一種次氯酸熒光比率探針及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種焚光比率探針及其應(yīng)用，尤其涉及一種基于TBET(through bond energy transfer)機(jī)理的次氯酸焚光比率探針及其應(yīng)用；屬于有機(jī)小分子焚光探針領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 次氯酸是生物體內(nèi)最重要的活性氧之一，在生物體內(nèi)是由雙氧水和氯離子 經(jīng)髓過氧化酶催化而成【A. Hammer et al, Lab. Invest.，2001，81，543】。一方面， 次氯酸作為內(nèi)源性殺菌劑在抵抗細(xì)菌入侵起著重要的作用[Z. M. Prokopowicz et al，Immunol.，2010, 184, 824];另一方面，次氯酸生成量的失控與某些疾病有關(guān)， 比如：關(guān)節(jié)炎、腎臟疾病、肺損傷、動脈硬化以及腫瘤等疾病[R.Rao et al, Front. Biosci.，2008, 13, 7210 ;D. I. Pattison et al, Biochemistry, 2006, 45, 8152]。因此發(fā)展生 物體內(nèi)次氯酸成像技術(shù)對研究其在生理活動的作用具有重要的意義。
[0003] 次氯酸熒光探針作為一種生物成像技術(shù)，因其具有高選擇、超靈敏及快速響應(yīng)等 優(yōu)點(diǎn)吸引 了科學(xué)家的更多關(guān)注[H. Zhu et al, J. Am. Chem. Soc.，2014, 136, 12820 ;Q. A. Best et al，J. Am. Chem. Soc.，2013, 135, 13365];熒光比率探針因其能夠有效消除環(huán)境、探針濃 度及激發(fā)光強(qiáng)度的干擾而備受青睞[L. Yuan et al，Acc. Chem. Res.，2013, 46, 1462]。在眾 多類熒光比率探針中，TBET機(jī)理的熒光比率探針是通過共輒鍵將能量供體熒光團(tuán)與能量受 體熒光團(tuán)連接而成。因其能量傳遞是經(jīng)過共輒鍵來完成并不需要供體發(fā)射峰與受體吸收峰 的大量重疊，所以這類探針具有較高的能量傳遞效率，較大的pseudo-Stokes位移，進(jìn)而提 高了該類探針在成像中的分辨率。
[0004] 盡管次氯酸熒光比率探針的報道很多，但是到目前為止基于TBET機(jī)理的次氯酸 熒光比率探針尚屬空白。因此開發(fā)基于TBET機(jī)理的次氯酸熒光比率探針成為目前亟待解 決的課題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種基于TBET機(jī)理的次氯酸 熒光比率探針及其應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明所述的基于TBET機(jī)理的次氯酸熒光比率探針，其特征在于所述熒光探針 由羅丹明B硫代酰肼與6-二甲氨基-2-萘甲酰基相連接，形成單硫代雙酰肼核心結(jié)構(gòu)，其 化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式（I)所示，
[0007]
[0009] 上述的基于TBET機(jī)理的次氯酸熒光比率探針的制備方法是：用已知方法合成 6_二甲氨基-2-萘甲酰氯和羅丹明B硫代酰肼，然后二者反應(yīng)得到上述次氯酸熒光比率探 針。
[0010] 上述的次氯酸熒光比率探針在檢測含次氯酸樣品中的應(yīng)用。
[0011] 其中：所述含次氯酸樣品優(yōu)選是生物細(xì)胞、含次氯酸的溶液。
[0012] 本發(fā)明所述的探針的核心結(jié)構(gòu)單硫代雙酰肼與次氯酸發(fā)生反應(yīng)生成噁二唑（見 圖1)，從而將兩個熒光團(tuán)用共輒鍵相連接，同時羅丹明B螺環(huán)打開，能量傳遞體系建立，導(dǎo) 致萘藍(lán)色熒光強(qiáng)度減弱羅丹明紅色熒光增強(qiáng)；從而達(dá)到熒光比率檢測次氯酸的效果。
