一種甲醛熒光探針及其制備方法、應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種甲醛熒光探針其制備方法、應(yīng)用，屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，檢測具有活性羰基的物質(zhì)受到了廣泛關(guān)注，比如一氧化碳、乙二醛、甲基 乙二醛和丙烯醛等。醛類物質(zhì)是人體新陳代謝過程的產(chǎn)物，通常被認(rèn)為是對人體有毒的。 那是因?yàn)轸驶哂休^高活性，能與蛋白質(zhì)和DNA末端的氨基反應(yīng)，破壞其原有的生物活性， 已被證明醛類物質(zhì)與糖尿病、心血管病、腦梗塞、肝臟疾病和癌癥等疾病有關(guān)。甲醛作為最 簡單的醛，它不但可以通過自然活動和人類生產(chǎn)活動產(chǎn)生，也可以在生物體內(nèi)通過去甲基 化酶和氧化酶催化產(chǎn)生，比如氨基脲敏感胺氧化酶（SSA0)和賴氨酸特異性組蛋白去甲基化 酶1 (LSD1)。人體內(nèi)正常水平濃度的甲醛起著重要作用，與空間記憶和認(rèn)知能力的形成緊 密相關(guān)。然而，當(dāng)甲醛濃度高于正常水平時(shí)，會引起一些疾病的發(fā)生，例如心臟病、阿茲海默 癥、癌癥等。因此，檢測生理環(huán)境的甲醛可能對與甲醛相關(guān)的病理研究有幫助，是一項(xiàng)非常 重要和有實(shí)際意義的工作。
[0003] 熒光分析法具有特異選擇性、實(shí)時(shí)在線檢測和對生物樣品非侵入檢測等其他傳統(tǒng) 檢測方法而不具備的優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注。熒光分析法是通過熒光探針與特定目標(biāo)分析物作 用，檢測其熒光信號變化的一種檢測方法。以在檢測過程中產(chǎn)生的發(fā)射帶數(shù)量來分，熒光 探針通常分為兩類，一類是只有單發(fā)射帶的熒光增強(qiáng)型或淬滅型熒光探針，其熒光信號的 強(qiáng)度通常與探針濃度、探針?biāo)幁h(huán)境、檢測儀器等因素有關(guān)，因此其檢測的準(zhǔn)確性會受到影 響；另一類是具有雙發(fā)射帶的比率型熒光探針，可以通過檢測其比值信號來消除以上因素 所帶來的實(shí)驗(yàn)誤差，因此這類熒光探針在熒光分析法中更具有準(zhǔn)確性。而目前報(bào)道的甲醛 熒光探針都是基于第一類的增強(qiáng)型熒光探針，還沒有比率型甲醛探針被報(bào)道。所以開發(fā)具 有比值熒光信號的甲醛探針還需進(jìn)一步探索和研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對目前甲醛熒光探針檢測甲醛時(shí)所面臨的"檢測準(zhǔn)確性容易受探針濃度、探針 所處環(huán)境、檢測儀器影響"的現(xiàn)狀，本發(fā)明通過分子設(shè)計(jì)，合成出一種具有雙發(fā)射帶的比率 型甲醛熒光探針，我們將其命名為RFFP;并進(jìn)一步提供了RFFP的制備方法和應(yīng)用。
[0005] 技術(shù)方案 一種甲醛熒光探針，其分子式為：C14H15N0 ;其結(jié)構(gòu)式如下：
[0006] 本發(fā)明的甲醛熒光探針，是一種具有雙發(fā)射帶的比率型熒光探針。其激發(fā)波長為 318nm;隨甲醛濃度的升高，其在359nm處的熒光峰值逐漸降低，同時(shí)在451nm處產(chǎn)生一 個(gè)新的發(fā)射帶并且熒光峰值逐漸增強(qiáng)。其在451nm處的熒光強(qiáng)度與359nm處的熒光強(qiáng)度 比值（1451/1359)，隨甲醛濃度的升高而增強(qiáng)；當(dāng)甲醛濃度是醛熒光探針濃度的300倍時(shí)，I451/ ^359-53〇
[0007]本發(fā)明的甲醛熒光探針，隨著時(shí)間增加，451nm處的熒光強(qiáng)度與359nm處的熒光 強(qiáng)度比值（1451/1359)逐漸變大，并且在200分鐘左右達(dá)到最大值。
[0008]本發(fā)明的甲醛熒光探針，能抗乙醛、乙二醛、甲基乙二醛、苯甲醛、丙氨酸、甘氨酸、 絲氨酸、精氨酸、半胱氨酸、谷胱甘肽和葡萄糖的干擾。
[0009]所以，本發(fā)明還提供了上述甲醛熒光探針的應(yīng)用，用于檢測甲醛。包括用于檢測水 環(huán)境中的甲醛和生物樣品的甲醛。
[0010] 上述應(yīng)用，具體方法為：采用熒光光譜儀，通過甲醛熒光探針的熒光光譜變化來檢 測水環(huán)境中的甲醛；或者，采用共聚焦顯微鏡，通過觀察甲醛熒光探針的熒光成像圖的變化 來檢測生物樣品中的甲醛。所述生物樣品，可以是活細(xì)胞。
[0011] 上述應(yīng)用，采用熒光光譜儀，激發(fā)波長為318nm;隨甲醛濃度的升高，熒光光譜在 359nm處的熒光峰值逐漸降低，同時(shí)在451nm處產(chǎn)生一個(gè)新的發(fā)射帶并且熒光峰值逐漸增 強(qiáng)。
