本發(fā)明屬于電化學生物傳感系統(tǒng)領域,涉及一種帶dna分子探針的石墨烯微電極電化學檢測傳感器。
背景技術:
肺癌診斷的傳統(tǒng)方法往往依賴于胸片、胸部ct、正電子放射斷層造影術(pet)、磁共振成像(mri)、痰細胞學檢查和活組織檢查等方法,這些方法對癌癥初期亞毫米大小的腫瘤的檢測分辨率都不高,且結果具有較高的假陽性。近十余年來,隨著高通量、大規(guī)?;蚣暗鞍踪|分析技術的涌現,腫瘤基因組學、蛋白質組學、代謝組學等研究方興未艾,已篩選出了許多有前景的候選標志物(profiles)。其中,一種小型非編碼rna——mirna,在人類體液中穩(wěn)定的存在,被認為是最有前景的癌癥早期診斷生物標志物。由于mirna的片段短,同源序列多,在血液中的濃度較低以及堿基序列組成的巨大差異,使得要實現無標記檢測mirna具有極大的挑戰(zhàn)性的。
因此,科學家提出了一些mirna的檢測方法來克服這些問題,其中主要選用northern雜交充當mirna早期分析的黃金標準。然而,這種方法需要大量的rna樣品和低通量分析,且不適用于大規(guī)模的使用,因此仍然受到技術上的限制。此外,定量逆轉錄實時聚合酶鏈式反應(qrt-pcr)測定法和微陣列技術已經被用于mirna的檢測。然而,這些方法要求擴增,交叉雜交,且步驟耗時長,因此容易出錯;而短序列的mirna同樣使得引物的設計難度加大,從而導致其靈敏度變差。此外,所有這些方法都非常消耗人力,并需要配置完善的實驗室和專業(yè)的、訓練有素的操作人員。除了這些傳統(tǒng)的mirna檢測方法,科學家已經開發(fā)了一些無需標記的分析方法用作mirna檢測,包括光子微環(huán)諧振器,納米孔,表面增強拉曼光譜和表面等離子體共振。和傳統(tǒng)的技術相比,這些新興的技術提高了靈敏度和選擇性,擴展了檢測(lod)極限,增加了復式檢測能力,降低了成本,并實現了小型化。然而,這些方法仍然需要對目標mirna進行化學修飾,在生理介質中不容易操作,不能進行復式檢測,而且需要昂貴的設備。這些問題嚴重地限制了它們在資源極其有限的情況下的即時診斷能力。因此,市場上急需一個平臺可以提供不需要任何放大處理就達到高靈敏度和特異性,操作流程簡單,并且能夠復式檢測多種mirna的高通量診斷模式。
技術實現要素:
有鑒于此,本發(fā)明的目的在于提供一種帶dna分子探針的石墨烯微電極電化學檢測傳感器。
為達到上述目的,本發(fā)明提供如下技術方案:
1.帶dna分子探針的石墨烯微電極電化學檢測傳感器,其特征在于,所述傳感器包括電極區(qū)域、電極和連接金線;所述電極區(qū)域由工作電極區(qū)域(9)、參比電極區(qū)域(10)和對電極區(qū)域(8)組成,工作電極區(qū)域上設有帶dna分子探針石墨烯微電極。
進一步,所述工作電極區(qū)域上并列設置四個帶dna分子探針石墨烯微電極,連接石墨烯電極連接金線(6),再通過電極夾(5)與電極轉向控制器(4)連接至工作電極(2),四個帶dna分子探針石墨烯微電極共用參比電極(1)和對電極(3),參比電極和對電極分別通過電極連接金線(11)與參比電極區(qū)域(10)和對電極區(qū)域(8)相接。
進一步,所述帶dna分子探針石墨烯微電極所帶dna分子探針序列分別如seqidno:1~seqidno:4所示。
進一步,帶dna分子探針石墨烯微電極的制備方法是:將石墨烯微電極的電極導電區(qū)進行等離子體清洗預處理,并且在dna分子探針的5’端修飾二茂鐵分子(ferrocene),采用物理吸附方式,將dna分子探針固定在石墨烯微電極上,得帶dna分子探針石墨烯微電極。
進一步,所述石墨烯微電極的制備方法為:
(1)將硅晶片切割成邊長1~1.5cm的硅片,用王水浸泡、純凈水清洗去除硅片表面污漬;
(2)在步驟(1)處理干凈的硅片表面上,采用化學氣相沉積方法生長一層600-1000納米的二氧化硅,形成二氧化硅絕緣層,再通過物理氣相沉積將金屬薄膜沉積在二氧化硅絕緣層上;
(3)用光刻技術剝離圖案化成t字形芯片基板;
