一類氟化硼絡(luò)合二吡咯甲川熒光染料、其制法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及精細(xì)化工領(lǐng)域一類熒光染料、其制法和用途，尤其涉及一類氟化硼絡(luò) 合二吡咯甲川熒光染料，制備方法及其在活細(xì)胞染色方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 熒光探針作為功能性染料在科學(xué)技術(shù)的各個領(lǐng)域取得了廣泛應(yīng)用，尤其在生命科 學(xué)、臨床醫(yī)療診斷、免疫分析檢測等方面的研究成為熱點(diǎn)。在眾多熒光染料中，氟化硼絡(luò)合 二吡咯甲川(B0DIPY)熒光染料具有摩爾消光系數(shù)較高、熒光量子產(chǎn)率高、光譜性質(zhì)穩(wěn)定、光 熱及化學(xué)穩(wěn)定性好、分子量小和細(xì)胞毒性較低等優(yōu)點(diǎn)，作為生物分子熒光探針和成像熒光 試劑等已被廣泛應(yīng)用。
[0003] 極性被認(rèn)為是一個非常重要的環(huán)境參數(shù)，在生物體中，它可反映出很多生物過程 的活性，如蛋白質(zhì)相互作用、信號的傳導(dǎo)和細(xì)胞膜的通透性等。極性敏感型熒光染料的出現(xiàn) 為生物體系中極性的檢測提供了一種新方法。通常，此類染料都包含一個基于ICT機(jī)理的環(huán) 境敏感型熒光團(tuán)（如香豆素）。當(dāng)周圍極性增大時，染料的發(fā)射峰波長發(fā)生紅移或/和熒光強(qiáng) 度降低（"on-off"）。然而，眾所周知，細(xì)胞內(nèi)大部分的物質(zhì)都是水，也就是說，細(xì)胞內(nèi)的微環(huán) 境是親水性的。因此，能夠在親水環(huán)境中發(fā)出強(qiáng)熒光的"off-on"型極性探針更具細(xì)胞成像 的應(yīng)用價值。在已報道工作中，雖然有少數(shù)幾例基于分子間氫鍵調(diào)控的極性探針具有此性 質(zhì)，但是它們的熒光性質(zhì)與溶劑的氫鍵供給能力相關(guān)而不是溶劑極性。此外，大部分的極性 探針都沒能被用于生物成像研究，具有亞細(xì)胞器(包括線粒體、細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體） 定位功能的極性探針更是少數(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供一類氟化硼絡(luò)合二吡咯甲川熒光染料，其熒光具有明顯的溶劑化效 應(yīng)，在極性環(huán)境中熒光強(qiáng)，而在非極性環(huán)境中熒光弱，并且可用于活細(xì)胞亞細(xì)胞器定位成像 和微環(huán)境極性檢測。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0006] -類氟化硼絡(luò)合二吡咯甲川(B0DIPY)熒光染料，具有如下結(jié)構(gòu)通式I:
[0008] 通式I中：
[0009] Ri和R3各自獨(dú)立地選自Η、&-8的烷基、取代或未取代苯基，
[0010] 所述取代苯基由以下一種或多種基團(tuán)任意取代: Cl-6烷基氨基、Cl-6酰胺基、鹵素或Cl-6鹵代烷基；
[0011] R2選自H、甲基、乙基、氰基、醛基、羰基、酯基、羧基或鹵素；
[0012] r4和抱各自獨(dú)立地選自d-8的烷基；
[0013] X是氯、溴或碘；
[0014] η選自1-8的整數(shù)。
[0015] 本發(fā)明另一方面提供上述氟化硼絡(luò)合二吡咯甲川熒光染料的制備方法：
[0016] (1)當(dāng)η = 1或4-8中任意整數(shù)時所述方法包括如下步驟：
[0018] ①式II的化合物與式III的化合物在10-120°C條件下按照摩爾比0.1-1000:1反 應(yīng)，產(chǎn)物與三氟化硼在-10°C-100°C及有機(jī)堿存在條件下反應(yīng)制備式IV的化合物；
[0019] 其中，所述的X'選自氯或溴；
[0020] ②式IV的化合物與仲胺R4-NH-R4在20-150°C條件下按摩爾比1:0.1-1000反應(yīng)制備 式V的化合物；
[0021] ③式V的化合物與鹵代烴R5X在o-ioo°c條件下按照摩爾比1:0.1-1000反應(yīng)制備式 I的化合物；
[0022] (2)當(dāng)η = 2時，所述方法包括如下步驟：
[0024] ①式VI的化合物與仲胺R4-NH-R4按照摩爾比1:〇.1_1〇〇〇溶于二鹵代甲烷〇12父"2， 然后于10-100°c條件下反應(yīng)制備式VII的化合物，
[0025] 其中，所述的X"選自氟、氯、溴或碘；
[0026] ②式VII的化合物與鹵代烴R5X在o-ioo°c條件下按照摩爾比1:0.1-1000反應(yīng)制備 式I的化合物；
[0027] (2)當(dāng)η = 3時，所述方法包括如下步驟：
[0029] ①式II的化合物與4-溴丁酰氯在10-120°C條件下按摩爾比0.1-1000:1反應(yīng)，所得 產(chǎn)物與三氟化硼在有機(jī)堿存在條件下，于-10°C-100°C反應(yīng)制備式VIII的化合物；
