷酸二酯酶（四種酶濃度均 為ΙΟμΜ)的水溶液，四種酶分別等分成若干份，每份的量相同，-20°C冷凍儲(chǔ)存。使用前在 冰上緩慢溶解，每份只用一次。配置GH(20mM)的DMS0溶液（重要的極性非質(zhì)子溶劑）。每 個(gè)反應(yīng)在196 μ L lOOmM的PB緩沖液中加2 μ L GH(20mM)以及2 μ L酶，使用全波長(zhǎng)掃描式 多功能讀數(shù)儀及96孔酶標(biāo)板進(jìn)行測(cè)量，探針和酶的終濃度分別為20 μ Μ和ΙΟΟηΜ。測(cè)量該 工作液的熒光發(fā)射光譜，λ ex = 330nm，光柵寬度為5nm，λ em = 512nm。
[0038] GH對(duì)堿性磷酸酶的選擇性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，縱坐標(biāo)表示波長(zhǎng)為512nm處的熒 光強(qiáng)度。圖5表明GH對(duì)堿性磷酸酶具有較好的選擇性，體系熒光顯著增強(qiáng)。測(cè)定條件下， 相比于堿性磷酸酶，相同濃度的腺苷酸環(huán)化酶，3' -5'磷酸二酯酶的作用可以忽略，酸性磷 酸酶的催化效率為其1/3。
[0039] 實(shí)施例4 (GH對(duì)堿性磷酸酶的定量檢測(cè)）：
[0040] 將1〇μΜ的堿性磷酸酶儲(chǔ)液濃度梯度稀釋?zhuān)總€(gè)反應(yīng)在196μ L的PB緩沖液 (100mM)中加2yL GH(20mM)以及2yL不同濃度（10ηΜ-250ηΜ)的酶。使用全波長(zhǎng)掃描式 多功能讀數(shù)儀及96孔酶標(biāo)板進(jìn)行測(cè)量。測(cè)量該工作液的熒光發(fā)射光譜，λ ex = 330nm，光 柵寬度為5nm，λ em = 512nm。結(jié)果顯示：如圖6,隨酶濃度的增長(zhǎng)，HBT的生成速率成比例 增長(zhǎng)。
[0041] 實(shí)施例5 (GH的酶學(xué)參數(shù)測(cè)定）：
[0042] 配置GH的DMS0溶液（25mM)，并配置梯度稀釋的儲(chǔ)液。每個(gè)反應(yīng)在196 μ L的PB 緩沖液（lOOmM)中加2 μ L GH(10 μ M-25mM)以及2 μ L的酶（ΙΟΟηΜ)。使用全波長(zhǎng)掃描式多 功能讀數(shù)儀及96孔酶標(biāo)板進(jìn)行測(cè)量。測(cè)量該工作液的熒光發(fā)射光譜，λ ex = 330nm，光柵 寬度為5nm，λ em = 512nm。結(jié)果顯示：如圖7,探針GH被堿性磷酸酶催化符合酶動(dòng)力學(xué)中 的雙位點(diǎn)模型，具有兩套 km/vmax 值，其中 Kml = 0. 10yM，Vmaxl = 3.48*105pmol/min/nmol ; Km2 = 85. 26 μ M, Vmax2 = 5. 33*106pmol/min/nmol 〇
[0043] 實(shí)施例6 (GH的抑制實(shí)驗(yàn)）：
[0044] 配置堿性磷酸酶特異性抑制劑L-Phenylalanine (lOOmM)的PB溶液。每個(gè)反應(yīng) 在96 μ L的PB緩沖液（lOOmM)中加2 μ L GH(20mM)以及2 μ L的酶（ΙΟΟηΜ)以及100 μ L L-Phenylalanine (lOOmM)或100 μ L緩沖液（對(duì)照）。使用全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀及96 孔酶標(biāo)板進(jìn)行測(cè)量。測(cè)量該工作液的熒光發(fā)射光譜，λ ex = 330nm，光柵寬度為5nm，λ em =512nm。結(jié)果顯示：如圖8，GH被堿性磷酸酶的催化作用可以被堿性磷酸酶抑制劑完全抑 制，再次證明GH是堿性磷酸酶的探針底物。
[0045] 實(shí)施例7 (探針GH用于HELA細(xì)胞中堿性磷酸酶的檢測(cè)）：
[0046] 如圖 9 所不，HELA 細(xì)胞按照 American type Tissue CuLture Collection 規(guī)定 進(jìn)行培養(yǎng)。接種于35mmX 12mm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h使之貼壁。使用前將培養(yǎng)液棄去， 用lOOmM PBS洗三次，加10 μ M GH的PBS溶液（PBS緩沖液濃度為lOOmM，pH 7. 4, 138mM NaCl)，5min-30min內(nèi)原位觀察。抑制實(shí)驗(yàn)，加探針前要先用10mM的levamisole (堿 性磷酸酶特異性抑制劑）的PBS溶液預(yù)孵育15min。使用共聚焦顯微鏡Olympus FV1000 (Ex. 405nm，Em. 500-530nm)鏡頭（X 40)進(jìn)行觀察以及圖像采集。