Ros1融合基因arms熒光定量pcr分型檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及一種R0S1融合基因 ARMS巧光定量PCR分型檢測試劑盒，屬于分子生物 學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。肺癌分為小細(xì)胞肺癌(S化C)和非 小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，其中NS化C包括鱗癌、腺癌、腺鱗癌、大細(xì)胞癌、類癌等，NSCLC占所有肺 癌病例的80-90 %，每年新發(fā)肺癌病例約為150萬，嚴(yán)重威脅人類健康。NSCLC的治療包括手 術(shù)、化療、放療、分子祀向治療及生物免疫治療等多種方法。手術(shù)治療是NS化C最佳治療方 法，但當(dāng)NS化C發(fā)現(xiàn)時(shí)，僅20-30 %的病例有手術(shù)指征，且術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率仍高達(dá)50 % W 上。分子祀向治療W其符合生理、低毒和理論上高效的特點(diǎn)，越來越成為非小細(xì)胞肺癌治療 的熱點(diǎn)。祀向治療為肺癌的治療增添了一個(gè)新的領(lǐng)域，也為肺癌的個(gè)體化治療帶來了新的 希望。
[0003] 未來肺腺癌的個(gè)體化治療的趨勢是先確定基因突變相關(guān)的分子分型。肺腺癌常見 的基因變異有表皮生長因子受體化GFR)、Kirsten鼠肉瘤病毒基因化-ras)、原癌基因人類 表皮生長因子受體2化ER2)、鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體Bl(BRAF)基因突變，棘皮動物 微管相關(guān)類蛋白4化ML4)與間變性淋己瘤激酶(ALK)融合基因 EML4-ALK、驅(qū)動蛋白家5B基因 化IF5B)與酪氨酸激酶受體(RET)融合基因 KIF5B-RET，EGFR突變與EML4-ALK融合并存W及 新發(fā)現(xiàn)的活性氧基團(tuán)基因 l(ROSl)的重排。不同的基因變異型患者存在不同的治療祀點(diǎn)，臨 床治療及療效亦存在明顯的個(gè)體差異性。就目前的研究而言，20 %~30 %的NS化C患者存在 R0S1的高表達(dá)，作為最新發(fā)現(xiàn)的肺癌驅(qū)動基因，對臨床實(shí)踐具有非常重要的指導(dǎo)意義。R0S1 融合基因的發(fā)現(xiàn)及其抑制劑臨床活性的證實(shí)，進(jìn)一步推動了晚期NS化C個(gè)體化治療的發(fā)展。 目前對于女性不吸煙的亞裔NS化C患者而言，通過分子標(biāo)志物檢測，94%的患者可獲知其腫 瘤驅(qū)動基因的表達(dá)。而在不遠(yuǎn)的將來，隨著運(yùn)些不同的分子標(biāo)志物檢測手段的成熟，我們必 將迎來NS化C個(gè)體化治療的全新突破。
[0004] 活性氧基團(tuán)基因1 (reactive 0巧gen species 1，R0S1)是膜島素受體家族的一種 跨膜酪氨酸激酶，與禽流感肉瘤病毒UR2的v-ros序列具有同源性，因此被命名為R0S基因， 之前也稱為c-ros-l、mcf3基因。R0S1基因位于6q22染色體，含7368bp和43外顯子，R0S1基因 由一個(gè)酪氨酸激酶區(qū)域、一個(gè)跨膜區(qū)域和一個(gè)含N端糖基化位點(diǎn)的細(xì)胞外區(qū)域組成，編碼具 有酪氨酸激酶活性的I型完整膜蛋白，其配體未知。R0S1基因發(fā)生重排時(shí)丟失細(xì)胞外區(qū)域， 保留跨膜和細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)域，重排位點(diǎn)主要發(fā)生在R0S1基因的32-36外顯子。在 NSCLC中R0S1基因主要與化C34A2XD74發(fā)生融合，CD74-R0S1融合：染色體5q32和6q22的易 位導(dǎo)致了 R0S1基因的大部分細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)被CD74替代，CD74的6號外顯子與R0S1的 34號或是32號外顯子結(jié)合形成新的CD74-R0S1融合基因，導(dǎo)致了跨膜受體CD74的N末端與 R0S1結(jié)合形成融合蛋白；SLC34A2-R0S1融合:SLC34A2-R0S1融合基因在肥口 8細(xì)胞株中首次 被發(fā)現(xiàn)，SLC34A2和R0S1的結(jié)合位點(diǎn)與CD74-R0S1相似，R0S1的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域被化C34A2替 代，并且同樣保留了 ROSl細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。