[0012] 上述應(yīng)用，采用共聚焦顯微鏡，激發(fā)光源為汞燈，分別收集藍(lán)色和綠色頻道熒光； 隨著甲醛濃度的增加，藍(lán)色頻道熒光逐漸減弱，同時(shí)綠色頻道熒光逐漸增強(qiáng)。
[0013] 上述的甲醛熒光探針的合成路線如下：
[0014] 上述甲醛熒光探針的制備方法： 將6-羥基-2-萘甲醛的甲醇溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的氨水混合，在冰浴條件下攪拌 30-60分鐘；然后加入烯丙基硼酸頻哪醇酯，撤去冰浴，在攪拌條件下反應(yīng)10小時(shí)以上；除 去溶劑，得廣品。
[0015]優(yōu)選的，除去溶劑采用的方法為減壓蒸餾。
[0016]優(yōu)選的，可以采用硅膠層析柱對產(chǎn)品進(jìn)行純化。
[0017]本發(fā)明甲醛熒光探針，檢測準(zhǔn)確性不容易受探針濃度、探針?biāo)幁h(huán)境、檢測儀器影 響，準(zhǔn)確性高；所能檢測到的甲醛的最低濃度為5. 53X10 5mmol/L，靈敏度高；抗干擾能 力強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)了在水溶液中對甲醛的高選擇性檢測；不僅能檢測水環(huán)境中的甲醛，還能檢測生 物樣品(細(xì)胞環(huán)境）中的甲醛，現(xiàn)了在活細(xì)胞水平中甲醛的熒光成像，具有潛在的實(shí)際應(yīng)用 價(jià)值。本發(fā)明的甲醛熒光探針的合成只需通過一步反應(yīng)完成：其制備方法簡單，并且產(chǎn)率較 尚。
【附圖說明】
[0018] 圖1是實(shí)施例1中探針RFFP的1HNMR圖譜； 圖2是實(shí)施例1中探針RFFP的13CNMR圖譜； 圖3是實(shí)施例2中探針RFFP隨不同量甲醛的加入，熒光譜圖的變化情況；圖中，在359 nm處的熒光峰值，從上至下，依次為在甲醛濃度為0、0.ΟΚΟ. 05、0. 10、0. 15、0. 20、0. 25、 0· 30、0· 40、0· 50、0· 60、0· 80、L00、L50、2· 00、3· 00mmol/L中探針RFFP的熒光光譜；在 451nm處的熒光峰值，從下至上，依次為在甲醛濃度為0、0. 01、0. 05、0. 10、0. 15、0. 20、 0· 25、0· 30、0· 40、0· 50、0· 60、0· 80、1· 00、1· 50、2· 00、3· 00mmol/L中探針RFFP的熒光光 譜； 圖4是實(shí)施例2中探針RFFP熒光強(qiáng)度比值（I451/1359)與不同量甲醛的線性關(guān)系圖；圖 中，從左往右，甲醛濃度依次為〇· 20、0· 25、0· 30、0· 40、0· 50、0· 60、0· 80、1· 00、1· 50、2· 00、 3.00mmol/L； 圖5是實(shí)施例3中探針RFFP與甲醛隨時(shí)間變化的點(diǎn)狀熒光數(shù)據(jù)圖； 圖6是實(shí)施例4中探針RFFP對不同干擾分析物的選擇性柱狀熒光數(shù)據(jù)圖；圖中，1，空 白；2,甲醛；3,乙醛；4,甲基乙二醛；5,乙二醛；6,苯甲醛；7,丙氨酸；8,甘氨酸；9,絲氨酸； 10,精氨酸；11，半胱氨酸；12,谷胱甘肽；13,葡萄糖；14,雙氧水； 圖7是實(shí)施例5中探針RFFP與細(xì)胞中甲醛響應(yīng)的熒光成像圖；圖中，加入10μΜ探針RFFP孵育30分鐘后的熒光成像（a-d)，隨后加入1mm〇l/L(e-h)或者3mm〇l/L(i-l)甲 醛繼續(xù)培育2小時(shí)后的熒光成像；(a，e，i)，明場成像；(b，f，j)，藍(lán)色通道熒光成像圖； (c，g，k)，綠色通道熒光成像；（d，h，k)，比值圖像(綠/藍(lán)）；標(biāo)尺為25微米。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 實(shí)施例1:化合物RFFP的合成：
將86mg6-羥基-2-萘甲醛（0.5mmol)浴觶十5mL甲醇中，在冰浴條仵卜，加入378μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的氨水（5mmol)并持續(xù)攪拌30分鐘。隨后加入101mg烯丙基硼酸頻 哪醇酯（0.6mmol)，撤去冰浴并繼續(xù)攪拌反應(yīng)過夜（10h以上）。反應(yīng)完后，將反應(yīng)液通過 減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑得到粗產(chǎn)品，并用硅膠（200-300目）層析柱，以體積比為10:1的 二氯甲烷與乙醇為洗脫劑進(jìn)行純化，得到70mg白色固體(產(chǎn)率為66%)。4NMR(400MHz, CDC13)，（p