對(duì)照實(shí)驗(yàn)， HT_29cells 同樣按照 American type Tissue CuLture Collection 規(guī)定進(jìn)行培養(yǎng)，加探針 原位觀察30min。結(jié)果顯示：HELA細(xì)胞中，熒光圖像亮度明顯高于對(duì)照組。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種熒光探針GH，其特征在于：所述的熒光探針的結(jié)構(gòu)為結(jié)構(gòu)I所示，結(jié)構(gòu)代號(hào)：GH。2. -種權(quán)利要求1所述的熒光探針GH的制備，其特征在于：所述的熒光探針為以2' 2 羥苯基苯并噻唑（HBT)作為熒光母體，在體內(nèi)普遍存在的小分子5'磷酸核糖鳥(niǎo)苷（簡(jiǎn)稱 GMP)上引入HBT ;具體制備步驟如下， 1) 三氯氧磷與HBT于溶劑中攪拌反應(yīng)后，真空下70°C加熱蒸干； 2) 步驟1)中得到的產(chǎn)物冷卻后，加入溶劑，攪拌后，加入2'3'-0-isopropyguanosine， 室溫下攪拌反應(yīng)IOh后，真空下70°C加熱蒸干； 3) 向步驟2)中得到的產(chǎn)物中加入蒸餾水，攪拌Ih后抽濾出固體，紅外烘干，甲醇洗滌 三次所得固體，紅外烘干； 4) 取步驟3)所得產(chǎn)物溶于醋酸和水中，冷凝回流，之后與正丁醇80°C下共沸旋干，甲 醇洗滌產(chǎn)物三次，得到最終產(chǎn)物GH。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的熒光探針的制備方法，其特征在于：步驟1)中所述的HBT與 三氯氧磷的加入量為I :3-10 ;步驟2)中2'3'-0-isopropyguanosine的加入量為第一步中 HBT加入量的1. 2-1. 5倍；步驟4)中加入的醋酸和水的量為4:1，冷凝回流的溫度為KKTC， 時(shí)間為2h。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于：所述步驟1)和步驟2)中，所用的溶 劑為無(wú)水吡啶；所述的步驟1)一4)中攪拌的方式為磁力攪拌。5. -種權(quán)利要求1所述的熒光探針的應(yīng)用，其特征在于：所述的熒光探針可以用于堿 性磷酸酶的定性或定量檢測(cè)。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的熒光探針的應(yīng)用，其特征在于：所述的熒光探針和堿性磷酸 酶的作用模型符合雙位點(diǎn)酶動(dòng)力學(xué)。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的熒光探針的應(yīng)用，其特征在于：所述的熒光探針應(yīng)用于檢測(cè) 堿性磷酸酶時(shí)，其是生成具有結(jié)構(gòu)Π 的化合物，從而導(dǎo)致熒光變化；結(jié)構(gòu)名稱：2' 2羥苯基苯并噻唑（HBT)。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的熒光探針的應(yīng)用，其特征在于：在定量檢測(cè)堿性磷酸酶中的 應(yīng)用，所述的熒光探針與堿性磷酸酶作用后，512nm處檢測(cè)得的熒光強(qiáng)度正比于堿性磷酸酶 的活性。9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的熒光探針的應(yīng)用，其特征在于：所述的熒光探針可用于細(xì)胞 內(nèi)堿性磷酸酶的檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶的熒光成像。
【專(zhuān)利摘要】一種熒光探針GH及其制備和應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種可用于選擇性檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶的熒光探針。主要合成方法為在堿性磷酸酶類(lèi)似底物小分子5’磷酸核糖鳥(niǎo)苷(簡(jiǎn)稱GMP)上引入2’2羥苯基苯并噻唑(HBT)生成結(jié)構(gòu)為的化合物；在堿性磷酸酶作用下，生成HBT，利用反應(yīng)前后熒光性質(zhì)的差異實(shí)現(xiàn)對(duì)堿性磷酸酶的選擇性檢測(cè)。
【IPC分類(lèi)】C07H19/207, G01N21/64, C09K11/06, C07H1/00, G01N33/52
【公開(kāi)號(hào)】CN105524609
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410514481
【發(fā)明人】賈燕, 韓克利, 李鵬
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
【公開(kāi)日】2016年4月27日
【申請(qǐng)日】2014年9月29日