檢測長鏈非編碼rna loc284454表達(dá)量的試劑的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及檢測膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中長鏈非編碼 RNA L0C284454表達(dá)量的試劑用于制備膠質(zhì)母細(xì)胞瘤癌輔助診斷或者療效預(yù)測制劑的用 途。
【背景技術(shù)】
[0002] 人類基因組計(jì)劃及其后續(xù)的DNA元件百科全書計(jì)劃（The Encyclopedia of DNA Elements Project,ENCODE)研究成果表明，蛋白編碼基因序列僅占人類基因組序列的1-3%，而人基因組中絕大部分可轉(zhuǎn)錄的序列為長鏈非編碼RNA化ong non-coding RNA, IncRNAKLncRNA廣泛地存在于各種生物中，且隨著生物復(fù)雜程度的升高，基因組中IncRNA 序列的比例也相應(yīng)地增大，提示IncRNA在生物進(jìn)化過程中有重要意義。隨著IncRNA不斷被 發(fā)現(xiàn)，它們的功能逐漸被i全釋，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)IncRNA廣泛而活躍地參與到生命活動不同層 面的功能調(diào)控中，作為一個嶄新的領(lǐng)域，已經(jīng)成為國際生命科學(xué)研究領(lǐng)域新的前沿與熱點(diǎn)。 [000 3] LncRNA可作為功能蛋白質(zhì)的信號（signal)、誘導(dǎo)（guide)、誘巧（decoy)或支架 (scaffold)分子等多種方式，在染色質(zhì)重構(gòu)、基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及蛋白修飾等多重水平調(diào)控基 因的表達(dá)，并在包括發(fā)育、免疫、生殖等基本生理過程中扮演了不可替代的角色，更重要的 是，IncRNA的表達(dá)與功能失調(diào)已經(jīng)與包括惡性腫瘤在內(nèi)的人類多種疾病緊密聯(lián)系在了一 起。因此，深入研究IncRNA的功能，掲示由IncRNA介導(dǎo)的遺傳信息傳遞方式和表達(dá)調(diào)控網(wǎng) 絡(luò)，不僅可W從蛋白編碼基因 W外的角度重新注釋和闡明基因組的結(jié)構(gòu)與功能，深入發(fā)現(xiàn) 生命活動的本質(zhì)和規(guī)律，還有望從一個新的視角認(rèn)識包括腫瘤在內(nèi)的多種人類常見疾病的 發(fā)病機(jī)理，并為運(yùn)些疾病的診斷與治療提供新的分子標(biāo)志物與治療祀點(diǎn)。
[0004]膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是星形細(xì)胞腫瘤中惡性程度最高的膠質(zhì)瘤，因腫瘤惡性程度高，術(shù) 后易復(fù)發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后差95%未經(jīng)治療的患者生存期不超過3個月患者的預(yù)后與 多因素有關(guān)，LncRNA在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展過程中可能也起到了重要的作用。最近我 們在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)IncRNA L0C284454(NCBI accession number:NR_036515)高表達(dá) 的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者比低表達(dá)L0C284454的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后差，因此針對該IncRNA 的檢測制劑也可W用于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的預(yù)后判斷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明的目的是提供檢測膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中長鏈非編碼RNA L0C284454表達(dá)量 的試劑用于制備膠質(zhì)母細(xì)胞瘤輔助診斷或者療效預(yù)測制劑的用途。
[0006] 檢測膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中長鏈非編碼RNA L0C284454表達(dá)量的試劑的應(yīng)用，所述 的試劑用于制備膠質(zhì)母細(xì)胞瘤輔助診斷或者療效預(yù)測制劑;該長鏈非編碼RNA L0C284454 的序列如SEQ N0:1所示。
[0007] 所述的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤輔助診斷或者療效預(yù)測制劑為實(shí)時巧光定量檢測試劑。
[0008] 所述的實(shí)時巧光定量檢測試劑中包含用于實(shí)時巧光定量檢測L0C284454表達(dá)的引 物序列：
[0009] 正向引物:5 ' -CCAATGCGCCGGAATTACAG-3 '，
[0010] 反向引物：5'-41^0：446(：1'1'(：了6了0：4〔6-3'。
[0011] 所述的實(shí)時巧光定量檢現(xiàn)聯(lián)劑中包含內(nèi)參基因 GAPDH特異性PCR引物：
[0012] 正向引物5 ' -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 '
[0013] 反向引物5 ' -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 '。
[0014] 本發(fā)明從膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本中抽提RM后逆轉(zhuǎn)錄，實(shí)時巧光定量法檢測了 L0C284454的表達(dá)，結(jié)果顯示L0C284454在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中表達(dá)上調(diào)，L0C284454高表達(dá) L0C284454的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者比低表達(dá)L0C284454的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后差，提示 L0C284454可作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤預(yù)后預(yù)測的分子標(biāo)志。本發(fā)明為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的輔助診斷 和預(yù)后預(yù)測提供了強(qiáng)有力的分子生物學(xué)工具，具有深遠(yuǎn)的臨床意義和重要的推廣應(yīng)用前 景。
【附圖說明】
[0015] 圖1為L0C284454在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中表達(dá)上調(diào)情況；
[0016] 實(shí)時巧光定量PCR技術(shù)檢測IncRNA L0C284454在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(80例)和膠質(zhì)母細(xì) 胞瘤旁(6例）中的表達(dá)情況，P<0.001。
[0017] 圖2為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中L0C284454的表達(dá)與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后的關(guān)系，