(4)采用直接干法或濕法轉移3~5層石墨烯到二氧化硅絕緣層表面,石墨烯與t字形金屬薄膜下端部位接觸并覆蓋1-2mm,再在石墨烯層上沉積10納米的二氧化硅,形成鈍化層;
(5)采用圖案化剝離鈍化層,以露出邊長為0.1cm正方形墨烯作為電極導電區(qū)。
進一步,所述金屬薄膜為10nm鉻或鈦。
進一步,所述金屬薄膜為150nm金或鉑。
進一步,所述鈍化層采用氮化硅制備。
2.以上所述石墨烯微電極電化學檢測傳感器在檢測mirna中的應用。
進一步,所述mirna為:mirna-21、mirna-25、mirna-10b或/和mirna-155。
本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明的帶dna分子探針的石墨烯微電極電化學檢測傳感器,可以同時檢測四種不同mirna,達到高通量檢測目的,檢測快速方便,且具有高靈敏度、高選擇性、高準確度、無需標記等優(yōu)點。
附圖說明
為了使本發(fā)明的目的、技術方案和有益效果更加清楚,本發(fā)明提供如下附圖進行說明:
圖1是帶dna分子探針的石墨烯微電極電化學檢測傳感器示意圖;其中1為參比電極;2為工作電極;3為對電極;4為電極轉向控制器;5為電極夾;6為石墨烯電極連接金線;7為帶dna分子探針石墨烯微電極;8為對電極區(qū)域;9為工作電極區(qū)域;10為參比電極區(qū)域;11為電極連接金線;
圖2是石墨烯微電極制備方法流程圖;
圖3是帶dna分子探針的石墨烯微電極檢測mirna標記物示意圖;
圖4是本發(fā)明mirna-10b電化學檢測電化學伏安曲線峰電流曲線圖。
具體實施方式
下面將結合附圖,對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法,通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1
石墨烯微電極的制備方法:
(1)將硅晶片切割成1cm*1cm大小的硅片,采用王水浸泡、純凈水清洗去除硅片表面污漬;
(2)在步驟(1)處理干凈的硅片表面上,采用化學氣相沉積方法生長一層800納米的二氧化硅,形成二氧化硅絕緣層,再通過物理氣相沉積將一層10納米鉻或鈦金屬薄膜沉積在二氧化硅絕緣層上;
(3)用光刻技術剝離圖案化成t字形0.5cm*0.5cm芯片基板;
(4)采用直接干法轉移4層石墨烯到二氧化硅絕緣層表面,石墨烯與t字形金屬薄膜下端部位接觸并覆蓋2mm,再在石墨烯層上沉積10納米的二氧化硅,形成鈍化層;
(5)采用圖案化剝離鈍化層,以露出邊長為0.1cm正方形墨烯作為電極導電區(qū)。
實施例2
(1)將硅晶片切割成1cm*1cm大小的硅片,采用王水浸泡、純凈水清洗去除硅片表面污漬;
(2)在步驟(1)處理干凈的硅片表面上,采用化學氣相沉積方法生長一層700納米的二氧化硅,形成二氧化硅絕緣層,再通過物理氣相沉積將一層150納米金薄膜沉積在二氧化硅絕緣層上;
(3)用光刻技術剝離圖案化成t字形0.5cm*0.5cm芯片基板;
(4)采用濕法轉移3~5層石墨烯到二氧化硅絕緣層表面,石墨烯與t字形金屬薄膜下端部位接觸并覆蓋1mm,再在石墨烯層上沉積10納米的二氧化硅,形成鈍化層;
(5)采用圖案化剝離鈍化層,以露出邊長為0.1cm正方形石墨烯作為電極導電區(qū)。
以上技術方案步驟(2)中金薄膜也可采用鉑薄膜代替實現發(fā)明目的,鈍化層可以采用氮化硅制備。
圖2是石墨烯微電極制備方法流程圖。
實施例3
帶dna分子探針石墨烯微電極的制備方法:
將石墨烯微電極的電極導電區(qū)進行等離子體清洗,并且在dna分子探針的5’端修飾二茂鐵分子(ferrocene),采用物理吸附方式將dna分子探針固定在石墨烯微電極上,得到dna分子探針石墨烯微電極。將四種dna分子探針分別固定到石墨烯微電極上,dna分子探針及其檢測mirna的序列如表1所示:
表1dna分子探針序列及其檢測mirna
實施例4
帶dna分子探針的石墨烯微電極電化學檢測傳感器