[0013] 具體的：配制上述氯酸熒光比率探針的乙醇與磷酸鹽（0. 05M)緩沖液（v/v = 3 : 7，pH = 6，）的溶液，分別加入定量的活性氧或活性氮的水溶液，如：t-Bu00H，t-Bu00 ·，H2O2 ，HO ·，NO, NOOO，1O2, O2，及HOCl。然后對上述溶液進(jìn)行熒光測試，結(jié)果表明上述探針對次氯 酸有很好的選擇性，其在585nm與440nm處的熒光強(qiáng)度比值（1 585/144。）變化明顯，見圖2,3。
[0014] 在加入上述探針的RAW264. 7活細(xì)胞中，對照不加 LPS和加入LPS (LPS :細(xì)胞產(chǎn)生 次氯酸的刺激劑）的細(xì)胞染色熒光顯微成像變化?？梢钥闯鰧φ战MA細(xì)胞藍(lán)色通道熒光較 強(qiáng)，紅色通道熒光較弱；對照組B藍(lán)色通道熒光較A組減弱，紅色通道熒光較A組增強(qiáng)；其紅 色通道熒光與藍(lán)色通道熒光強(qiáng)度統(tǒng)計值的比值變化非常明顯，見圖4。
[0015] 本發(fā)明所述的熒光探針隨次氯酸濃度的增加，585nm處熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，440nm 處熒光強(qiáng)度逐漸減弱；二者比值相對次氯酸濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。所以該探針能 夠定量檢測低濃度的H0C1。見圖5。
[0016] 綜上，本發(fā)明所述的基于TBET機(jī)理的次氯酸熒光比率探針不僅可以定量檢測低 濃度次氯酸，而且能夠用于細(xì)胞內(nèi)的比率成像；所以有望在工業(yè)生產(chǎn)和臨床醫(yī)學(xué)中發(fā)揮作 用，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0017] 圖1為該次氯酸探針與次氯酸生成產(chǎn)物的高分辨質(zhì)譜。
[0018] 圖2為該次氯酸探針對各種活性氧響應(yīng)熒光發(fā)射譜圖。
[0019] 圖3為探針與各種活性氧作用時，熒光發(fā)射在585nm與440nm處的熒光強(qiáng)度比值 (Wi權(quán)）圖。
[0020] 圖4為該次氯酸探針在RAW細(xì)胞內(nèi)熒光顯微成像圖。
[0021] 其中：細(xì)胞用10 μ M該次氯酸探針溶液孵化4小時后的（a)藍(lán)色和（b)紅色通道 成像；細(xì)胞先用1 μ g mL 1LPS孵化12h后，再用10 μ M該次氯酸探針溶液孵化4小時后的 (C)藍(lán)色和（d)紅色通道成像；兩組成像中，紅色通道熒光與藍(lán)色通道熒光強(qiáng)度統(tǒng)計值的比 值對比圖（e)。
[0022] 圖5為該次氯酸探針在585nm與440nm處的熒光強(qiáng)度變化，及其比值與次氯酸濃 度間的線性關(guān)系圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 實(shí)施例1
[0024] 將6-二甲氨基-2-萘甲酰氯（0. 25mmol)和羅丹明B硫代酰肼（0. 25mmol)溶于 5ml干燥的吡啶中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，室溫攪拌2h，然后回流狀態(tài)下攪拌6小時。減壓蒸餾除 去反應(yīng)溶劑，粗產(chǎn)品經(jīng)柱層析純化得到淡黃色固體，50. 6mg，產(chǎn)率：30. 2%。
[0025] 結(jié)構(gòu)確認(rèn)譜圖數(shù)據(jù)，1H NMR(300MHz, DMS0) δ 10. 60 (s, 1H)，8. 09 (s, 1H)，8. 01 (d, J =6. 6Hz, 1H) , 7. 74 (d, J = 9. 1Hz, 1H) , 7. 68 - 7. 48 (m, 4H) , 7. 24 (dd, J = 9. I, 2. 3Hz, 1H), 7. 13 (d, J = 6. 5Hz, 1H), 6. 91 (d, J = I. 9Hz, 1H), 6. 49 (d, J = 8. 7Hz, 2H )，6. 34 (m, 4H)，3. 33 (s, 8H)，3. 03 (s, 6H)，I. 07 (t, J = 6. 9Hz, 12H) · 13C NMR (75MHz, DMSO) δ 164. 53, 153. 15, 149. 51, 148. 55, 136. 31, 135. 86, 132. 92, 129. 73, 129. 65, 128. 74, 128. 20, 125. 34, 125. 11, 124. 74, 124. 35, 123. 74, 116. 50, 107. 60, 104. 81, 103. 33, 96 .99, 63. 45, 59. 71, 43. 60, 12. 40. HRMS:m/z [M+H]+calcd for C41H44N5O2S:670. 3216, found:6 70.3261 ；m/z[M+2H]2+calcd for C41H45N5O2S:335. 6647, found:335. 6663〇