[0018]膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中L0C284454的高表達(dá)與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的不良預(yù)后相關(guān)，即 L0C284454高表達(dá)的患者總的生存時間（Over-all survival)要明顯低于L0C284454低表達(dá) 或不表達(dá)的患者，L0C284454表達(dá)高的患者更容易復(fù)發(fā)。
【具體實(shí)施方式】
[0019] W下結(jié)合【具體實(shí)施方式】進(jìn)一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
[0020] 實(shí)施例1，實(shí)時巧光定量PCR法檢測證實(shí)L0C284454在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)上調(diào) [00引]1.材料與方法：
[0022] 收集6例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤旁組織和80例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織，抽提總RNA，lyg RNA經(jīng)逆 轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進(jìn)行實(shí)時巧光定量PCRdL0C284454正向引物為CCAATGCGCCGGAATTACAG，如 869^:2所示，和反向引物41^0：446(：1'1'(：了6了0：4〔6，女化69^:3所示。
[0023] 用于對照的GAPDH正向引物為5 ' -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 '如沈Q NO: 4所示，和 反向引物5'-了〇：4〇：4〔〇：了6176(：了6了4-3'，如沈0備:5所示。
[0024] 實(shí)時巧光定量PCR反應(yīng)體系 SYBIUi: Premix Ex TaqI、i ( 2x ) 1 ΟμΙ PC民 Forward Primer ( ΙΟμηι) 0.4μ1 PCR Reverse Primer (1 Ομη?) 0.4μ1
[0025] CDNA 模板 2 ΟμL 地2〇 7 2μΙ Total 20μ1
[0026] 實(shí)時巧光定量PCR反應(yīng)步驟 1 94'C 5 min 2 95'C 10 see
[0027] 3 58 °C 撕洗c 4 72 V 20 sec 3 Plab read
[002引 6 82 °C 30 sec '7 巧ate read. 8 Go lo slcp 2 for more 39 limes :9 Perfomi rtielting： curvie from 55,0"C to 9:5.0°C ? read every 0.2"C, lioM 化r Γ既c
[0029] 反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)實(shí)時巧光定量PCR的擴(kuò)增曲線和烙解曲線，各基因的表達(dá)強(qiáng)度根 據(jù)CT值（t虹eshold cycle values)、內(nèi)參基因（GAPDH)標(biāo)化后，采用group t-test檢驗(yàn)計(jì)算 P值。
[0030] 2.結(jié)果
[0031] L0C284454在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤旁對照組織中不表達(dá)或者表達(dá)很低，而在膠質(zhì)母細(xì)胞 瘤組織中高表達(dá)P<〇. 001 (圖1)
[0032] 對80例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者進(jìn)行了電話隨訪，詳細(xì)詢問了他們的首發(fā)時間、治療情 況、有無復(fù)發(fā)、有無再患其他疾病、復(fù)發(fā)及死亡時間等，并登記了生存時間和狀態(tài)，并對膠質(zhì) 母細(xì)胞瘤組織中L0C284454的表達(dá)與病人的生存時間和狀態(tài)進(jìn)行的生存分析，發(fā)現(xiàn) L0C284454高表達(dá)患者平均生存時間明顯短于L0C284454低表達(dá)或不表達(dá)的患者（圖2)。說 明L0C284454是一個與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)記，該IncRNA表達(dá)高，病人預(yù)后差。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 檢測膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中長鏈非編碼RNA L0C284454表達(dá)量的試劑的應(yīng)用，其特征 在于，所述的試劑用于制備膠質(zhì)母細(xì)胞瘤輔助診斷或者療效預(yù)測制劑；該長鏈非編碼RNA L0C284454的序列如SEQ N0:1所示。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤輔助診斷或者療效預(yù) 測制劑為實(shí)時熒光定量檢測試劑。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的實(shí)時熒光定量檢測試劑中包含用于 實(shí)時熒光定量檢測L0C284454表達(dá)的引物序列： 正向引物：5 ' -CCAATGCGCCGGAATTACAG-3 '， 反向引物：5'-ATCCCAAGCTTCTGTCCACG-3'。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的實(shí)時熒光定量檢測試劑中包含 內(nèi)參基因 GAPDH特異性PCR引物： 正向引物5 ' -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ' 反向引物5 ' -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 '。
【專利摘要】本發(fā)明公開了檢測膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中長鏈非編碼RNA？LOC284454表達(dá)量的試劑的應(yīng)用，主要是用于制備膠質(zhì)母細(xì)胞瘤輔助診斷或者療效預(yù)測的實(shí)時熒光定量檢測試劑。通過研究證實(shí)LOC284454在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中表達(dá)上調(diào)，LOC284454高表達(dá)LOC284454的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者比低表達(dá)LOC284454的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后差，因此，將LOC284454的表達(dá)用于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的預(yù)后預(yù)測，可以為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的預(yù)后提供強(qiáng)有力的分子生物學(xué)依據(jù)，具有深遠(yuǎn)的臨床意義和重要的推廣應(yīng)用前景。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105506155
【申請?zhí)枴緾N201610065196
【發(fā)明人】李桂源, 李小玲, 曾朝陽, 熊煒, 石磊, 范松青, 周鳴, 周艷宏, 李夏雨, 譚怡昕, 熊芳, 張文玲
【申請人】中南大學(xué)
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2016年1月29日