用于檢測(cè)亞洲型寨卡病毒的熒光rt-pcr引物和熒光探針、試劑盒及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于體外核酸檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)亞洲型寨卡病毒 的巧光RT-PCR引物和巧光探針、試劑盒及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 寨卡病毒(Zika virus)是一種蚊媒病毒，于1947年首次在烏干達(dá)恒河猴中發(fā)現(xiàn)。 屬黃病毒科黃病毒屬，為單股正鏈RNA病毒，直徑40-70nm，有包膜，包含10794個(gè)核巧酸，編 碼3419個(gè)氨基酸。寨卡病毒與同為黃病毒屬的登革病毒、黃熱病毒及西尼羅病毒等存在較 強(qiáng)的血清學(xué)交叉反應(yīng)。寨卡病毒可引起一種自限性急性傳染病，稱為寨卡病毒病，臨床特征 主要為發(fā)熱、皮疹、關(guān)節(jié)痛或結(jié)膜炎，極少引起死亡。世界衛(wèi)生組織(WHO)認(rèn)為，新生兒小頭 崎形、格林-己利綜合征(吉蘭-己雷綜合征)可能與寨卡病毒感染有關(guān)。
[0003] 寨卡病毒病主要在全球熱帶及亞熱帶地區(qū)流行。1952年，在烏干達(dá)和坦桑尼亞的 人體中分離到該病毒。此后，多個(gè)國(guó)家有散發(fā)病例報(bào)道。2007年，首次在西太平洋國(guó)家密克 羅尼西亞的雅普島發(fā)生寨卡病毒疫情暴發(fā)。截至2016年1月，至少在非洲、亞洲、美洲的45個(gè) 國(guó)家有寨卡病毒傳播的證據(jù)，W己西疫情最為嚴(yán)重。根據(jù)基因型別分為非洲型和亞洲型， 2016年1月美洲流行的為亞洲型。
[0004] 我國(guó)南方部分地區(qū)存在可傳播寨卡病毒的媒介伊蚊，近年來與之傳播方式相似的 登革熱輸入性疫情持續(xù)增多，并在南方部分省份引起了較大規(guī)模的暴發(fā)疫情。隨著與相關(guān) 國(guó)家或地區(qū)人員往來的日益密切，我國(guó)存在寨卡病毒輸入風(fēng)險(xiǎn)。特別是我國(guó)南方地區(qū)夏秋 季節(jié)伊蚊密度較高，一旦有病例輸入，不排除在局部地區(qū)發(fā)生本地傳播擴(kuò)散的可能。因此， 急需建立一種快速、高效、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)W上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)亞洲型寨卡病毒的巧光RT-PCR引 物和巧光探針、試劑盒及檢測(cè)方法，可W快速、高效、定性的檢測(cè)樣本中的亞洲型寨卡病毒。
[0006] 對(duì)此，本發(fā)明的技術(shù)方案為： 一種用于檢測(cè)亞洲型寨卡病毒的巧光RT-PCR引物和巧光探針，所述用于檢測(cè)亞洲型寨 卡病毒的巧光RT-PCR引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物包括如SEQ ID NO: 1所 示的序列，所述反向引物包括如SEQ ID N0:2所示的序列，所述巧光探針為寡核巧酸探針， 所述寡核巧酸探針包括如SEQ ID NO:3所示的序列。
[0007] 正向引物:5 ' -AAAGGGAGCCTGGTGACATG-3 ' 反向引物：5 ' -CTGGGAGCCATGAACTGACA-3 ' 寡核巧酸探針：5 ' -AAGAGCATCCAGCCAGAGAATCTGG-3 '。
[000引作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述正向引物還包括SEQ ID NO: 1所示的序列的衍生 序列;所述反向引物還包括SEQ ID N0:2所示的序列的衍生序列;所述寡核巧酸探針還包括 如SEQ ID N0:3所示的序列的衍生序列；其中，所述衍生序列包括引物序列的互補(bǔ)鏈序列， 或向5'端和3'端方向延伸一至十個(gè)W內(nèi)的堿基或刪減一至十個(gè)W內(nèi)的堿基得到的序列。
[0009] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述寡核巧酸探針的3'端標(biāo)記有第一巧光澤滅基團(tuán)， 5'端標(biāo)記有第一巧光報(bào)告基團(tuán)。
[0010] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述第一巧光報(bào)告基團(tuán)為FAM、J0E、R0X、TET、TAMRA、 肥乂、￥1(：、〔￥3、〔￥5或了6義曰8 1?6(1中的至少一種；所述第一巧光澤滅基團(tuán)為8!19、了41尺八、 Eclipse、Dab巧l、Lowa Black? RQ或Lowa Black? FQ中的至少一種。
[0011] 本發(fā)明還公開了一種用于檢測(cè)亞洲型寨卡病毒的試劑盒，所述用于檢測(cè)亞洲型寨 卡病毒的試劑盒包括RT-PCR反應(yīng)液，所述RT-PCR反應(yīng)液包含如上所述的用于檢測(cè)亞洲型寨 卡病毒的巧光RT-PCR引物和巧光探針。