如圖1所示,傳感器為實施例2制備的四個帶dna分子探針石墨烯微電極7并列置于工作電極區(qū)域9,各帶dna分子探針石墨烯微電極7各連接石墨烯電極連接金線6,再通過電極夾5與電極轉向控制器4連接至工作電極2,通過電極轉向控制器控制電極夾對四個石墨烯電極連接金線的選擇,可分別實現檢測各dna分子探針所檢測的mirna的電化學伏安曲線;四個帶dna分子探針石墨烯微電極共用參比電極1和對電極3,參比電極和對電極分別通過電極連接金線11與參比電極區(qū)域10和對電極區(qū)域8相接。
1——參比電極;2——工作電極;3——對電極;4——電極轉向控制器;5——電極夾;6——石墨烯電極連接金線;7——帶dna分子探針石墨烯微電極;8——對電極區(qū)域;9——工作電極區(qū)域;10——參比電極區(qū)域;11——電極連接金線。
實施例5
肺癌早期標記物mirna電化學伏安曲線分析及肺癌早期篩查和診斷
圖3是帶dna分子探針的石墨烯微電極檢測mirna標記物示意圖。
檢測方法:以體液(血液、血清、血漿、唾液或尿液)中的肺癌標記物mirna為研究對象,滴定在帶dna分子探針的石墨烯微電極電化學檢測傳感器的對電極區(qū)域8、工作電極區(qū)域9和參比電極區(qū)域10,保證各電極區(qū)域和待測體液充分接觸,以備電化學信號檢測;由電極轉向控制器4對四個工作電極進行依次選擇,分別獲得四個工作電極上的待測體液的電化學伏安曲線。
肺癌mirna標記物濃度標準曲線的繪制:在正常人體液中分別加入一定梯度濃度的早期肺癌mirna標記物,并對其電化學伏安曲線進行測試,進而繪制出體液中mirna濃度與電化學伏安曲線峰電流的標準曲線;按照同樣的方法,繪制4種不同的早期肺癌標記物mirna濃度與標準電化學伏安曲線峰電流曲線。
采用方波伏特安培測量法(swv),在測試范圍0.1v-0.6v,振幅0.025v,頻率25hz,靈敏度1e-5條件下,分別滴加空白緩沖液(trisbuffer:50mmtrisbuffer,150mmnacl,ph7.4indepcwater)和含500nmmirna-10b的樣品液(pbsbuffer:10mmpb,150mmnacl,ph7.4indepcwater)于實施例4所制備的電化學檢測傳感器上,檢測結果如圖4所示,在固定了dna分子探針的石墨烯微電極電化學檢測傳感器上滴上空白的緩沖液時,其電化學信號峰值僅降低4.2%(小于5%),當傳感器上滴定500nmmirna-10b時(pbsbuffer:10mmpb,150mmnacl,ph7.4indepcwater),電化學信號峰值降低了37.3%,表明一定量的肺癌標志物mirna與dna分子探針雜化并離開傳感器表面,使得電化學信號峰值的降低。
早期肺癌的篩查和診斷:以體液(血液、血清、血漿、唾液或尿液)中的肺癌標記物mirna為研究對象,滴定在帶dna分子探針的石墨烯微電極電化學檢測傳感器的對電極區(qū)域8、工作電極區(qū)域9和參比電極區(qū)域10,保證各電極區(qū)域和待測體液充分接觸,以備電化學信號檢測;由電極轉向控制器4對四個工作電極進行依次選擇,分別獲得四個工作電極上的待測體液的電化學伏安曲線;再與對應的標記物mirna建立的標準電化學伏安曲線峰電流曲線進行比對分析,獲得四種肺癌早期標記物mirna的濃度,并以此濃度為依據,結合臨床信息,對早期肺癌進行篩查和診斷。
最后說明的是,以上優(yōu)選實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制,盡管通過上述優(yōu)選實施例已經對本發(fā)明進行了詳細的描述,但本領域技術人員應當理解,可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變,而不偏離本發(fā)明權利要求書所限定的范圍。
<110>重慶石墨烯研究院有限公司,中國科學院重慶綠色智能技術研究院
<120>帶dna分子探針的石墨烯微電極電化學檢測傳感器
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