目前，可能導(dǎo)致腫瘤生長的基因組學(xué) 改變包括基因突變、基因擴(kuò)增、基因易位和基因序列內(nèi)部串聯(lián)，現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的R0S1融合基因融 合類型主要有W下十種：Variantl(TPM3exon 10/R0Slexon35)、Variant 2(SDC4exon 2/ ROSlexon SSK'Variant 3(SDC4exon 4/ROSlexon 32)、Va;riant 4(SDC4exon 4/ROSl exon 34)、Variant 5(SLC34A2 exon 13/ROSl exon 32,an insertion at the position of nucleotide 568 of SLC34A2 exon 13)'Variant 6(CD74 exon 6/ROSl exon 32)、 Va;rian1:7(CD74exon 6/ROSl exon IMK'Variant 8巧ZR exon lO/ROS exon 34)'Variant 9(XRIG3 exonl7/R0Sl exon 35)、Va;riant 10(G0PC exon 7/ROSl exon 35)。注： "Variant"代表融合基因變體；"exon"代表外顯子。
[0005] 目前，ROSl融合基因的常用方法主要是巧光原位雜交（fluorescence in situ hyb;rid-ization，F(xiàn)I細(xì)）、免疫組織化學(xué)（immunohistochemist;ry,IHC)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反 應(yīng)(reverse transcript ion-polymer ise chain reaction，RT-PCR) cFISH 已獲美國食品與 藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)用于在NSCLC患者中檢測ALK重排。FI甜在檢測未知融合型方面的優(yōu) 勢是其他兩種方法所不能及的，且特異性很高，但也存在檢測成本高、檢測結(jié)果難W判讀、 主觀性強(qiáng)等劣勢。IHC的檢測成本較低，大部分醫(yī)院的病理科都可W開展。但I(xiàn)HC檢測取決于 R0S1融合蛋白的表達(dá)量和相應(yīng)抗體的特異性與敏感性，在未發(fā)現(xiàn)理想的抗體之前，IHC檢測 的準(zhǔn)確性和重復(fù)性尚難保證。RT-PCR具有可W明確融合型、所需組織量極少等優(yōu)點(diǎn)，但不能 檢測新的未知的融合型，在當(dāng)前R0S1的融合型并未全部掲曉之前，使用其篩查R0S1融合可 能遺漏未知的融合型，而且其對組織中RNA的質(zhì)量有較高要求，若組織中的RNA降解嚴(yán)重，貝U 可能影響最終的檢測結(jié)果。
[0006] 擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)（Amplification Refractory Mutation System,ARMS)也稱為 等位基因特異性擴(kuò)增法（A1 lele-specif ic amplif ication , ASA)或等位基因特性PCR (allele-specific PCR，ASPCR)，于1989年建立，是PCR技術(shù)應(yīng)用的發(fā)展，用于對已知突變基 因進(jìn)行檢測。ARMS的基本原理是PCR擴(kuò)增時(shí)引物是否能延伸主要取決于引物y端的1~2個(gè) 堿基是否與模板配對，如果不配對則引物不能延伸，故只要能設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)囊铮涂蒞區(qū)別 正常和突變的DNA序列。該法首先設(shè)計(jì)兩個(gè)5/端引物，一個(gè)與正常DNA互補(bǔ)，一個(gè)與突變DNA 互補(bǔ)，對于純合性突變，分別加入運(yùn)兩種引物及y端引物進(jìn)行兩個(gè)平行PCR，只有與突變DNA 完全互補(bǔ)的引物才可延伸并得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。如果錯配位于引物的y端則導(dǎo)致PCR不能延 伸，則稱為ARMS。即在PCR擴(kuò)增時(shí)，引物的延伸是從其3'未端開始的，而運(yùn)種延伸的進(jìn)行要求 引物3'端的堿基與模板需完全配對，只有運(yùn)樣引物才能延伸，擴(kuò)增才得W進(jìn)行下去而得到 預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物，若引物3'端與模板不能配對，則引物的延伸即阻斷，不能得到相對應(yīng)的擴(kuò) 增產(chǎn)物。ARMS借鑒多重PCR原理，可在同一系統(tǒng)中同時(shí)檢測兩種或多種等位基因突變位點(diǎn)。 利用該系統(tǒng)進(jìn)行基因突變檢測時(shí)不僅能檢出突變的純合子，而且能檢出雜合子個(gè)體，在運(yùn) 種情況下，同一個(gè)體的DNA模板利用突變引物和正常引物均能引發(fā)擴(kuò)增反應(yīng)，利用多對突變 引物和正常引物進(jìn)行多重3'特異PCR，可使DNA分子上的多位點(diǎn)突變的鑒定準(zhǔn)確，快速，簡 便。