[0030] ②式VIII的化合物與三溴化磷在10-100°c條件下按摩爾比1:0.1-1000反應(yīng)制備 式IX的化合物；
[0031] @式以的化合物與仲胺1?4-見1-1?4中20-150°(3條件下按照摩爾比1:0.1-1000反應(yīng)制 備式X的化合物；
[0032] ④式X的化合物與鹵代烴R5X在o-ioo°c條件下按照摩爾比1:0.1-1000反應(yīng)制備產(chǎn) 物I。
[0033] 本發(fā)明所述氟化硼絡(luò)合二吡咯甲川熒光探針具有以下顯著的特征：
[0034] ①在非極性溶劑中熒光弱，在極性溶劑(包括水）中熒光強(qiáng)；
[0035] ②熒光強(qiáng)度和熒光量子產(chǎn)率與溶劑極性呈現(xiàn)良好線性關(guān)系；
[0036] ③選擇性好，對其他生物相關(guān)物種和微環(huán)境參數(shù)，如陰陽離子、活性氧、氨基酸、核 酸、蛋白質(zhì)、黏度和pH，均無響應(yīng)；
[0037] ④生物相容性好，可用于活細(xì)胞特異細(xì)胞器定位染色；
[0038]⑤合成簡便，產(chǎn)品易得。
[0039] 鑒于本發(fā)明熒光染料的上述特征，尤其對環(huán)境極性敏感的熒光性質(zhì)，本發(fā)明進(jìn)一 步提供其在制備活細(xì)胞熒光染料、尤其是活細(xì)胞亞細(xì)胞器定位染色染料中的應(yīng)用。
【附圖說明】
[0040] 本發(fā)明附圖9幅。
[0041] 圖1是實(shí)施例4中熒光染料化合物BP-2在各種不同極性的溶劑中的吸收光譜。染料 BP-2的濃度為5μΜ。
[0042] 圖2是實(shí)施例4中熒光染料化合物BP-2在各種不同極性的溶劑中的熒光光譜。染料 BP-2的濃度為5μΜ，激發(fā)波長是480nm〇
[0043] 圖3是實(shí)施例4中染料化合物BP-2的熒光強(qiáng)度（圖3a)和熒光量子產(chǎn)率（圖3b)隨溶 液極性的變化。染料BP-2的濃度為5μΜ，激發(fā)波長是480nm。
[0044]圖4是實(shí)施例5中染料化合物BP-2在不同體積配比的乙醇和甘油的混合溶液中的 熒光光譜（圖4a)和熒光強(qiáng)度（圖4b)。染料BP-2的濃度為5μΜ，激發(fā)波長是480nm。
[0045] 圖5是實(shí)施例6中染料化合物BP-2在pH值條件下的熒光光譜（圖5a)和熒光強(qiáng)度(圖 5b)。測試體系為PBS( 20mM)緩沖液，染料BP-2的濃度為5μΜ，激發(fā)波長是480nm。
[0046] 圖6是實(shí)施例7中染料化合物BP-2對各種生物相關(guān)物種的熒光響應(yīng)圖。測試體系為 PBS (20mM，pH 7.4)緩沖液，染料BP-2濃度為5μΜ，Ca2+、Mg2+、K+和Na+濃度為ImM，其他離子濃 度為50μΜ，氨基酸濃度為100μΜ，活性氧濃度為ΙΟμΜ，核酸濃度為20yg/mL，蛋白質(zhì)濃度為 100mg/L，激發(fā)波長為480nm〇
[0047] 圖7是實(shí)施例8中染料化合物BP-2染色Raw 264.7巨噬細(xì)胞的熒光圖片。染料BP-2 的濃度為5μΜ，激發(fā)波長是488nm，熒光采集波段是490nm-550nm〇
[0048] 圖8是實(shí)施例8中染料化合物8?-2在活細(xì)胞和1^(2〇11^，？!17.4)緩沖液中的熒光 光譜。染料BP-2的濃度為5μΜ，激發(fā)波長分別為488nm(活細(xì)胞)和480nm(PBS緩沖液）。
[0049]圖9是實(shí)施例9中染料化合物BP-2和商業(yè)化細(xì)胞器熒光染料在Raw 264.7巨噬細(xì)胞 中疊加染色的焚光圖片：a)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染色：ER-Tracker Red;b)線粒體染色:MitoTracker Deep Red;c)溶酶體染色:LysoTracker Red;d_f)BP_2染色;g_i)為a)與d)、b)與e)、c)與f) 的合并圖。BP_2、ER_Tracker RecUMitoTracker Deep Red和LysoTracker Red的濃度分別 為5μΜ、1μΜ、500ηΜ和100nM，激發(fā)波長分別為488nm、559nm、635nm和559nm，熒光收集通道分 別是490-550nm、570-650nm、655-755nm 和 570-650nm〇
【具體實(shí)施方式】
[0050]本發(fā)明提供一類具有結(jié)構(gòu)通式I的氟化硼絡(luò)合二吡咯甲川熒光染料。
[0052] 通式I中：
[0053]辦和此各自獨(dú)立地選自Η、&-8的烷基、取代或未取代苯基，
[0054] 所述取代苯基由以下一種或多種基團(tuán)任意取代: Cl-6烷基氨基、Cl-6酰胺基、鹵素或Cl-6鹵代烷基；
[0055] R2選自H、甲基、乙基、氰基、醛基、羰基、酯基、羧基或鹵素；
[0056] R4和R5各自獨(dú)立地選自&―8的烷基；
[0057] X是氯、溴或碘；
[0058] η選自1-8的整數(shù)。
[0059]【具體實(shí)施方式】之一，所述的辦選自!1或&-8的烷基，優(yōu)選Ci-8的烷基