[0012] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述RT-PCR反應(yīng)液包括內(nèi)標(biāo)引物和內(nèi)標(biāo)探針，所述內(nèi) 標(biāo)引物包括內(nèi)標(biāo)正向引物和內(nèi)標(biāo)反向引物，所述內(nèi)標(biāo)正向引物包含如SEQ ID N0:4所示的 序列，所述內(nèi)標(biāo)反向引物包含如SEQ ID NO:5所示的序列，所述內(nèi)標(biāo)探針包含如SEQ ID NO: 6所示的序列。
[0013] 內(nèi)標(biāo)正向引物：5'-6〇：了〇：了661'(：了6了64了〇：1'(：-3'；（沈9 10備:4) 內(nèi)標(biāo)反向引物：5 ' -GAAGTGGGCACATCCATAGAGC-3 ' ；（沈Q ID NO: 5) 內(nèi)標(biāo)探針：5'-TTCTTGACACCCTGCATCCATTACCTCC-3'（SEQ ID N0:6)。
[0014] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述RT-PCR反應(yīng)液包括dATP、加 TP、dGTP、dCTP四種核 巧酸、所述用于檢測(cè)亞洲型寨卡病毒的巧光RT-PCR引物和巧光探針、內(nèi)標(biāo)引物和內(nèi)標(biāo)探針、 含有儀離子的緩沖液組成。
[0015] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述內(nèi)標(biāo)探針的5'端標(biāo)記有第二巧光報(bào)告基團(tuán)，3'端 標(biāo)記有第二巧光澤滅基團(tuán)。
[0016] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述第二巧光報(bào)告基團(tuán)為皿X;所述第二巧光澤滅基團(tuán) 為B冊(cè)1。
[0017] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述用于檢測(cè)亞洲型寨卡病毒的試劑盒還包括酶混合 液、內(nèi)標(biāo)溶液、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品。
[0018] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述酶混合液為包含有熱啟動(dòng)的Taq DNA聚合酶、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑(RNasin)的緩沖液。
[0019] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述陽性質(zhì)控品為含有插入亞洲型寨卡病毒特異型保 守序列的pU巧7載體質(zhì)粒，所述pU巧7載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌D冊(cè)α中增殖后經(jīng)提取純化用 分光光度計(jì)測(cè)定濃度和純度后用無菌ΤΕ緩沖液稀釋。
[0020] 優(yōu)選的，所述亞洲型寨卡病毒特異型保守序列為： AAAGGGAGCCTGGTGACATGCGCTAAGTTTGCATGCTCCAAGAAAATGACCGGGAAGAGCATCCAGCCAGAGA ATCTGGAGTACCGGATAATGCTGTCAGTTCATGGCTCCCAG(如沈Q ID 備：7所示）。
[0021 ] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，陽性質(zhì)控品的濃度為1.0 X 106copies/ml。
[0022] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述陰性質(zhì)控品為無菌TE緩沖液。進(jìn)一步優(yōu)選的，該所 述無菌TE緩沖液采用DEPC水配制。
[0023] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述內(nèi)標(biāo)溶液為含有插入人RNP基因特異型保守序列 RNA片段的假病毒顆粒的溶液。
[0024] 優(yōu)選的，所述人RNP基因特異型保守序列為： GAAGTGGGCACATCCATAGAGCACCCCAGGGAGGCAGAGGAGGTAATGGATGCAGGGTGTCAAGAATCGGCAG GGCCTGAGAGGATCACAGACCAGGAGGC(如沈Q ID 備:8所示）。
[0025] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述用于檢測(cè)亞洲型寨卡病毒的試劑盒保存于-20°C， 盡量減少反復(fù)凍融。
[0026] 本發(fā)明還公開了一種亞洲型寨卡病毒的檢測(cè)方法，其特征在于，包括W下步驟： 步驟S1:準(zhǔn)備檢測(cè)樣品RNA模板； 步驟S2:配制含有內(nèi)標(biāo)引物、內(nèi)標(biāo)探針、如上所述的用于檢測(cè)亞洲型寨卡病毒的巧光 RT-PCR引物和巧光探針的RT-PCR反應(yīng)體系，對(duì)步驟S1所述的檢測(cè)樣品RNA模板進(jìn)行擴(kuò)增;其 中，第一階段反應(yīng)條件為：50°C 15min，95°C 2min，