[0007] 實(shí)時(shí)巧光定量PCR技術(shù)（real-time fluorescent quanti1:ative PCR，F(xiàn)Q-PCR)于 1996年由美國Applied Biosystems公司推出，它是一種在PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對引物的同 時(shí)加入一個(gè)特異性的巧光探針，該探針為一寡核巧酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告巧光基團(tuán)和 一個(gè)澤滅巧光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的巧光信號被澤滅基團(tuán)吸收；剛開始時(shí)，探 針結(jié)合在DNA任一一條單鏈上;PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5 '端一3 '端外切酶活性將探針酶切降 解，使報(bào)告巧光基團(tuán)和澤滅巧光基團(tuán)分離，從而巧光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到巧光信號，即每擴(kuò)增 一條DNA鏈，就有一個(gè)巧光分子形成，實(shí)現(xiàn)了巧光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。該技 術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對DNA模板的定量，而且具有靈敏度高、特異性和可靠性更強(qiáng)、能實(shí)現(xiàn)多重反 應(yīng)、自動化程度高、無污染性、具實(shí)時(shí)性和準(zhǔn)確性等特點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研 究和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。
[0008] RT-ARMS-qPCR(real time-amplification refractory mutation system-quantitative PCR)技術(shù)基于實(shí)時(shí)PCR平臺，結(jié)合ARMS突變富集和qPCR特異性巧光檢測兩種 技術(shù)對微量突變進(jìn)行檢測。利用ARMS引物對突變祀序列進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，Taqman探針對 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行特異性微點(diǎn)檢測，在實(shí)時(shí)PCR基礎(chǔ)上鑒定特定突變。由于采用RT-ARMS-qPCR技 術(shù)對微量突變進(jìn)行檢測時(shí)，對于所使用的引物和探針的特異性和擴(kuò)增效率要求很高，因此， 大大提高了引物和探針的設(shè)計(jì)難度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種R0S1融合基因 ARMS巧光定量PCR分 型檢測試劑盒。
[0010] 本發(fā)明的另一目的是提供一種基于RT-ARMS-qPCR檢測R0S1融合基因變體的方法。
[0011] 本發(fā)明中，所述R0S1融合基因變體主要包括：Variant UTPM3 exon 10/R0S1 exon 35)'Variant 2(SDC4 exon 2/ROSl exon 32)'Variant 3(SDC4 exon 4/ROSl exon 32)'Variant 4(SDC4exon 4/ROSl exon 34)'Variant 5(化C34A2 exon 13/ROSl exon 32,an insertion at the position of nucleotide 568 of SLC34A2 exon 13)、Variant 6(CD74 exon 6/ROSl exon 32)'"Variant 7(CD74ex