[0026] 上述熒光探針的制備及檢測次氯酸的機(jī)理如下式所示：
[0028] 實(shí)施例2
[0029] 向裝有5 μ M該次氯酸探針的IOml容量瓶中，用微量進(jìn)樣器分別加入10當(dāng)量的卜 BuOOH, t-Bu00 ·，H2O2, HO ·，NO, Ν000，1O2, O2，和 1 當(dāng)量的 HOCl。作用 Ih 后進(jìn)行熒光測試。
[0030] 結(jié)果表明，該探針只對HOCl有較好的響應(yīng)，對次氯酸比其它活性氧有較高的選擇 性。見圖2, 3。
[0031] 實(shí)施例3
[0032] 細(xì)胞內(nèi)熒光成像測試：
[0033] 將RAW264. 7細(xì)胞轉(zhuǎn)移到小的玻璃瓶中孵化24h后，一組用10 μ M該探針孵化4h， 然后用PBS洗滌三次進(jìn)行共聚焦細(xì)胞成像檢測。另一組用1 μ g mL 1的LPS孵化12h，然后用 PBS洗滌三次，再用10 μ M該探針孵化4h，接著用PBS洗滌三次進(jìn)行共聚焦細(xì)胞成像檢測。 所用激發(fā)波長為405nm，藍(lán)色通道收集波長為405-550nm，紅色通道收集波長為550-650nm。 見圖4。
[0034] 實(shí)施例4
[0035] 向裝有5μΜ該次氯酸探針的IOml容量瓶中，用微量進(jìn)樣器分別加入不同當(dāng)量的 H0C1，作用Ih后進(jìn)行熒光測試。
[0036] 結(jié)果表明，585nm處熒光強(qiáng)度與440nm處熒光強(qiáng)度的比值相對次氯酸濃度在一定 范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。見圖5。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于TBET機(jī)理的次氯酸熒光比率探針，其特征在于：所述熒光探針由羅丹明B 硫代酰肼與6-二甲氨基-2-萘甲?；噙B接，形成單硫代雙酰肼核心結(jié)構(gòu)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式 如式⑴所示，〇2. 權(quán)利要求1所述的次氯酸熒光比率探針在檢測含次氯酸樣品中的應(yīng)用。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述含次氯酸樣品是生物細(xì)胞、含次氯酸 的溶液。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于TBET機(jī)理的次氯酸熒光比率探針，所述探針是由羅丹明B硫代酰肼與6-二甲氨基-2-萘甲?；噙B接，形成單硫代雙酰肼核心結(jié)構(gòu)的有機(jī)小分子化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式(I)所示。本發(fā)明的探針可以選擇性地與次氯酸作用，隨著次氯酸濃度的增加，其熒光發(fā)射強(qiáng)度在585nm處逐漸增強(qiáng)，在440nm處逐漸減弱；二者比值(I585/I440)與次氯酸濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)的比率成像，有望在工業(yè)生產(chǎn)和臨床醫(yī)學(xué)中發(fā)揮作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【IPC分類】G01N21/64, C07D491/107, C09K11/06
【公開號】CN105017271
【申請?zhí)枴緾N201510432403
【發(fā)明人】趙寶祥, 苗俊英, 張延如, 孟寧
【申請人】山東大學(xué)
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2015年7月21日